LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

요약

우리는 LC-MS / MS 시스템을 사용 coregulatory 상호 작용 단백질의 정제 방법을 확립 하였다.

초록

전사 공동조절인자는 핵 염색질 구조의 효율적인 전사 조절에 필수적입니다. Coregulator는 전사를 조절하는 데 다양한 역할을 합니다. 여기에는 전사 인자(transcription factor)와의 직접적인 상호 작용, 히스톤 및 기타 단백질의 공유 변형(covalent modification), 그리고 때때로 발생하는 염색질 형태 변형(chromatin conformation alteration)이 포함됩니다. 따라서 이 네트워크 내에서 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위한 비교적 빠른 방법을 확립하는 것은 기본 조절 메커니즘에 대한 이해를 높이는 데 중요합니다. LC-MS/MS 매개 단백질 결합 파트너 식별은 단백질-단백질 상호 작용을 분석하는 데 사용되는 검증된 기술입니다. 이전에 확인된 단백질 복합체의 구성원을 항체(때로는 태그가 지정된 단백질에 대한 항체와 함께)로 면역침전시킴으로써, 질량 분석 분석을 통해 알려지지 않은 단백질 상호 작용을 식별할 수 있습니다. 여기에서는 핵 보조인자 및 결합 파트너를 포함하는 단백질 상호 작용의 LC-MS/MS 매개 고처리량 식별을 위한 단백질 준비 방법을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 표적 핵 인자의 전사 조절 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다.

서론

단백질 - 단백질 상호 작용은 다양한 생물학적 기능에 중요한 역할을한다. 따라서, 이러한 상호 작용은 신호 전달에 연루되어왔다 세포막 단백질 수송; 세포의 신진 대사; 및 DNA 복제, DNA 손상 복구, 재조합 및 전사 ^{1, 2, 3, 4} 등 여러 핵 프로세스. 이러한 상호 작용에 관여하는 단백질을 확인하는 것은이 세포 과정에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 중요하다.

면역 침전 (IP)는 단백질 - 단백질 상호 작용을 분석하는데 사용되는 검증 된 기술이다. 공동 - 면역 침전 된 단백질의 동정을 용이하게하기 위하여, 질량 분석계는 종종 이용 ^{5, 6, 7, 8,9.} 항체와 단백질 복합체의 공지 부재 타겟팅함으로써, 단백....

프로토콜

1. 형질

1. 100 mm 배양 판 (2 × ¹⁰⁶ 세포 / 접시)에 HEK293 세포 종자. 배양 10 % 소 태아 혈청, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 100 유닛 / ㎖의 페니실린으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 배지에서 세포. 5 % CO ₂ 및 37 ℃로 가습 된 배양기에서 세포를 인큐베이션.
2. 다음 날, FLAG-태그 ARIP4 플라스미드의 10 μg의 제조업체의 방향 ^(11)에 따라 형질 전환 시약의 40 μl를 이용하여 세포를 형질.

2. 단백질 추출

1. 약 트랜 스펙 션 후 36 시간이 빙냉 PBS로 세포를 세척하고 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확. 1.5 mltube에 세포를 전송하고 4 ℃에서 2 분 동안 8,000 XG에 그것을 원심 분리기. 대기음 뜨는 배에서 세포 펠렛을 재현 탁 0.4 M KCl을 버퍼의 펠릿 볼륨 (높은 염 완충액 : 20 mM 트리스 -HCl (pH 8.0), 0.4 M KCl을5 밀리미터의 MgCl _2, 10 % 글리세롤, 0.1 % NP-40, 10 밀리미터 B-mercaptethanol, 1X 프로테아제 억제제 칵테일)....

결과

우리는 강한 신호 ARIP4 약 160 KDa의뿐 모의 샘플 제어 및 몇몇 다른 미지의 단백질의 것과 (도 1)을 확인 하였다. LC-MS / MS 분석은 펩티드 복합체 ARIP4 FLAG 비드 (표 1)의 분획 내의 잠재적 인 펩티드 공동 인자를 모두 식별. P62 (Sequestosome1)는 공지 ARIP4 공동 인자 ^(11)는이 시스템 ^(11)의 유효성을 확인하는 분석 (표 1)에서 확인되었다. 우리는 또한 ARIP4와 상호 작용하는 많은 다른 이전에보고 된 단백질을 확인했다. 이러한 방식으로, Sumo2 ¹⁰ DryK ^(13)는 LC-MS / MS 분석을 통해 검출 하였다. ARIP4 펩티드는 또한 I.......

토론

효율적인 형질 감염 프로토콜이 성공적인 결과를 얻는 것이 필수적이다. 따라서, 우리는 면역 FLAG 태그가 단백질 수준을 결정하는 웨스턴 블롯 분석을 사용하는 것이 좋습니다. 이 단계는 IP가 성공적으로 수행되었는지, 그들의 관심 단백질이 제대로 또한, 과발현되어 있는지 확인하려면 사용자 수 있습니다. FLAG 태그가 단백질 수준은 질량 분광 분석에 앞서 확인하여야한다.

모의 샘플 위양성 결과를 얻는 피하고 진정한 상호 작용 배경을 판별하는 음성 대조군으로 사용한다. 인간 단백질을 연구 할 때 또한, 실험은 오염을 방지하기 위해, 비교적 깨끗한 환경 (예를 들면, 클린 룸)에서 수행되어야한다. 높은 염 농도 (0.3-0.4 M)으로 단백질을 추출 버퍼 때때로 핵 단백질을 추출하기 위해 사용될 수 있지만하는 0.1 ~ 0.15 M 염 농도와 IP 버퍼가 대부분이며열 좋습니다. 이 IP 절차는 단백질 - 단백질 상호 작용을 방해하지 않고 진행 할 수 있습니다. 상.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Lipofectamine 2000 형질주입 시약	Thermo Fisher Scientific	11668019
프로테아제 억제제 칵테일(EDTA 무료)(100x)	nacalai tesque	03969-21
ANTI-FLAG M2 친화력 젤	Sigma-Aldrich	A2220
Micro Bio-Spin 컬럼	BIO-RAD	732-6204