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방법 논문

ADSC 매 이식은 확장 식도 내시경 점막하 절개 후 협착을 방지하는

8.3K 조회수

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DOI:

10.3791/55018

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2017년 2월 10일

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1Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Université Paris Descartes Sorbonne Paris Cité, 2Department of Gastroenterology, Hôpital Européen Georges Pompidou, 3UMR-S970, Université Paris Descartes Sorbonne Paris Cité, 4Department of Pathology, Hôpital Européen Georges Pompidou, 5Department of Radiology, Hôpital Européen Georges Pompidou

이 논문에서

요약

이 연구는 내시경 지방 조직 유래 기질 세포 (ADSC)의 성공적인 방법을보고하는 돼지 모델의 확장 내시경 점막하 절제술 (ESD) 후 식도 협착 방지를위한 - 시트 이식.

초록

지난 몇 년 동안, 세포 시트의 구조는 특히 재건 수술 절차, 재생 의학에서 폭 넓은 관심을 촉발하고있다. 다양한 생체 물질과 지방 조직 유래 기질 세포 (ADSCs)를 조합 한 다양한 기술의 개발은 뼈, 연골, 그리고 쥐, 돼지, 인간 ADSCs에서 지방 조직과 같은 조직 공학적 대체, 수많은 종류의 건설을 주도하고있다. 확장 식도 내시경 점막하 절제술 (ESD)은 식도 협착 형성 할 책임이있다. 협착 방지를 사용할 수없는 효율적인 치료와 함께 도전 남아있다. 이전의 연구는 송곳니 모델과 인간 점막 세포 시트를 이식 효과를보고 하였다. ADSCs는 중간 엽과 비 중간 엽 계통에 항 염증, 지방의 면역 변조 효과, 혈관 신생 유도 및 분화 능력을 기인한다. 이 원래의 연구는 내시경 TRA 설명ADSC의 조직 공학적 구조의 nsplantation은 돼지 모델에서 식도 협착을 방지합니다. ADSC 구조는 종이지지 막 서로에 계층이 동종 ADSC 시트로 구성되었다. ADSCs는 프로브 기반 공 초점 레이저 endomicroscopy (pCLE) 모니터링을 허용하는 PKH67의 형광으로 표지 하였다. 이식 당일 5 cm 식도 협착을 유발하는 것으로 알려져 헤미 둘레 ESD 수행 하였다. 동물은 즉시 내시경 4 ADSC 구조로 이식되었다. ADSC 구조의 완전한 접착 부드러운 적용 10 분 후에 얻어졌다. 동물은 모든 동물이 성공적으로 이식 날 (28)에 희생되었다. 이식은 양의 pCLE 평가와 함께 3 일에 확인되었다. 이식 된 동물에 비해 대조군의 주요 섬유 성 조직 개발 빈번한 소화 문제, 및 감소 된 체중 증가와 심한 협착을 개발 하였다. allogeni 우리의 모델에서, 이식C 이중 세포 시트로 구성 ADSCs는 확장 된 ESD 후 성공적으로 강하게 하부 식도 협착 속도와 관련된했다.

서론

피상적 식도 종양 관리 새로운 내시경 기술의 발달로 변경되었다. 요즘, 내시경 절제술은 제 치료제이다. 사실상, 종양은 동일한 결과 1, 2, 3과 수술보다 낮은 이환율 및 사망률과 연관된다. 내시경 점막 절제술 (EMR) 및 내시경 적 점막하 절제술 (ESD)는 가장 널리 사용되는 기술이다. 확장 된 표면 종양의 경우, ESD가 바람직하다. EMR에 비해 ESD 관계없이 병변의 크기, 일괄 resectioning 욕실 수, 4, 5, 6을 형성. ESD의 주요 지연 합병증은 일반적으로 절제 후 1 2 주 사이에 발생하는 식도 협착 형성된다. 최근 발표 된 연구는 협착 형성이 상관된다 보여절제의 크기입니다. 일본 내시경 학회 ESD들이 사건의 90 % 이상에 협착 개발과 관련된 심각한 공급 문제와 삶의 질에 큰 저하에 대한 책임 때문에 식도 주위의 ¾보다 큰 크기를 피하는 것이 좋습니다.

식도 협착의 예방 도전 남아 있습니다. 협착 형성에 관여하는 메커니즘은 부분적으로 만 알려져있다. (1) 염증성 세포 모집 및 (2) 과도한 섬유화 개발 7 : 형성을 협착은 두 개의 서로 다른 메커니즘의 관계에서 발생할 것으로 보인다. 몇 가지 예방 치료가 제안되었다. 그러나, 결과는 약간의 이익과 심각한 부작용이 8, 9, 불만족했다. 최근, 일본 팀, Ohki 등. 상기 esoph로자가 구강 점막 세포의 단층 세포 시트를 이식하는 것이 제안ageal 흉터. 이식 ESD (10), (11) 직후에 수행 하였다. 그들은 제 개과 모델 후 환자에서이 혁신적인 접근법의 효과를 입증 하였다.

지방 조직 유래 기질 세포 (ADSCs)는 재생 의학에 약속되어있다. 여러 분야에서의 응용 프로그램은 특히 상처 치유 과정에서 흥미로운 결과를 보여 주었다. 세포가 쉽게 분리되어 및 간엽 아닌 중간 엽 계통 (12, 13), (14)에 항염 로컬 면역 조절 효과, 혈관 신생을 유도하고, 분화 능력과 연관되기 때문에 ADSC 요법은 여러 장점을 제공한다.

이전 연구에서 우리 팀은 식도 협착 이전에 대한 이중 ADSC 장 내시경 이식의 효과를 입증돼지 모델 (15)의 확장 된 ESD 후 ention. 이 글에서, ADSC 장 건설 및 내시경 이식 기술의 보고서가 제공됩니다.

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프로토콜

모든 동물은 동물 연구 윤리위원회 (농업의 프랑스 교육부의 지침)에 따라 처리 하였다. 이 프로토콜은 파리 데카르트 대학에서 동물 실험과 승인 지역 윤리위원회의 승인을받은 (등록 번호 MESR 2035.02을, 학부 의학 파리 데카르트, 파리, 프랑스의).

1. ADSC 문화 및 라벨링

  1. 민간 기관에서 확인 ADSCs를 얻습니다. 37 ° C, 5 %, 10 % 태아 송아지 혈청과 1 % 항생제 (페니실린과 스트렙토 마이신)를 포함한 알파 최소 필수 매체와 CO 2의 문화 동종 ADSCs.
  2. 표준 셀 확장 절차 (37 ° C와 5 % CO 2)를 사용하여 동물 당 약 24 × 10 6 ADSCs를 얻습니다. 표준 트립신 용액 (a T150 접시 10 ㎖)를 사용하여 수확 ADSCs. 혈구와 셀 계산을 수행합니다.
  3. 전지이다 PKH67 염색 홍보를 사용하여 이식 전날 라벨을 수행ocedure 후술.
    주 : 염색 과정의 목적은 이식 후 세포의 추적을 허용하는 것이다.
    1. 2 × 10 6 ADSCs 레이블을하기 위해, 용액 A를 준비하고 해결 B (희석제 C 1 mL를 PKH67의 4 μL) (100 희석제 C의 μL 2 × 10 6 세포).
    2. 2 분 솔루션 A와 B를 품어. 그런 다음, 1 분 동안 태아 송아지 혈청 100 μL를 추가합니다.
    3. 5 분 동안 1,500 XG에서 구연산 RPMI 300 μL와 솔루션 (RPMI의 298.5 μL와 구연산의 1.5 μL) 원심 분리기를 씻어. 이 작업을 2 회 반복합니다. 표지 된 세포를 유지하고 시트 건설 될 때까지 빛으로부터 보호.

두 번 ADSC 매 구축

  1. 날은 이식 전에 PKH 라벨링되기 전에, 상술 한 세포 배양 배지의 웰 당 4 ㎖, 함께 12 웰 온도 - 응답 세포 배양 접시를 준비한다. 1.5 × 10 6 PKH-labele와 함께 요리를 시드웰 당 D 세포는 12 시간 (37 ℃, 5 % CO 2) 배양한다.
  2. 이식 당일에, 30 분 동안 실온에서 배양 접시에 의해 합류 세포 시트를 분리.
  3. 조심스럽게 피펫 한 ADSC 시트를 대기음과 소수성 종이 (1.5 cm 직경)에 레이어. 지원 막으로이 용지를 사용하십시오.
  4. 다른 ADSC 시트를 잡고 부드럽게 이중층 구조를 획득하기 위해 다른 하나의 상부에 증착.
  5. (동물 당 4) 필요한만큼 ADSC 시트 구조를 얻기 위해이 절차를 반복합니다.

3. 식도 내시경 점막하 절개 (ESD)

  1. 이식 당일, 근육 내 케타민 10 ㎎ / kg과 동물을 미리 의료를 8 밀리그램 / kg의 정맥 내 프로포폴로 유도. 그런 다음, 기관 내 삽관을 수행하고 이소 플루 란 2.5 %의 흡입으로 마취를 유지한다.
  2. 동물은 전신 마취하에되면, gastrosc으로 ESD를 수행OPE하는 비디오 스코프 및 전기 수술 장치.
    1. 40cm의 치열 궁에서 45cm까지 헤미 - 원주 등의 마크를 획득하기 위해 내시경 나이프와 소프트 응고를 사용합니다.
    2. 근육 층으로부터 점막층의 분리 점막하 층으로 인디고 카민 염료를 함유하는 글리세롤의 용액을 주입한다.
    3. 원주 절개를 얻을 수 endocut의 I 모드 내시경 칼을 사용합니다.
    4. 말단 절개에 근위 절개에서 이동, 점막하 절개를 수행하기 위해 강제 응고 모드 내시경 칼을 사용합니다.
  3. ESD 피 프로 시저의 끝에서, 근육 층을 노출 헤미 원주 길이 5cm 식도 흉터를 관찰한다.

4. 내시경 이식

  1. 즉시 ESD 후, 내시경 4 번 ADSC 매 구조로 동물을 이식.
    1. 내시경 집게와 가진 ADSC 시트 구조를 파악큰 투명 캡 내시경을 이용하여 상처 부위로 수송 중에 보호.
    2. 궤양 침대에 ADSC 매 구조의 전체 표면을 적용합니다.
    3. 부드럽게 완전하고 안정된 생착을 얻기 위해 10 분 동안 ADSC 시트 구조가 적용된다. 애플리케이션의 내시경 겸자 내시경 캡을 사용하여 ADSC의 전면은 식도의 점막하 층에 구성 적용된다.
  2. 네 이식 세포 접착 이중 시트 구조를 얻기 위하여이 과정을 각각의 동물에 대한 네 번 반복한다.
    참고 : 목표는 부상 영역의 approximatively 절반을 커버하는 것입니다.

5. 수술 후 평가 및 후속

  1. 각 동물의 경우, 0.2 mg의 모르핀 / kg 세 번 첫날과에 소메 프라 졸의 28 일 안티 - 산 처리 (40 밀리그램 / 일)과 하루의 근육 내 주사와 후 ESD의 진통을 보장합니다. amoxicill와 예방 적 항생제를 수행7 일간 (1g / 일)이다. 다음 날 하루 1 액체 및 고체 권한을 부여합니다.
  2. 이십팔일에 대한 동물과 함께하십시오. 감미로운 Pinkas의 연하 곤란 점수 (16)와 무게 변화 측정을 사용하여 매일 임상 평가를 얻습니다.
  3. 복합 협착 평가 : 예약 된 날짜 3, 14, 28에 전신 마취 하에서, 협착 발생의 복합 평가를 수행합니다.
    1. 흉터 설명 협착 측정 및 용지지지 막 검출하여 내시경 평가를 수행한다. 협착을 통해 교차하는 위 내시경을 사용하여 협착을 측정합니다 (위 내시경의 직경이 8mm)입니다. 염증 측면에주의를 기울이고, 흉터를 관찰 (점막 발적, 점막 부종 및 자연 출혈 점막)과 흉터 내의 부재 또는 용지지지 막의 존재를.
    2. 흉터 침대에 직접 내시경 연산자 운하를 통해 pCLE 녹색 프로브를 적용합니다. 자발적 검색및 PKH67 표지 ADSC 시트 구조의 생착과 호환 녹색 신호를 조직했다.
    3. 방사능 후프 (앞 왼쪽 편 빈도)와 Baryte 용의 식도의 2 직교 발생률을 수행합니다. 협착 평가 협소 입사 계속) 17, 18 (협착 (% 정도) = 협착 하에서 단축 1- (길이 / 협착 하에서 정상 축)의 길이는 100 X)]한다.
  4. 동물 희생.
    1. 28 일째에, 관찰 기간이 종료되면 동물을 희생을 수행한다. 동물은 전신 마취하에있는 동안, 정맥 페노바르비탈 100 ㎎ / ㎏을 주입. 하트 비트의 부재과 움직임을 호흡의 임상 시험에 사용하는 동물의 죽음을 확인합니다.
    2. 각 (10 % 포르말린 고정, 파라핀 삽입, 4 μm의 두께 섹션과) 동물을 희생에서 흉골 절개술 및 장기 노출되면 식도를 제거합니다. 슬라이드 얼룩헤 마톡 실린 및 사프란 15. 컴퓨터 분석을 위해 슬라이드를 디지털화하고, 동물 군 (15)을 비교합니다.

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결과

ADSCs 및 ADSC 시트를 획득하는 절차의 문화는도 1에 도시된다. 도 2는 용지지지 막상에서 서로 적층 된 두 ADSC 시트로 이루어지는 그래프트의 구조를 나타낸다. ADSCs는 이전에 pCLE와 생체 이식 모니터링 수 있도록 PKH67의 형광으로 표지 하였다. 그림 3은 5 cm 및 헤미 - 원주 식도 흉터의 결과로, 확장 된 식도 내시경 점막하 박리의 여러 단계를 보여줍니다. 도 4는 내시경 이식 절차를 나타낸다. 이식은 부드러운 응용 프로그램의 10 분 후에 모든 동물에 대한 성공했습니다. 도 5는 이식 절차의 성공 여부를 확인하는 일 3 포지티브 pCLE 평가를 나타낸다.

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토론

이 돼지 모델에서, ADSC 시트 이식 기술적 성공 및 생체 pCLE 평가 셀 생착 모니터링시켰다. 임상 내시경, 방사선 학적, 조직 학적 평가는 확장 된 ESD 후 식도 협착 예방에 내시경 ADSC 시트의 효과를 보여 주었다.

인디고 카민 염료를 함유하는 시트 ADSC 글리세롤 용액의 내시경 이식 재생 의학에 혁신적인 방법이다. Ohki 등. 제 내시경 이식 절차를 설명했다. 이들 연구에서, 세포 시트 구조는지지 막 10, 11, 19로 사용 폴리 비닐 디 플루오 라이드의 얇은 시트 상에 적층 구강 점막 상피 세포 시트로 구성 하였다. 지원 막은 내시경 집게로 파악 조심스럽게 궤양 침대에 배치했다. CEL1- 시트 부착 부드러운 응용 프로그램의 10 분 후에 얻었다. 이 절차는...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

이 연구는 Avenir 재단(Fondation de l'Avenir, 255 rue de Vaugirard, 75719 Paris cedex 15, Paris, France)의 지원과 자금 지원을 받았습니다. 이 연구는 알랭 카르팡티에 재단(Alain Carpentier Foundation)의 생물 외과 연구 연구소(Laboratory of Biosurgical Research) 수의학 팀의 귀중한 도움이 없었다면 결코 수행되지 못했을 것입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
투명 엔도스코픽 캡 Q180 호환Olympus Optical Co
GIF-Q180 위내시경 Olympus Optical Co
비디오스코프 시스템 Exera II Olympus Optical Co
주사 바늘 18 GOlympus Optical Co
전기수술 유닛 ERBE ICC 350 ERBE 기술
인디고 카르민 1%Life
내시경 하이브리드 나이프Life
Minisonde Z pCLE 녹색 프로브Mauna Kea 기술프로브 사용법을 배워야 합니다. 조작은 어려울 수 있습니다.
소 태아 혈청Sigma Aldrich12105C
TrypsinSigma AldrichT146
알파 최소 필수 배지Thermo Fisher22561-021
인산염 완충 식염수Thermo Fisher10010-023
PKH67 염료 키트Sigma AldrichMini67-KT
12-well 온도 반응형 셀 배양 접시Upcell Thermo Scientific174900시딩 30분 전에 4 mL 표준 중간 배양으로 웰을 느껴보세요
. Esomeprazole 40 mg Biogaran
Moprhine sulfate 50 mg/mLLavoisier
Amoxicilline 1 gBiogaran
케타민 250 mg/5 mLPanpharma
프로포폴 10 mg/mLFresenius
소수성 종이까르푸
세포

참고문헌

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