Method Article

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

DOI:

10.3791/55077

⸱

January 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 2Department of Biotechnology and Genetic Engineering, Jahangirnagar University, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences, 5Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 LC-MS / MS 시스템을 사용 coregulatory 상호 작용 단백질의 정제 방법을 확립 하였다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전사 공동조절인자는 핵 염색질 구조의 효율적인 전사 조절에 필수적입니다. Coregulator는 전사를 조절하는 데 다양한 역할을 합니다. 여기에는 전사 인자(transcription factor)와의 직접적인 상호 작용, 히스톤 및 기타 단백질의 공유 변형(covalent modification), 그리고 때때로 발생하는 염색질 형태 변형(chromatin conformation alteration)이 포함됩니다. 따라서 이 네트워크 내에서 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위한 비교적 빠른 방법을 확립하는 것은 기본 조절 메커니즘에 대한 이해를 높이는 데 중요합니다. LC-MS/MS 매개 단백질 결합 파트너 식별은 단백질-단백질 상호 작용을 분석하는 데 사용되는 검증된 기술입니다. 이전에 확인된 단백질 복합체의 구성원을 항체(때로는 태그가 지정된 단백질에 대한 항체와 함께)로 면역침전시킴으로써, 질량 분석 분석을 통해 알려지지 않은 단백질 상호 작용을 식별할 수 있습니다. 여기에서는 핵 보조인자 및 결합 파트너를 포함하는 단백질 상호 작용의 LC-MS/MS 매개 고처리량 식별을 위한 단백질 준비 방법을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 표적 핵 인자의 전사 조절 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 - 단백질 상호 작용은 다양한 생물학적 기능에 중요한 역할을한다. 따라서, 이러한 상호 작용은 신호 전달에 연루되어왔다 세포막 단백질 수송; 세포의 신진 대사; 및 DNA 복제, DNA 손상 복구, 재조합 및 전사 1, 2, 3, 4 등 여러 핵 프로세스. 이러한 상호 작용에 관여하는 단백질을 확인하는 것은이 세포 과정에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 중요하다.

면역 침전 (IP)는 단백질 - 단백질 상호 작용을 분석하는데 사용되는 검증 된 기술이다. 공동 - 면역 침전 된 단백질의 동정을 용이하게하기 위하여, 질량 분석계는 종종 이용 5, 6, 7, 8,9. 항체와 단백질 복합체의 공지 부재 타겟팅함으로써, 단백질 복합체를 분리하고,이어서 질량 분광 분석을 통해 그 미지의 컴포넌트를 식별 할 수있다. ARIP4 (안드로겐 수용체 상호 작용하는 단백질 4), 전사 coregulator은 활성화 또는 상황에 의존적으로 9, 10 년 대상 발기인을 억제하기 위해 핵 수용체 단백질과 상호 작용한다. 더 이러한 핵 인자를 지배하는 전사 조절 메커니즘을 이해하기 위해 정화하고, LC-MS / MS 시스템을 사용하여 ARIP4 상호 작용 단백질을 확인하는 포괄적 인 방법을 설명한다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 형질

  1. 100 mm 배양 판 (2 × 106 세포 / 접시)에 HEK293 세포 종자. 배양 10 % 소 태아 혈청, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 100 유닛 / ㎖의 페니실린으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 배지에서 세포. 5 % CO 2 및 37 ℃로 가습 된 배양기에서 세포를 인큐베이션.
  2. 다음 날, FLAG-태그 ARIP4 플라스미드의 10 μg의 제조업체의 방향 (11)에 따라 형질 전환 시약의 40 μl를 이용하여 세포를 형질.

2. 단백질 추출

  1. 약 트랜 스펙 션 후 36 시간이 빙냉 PBS로 세포를 세척하고 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확. 1.5 mltube에 세포를 전송하고 4 ℃에서 2 분 동안 8,000 XG에 그것을 원심 분리기. 대기음 뜨는 배에서 세포 펠렛을 재현 탁 0.4 M KCl을 버퍼의 펠릿 볼륨 (높은 염 완충액 : 20 mM 트리스 -HCl (pH 8.0), 0.4 M KCl을5 밀리미터의 MgCl 2, 10 % 글리세롤, 0.1 % NP-40, 10 밀리미터 B-mercaptethanol, 1X 프로테아제 억제제 칵테일). 4 ℃에서 20 분 동안 혼합물을 돌립니다.
  2. 4 ℃에서 10 분 동안 17,700 XG에서 튜브를 원심 분리기.
  3. (새로운 2 ㎖의 튜브에 상청 (전체 세포 추출물)을 전송하고 0 M KCl을 버퍼의 초기 부피 3 배 추가 희석 완충액 : 20 mM 트리스 -HCl (pH 8.0), 5 밀리미터의 MgCl 2, 10 % 글리세롤, 0.1 % NP-40, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 1X 프로테아제 억제제 칵테일).
  4. 다른 원심 분리 (4 ℃에서 10 분 동안 17,700 XG)을 수행하고, 새로운 2 ML 튜브에 뜨는 (전체 세포 추출물)를 전송합니다.

3. 면역 침전

  1. 20 mM의 트리스 : 원심 분리 (2.4) 중, (0.1M KCl을 완충액으로 두번 저염 완충액을 세척 한 다음 PBS로 안티 FLAG 비드 50 ㎕의 0.1 M 글리신 - 염산하고 1 M 트리스 - 히드로 클로라이드를 씻어 염산 (PH 8.0), 0.1 M의 KCl, 5 mM의 MgCl2를, 10 % 글리세롤, 0.1 % NP-40, 10mM (B) 머 캅토 에탄올, 1X 프로테아제 억제제 칵테일). 이 세척 공정의 원심 분리는 39 ° C에서 1 분 동안 2,000 × g으로 수행된다.
  2. 전체 세포 추출물 FLAG 비드의 50 μL를 혼합하고 가볍게 2-4 ℃로한다 (단계 2.4의 전체 세포 추출물의 1 %는 또한 나중에 사용하기 위해 -80 ℃에서 보관한다에서 4 시간 동안 혼합물을 회전 ) 입력으로.
  3. 마이크로 스핀 열 (중력 드롭)에 샘플을 전송합니다. (입력 및 관류 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 양자의 단백질 수준을 확인), 1.5 ㎖의 튜브에 관류 유지 액체 질소를 사용하여 동결하고, -80 ℃에서 보관.
  4. 국기 비즈 (중력 드롭)을 씻어 0.1 M KCl을 버퍼 (낮은 소금 버퍼)의 1 ML을 추가합니다.
  5. 3.4 적어도 네 번 이상 (오 세척의 총) 단계를 반복합니다.

4. 용출

  1. 1.5 ML 튜브에 열을 놓고 1 분 동안 2,000 XG에이를 원심 분리; 구슬 건조됩니다.
  2. 하단 캡열.
  3. 0.1 M 글리신 - 염산 (PH 2.5)의 (FLAG 구슬의 부피와 동일) 50 μl를 추가합니다.
  4. 부드럽게 실온에서 10 분 동안 혼합물을 흔들어.
  5. 새로운 1.5 ML 튜브에 열을 놓고 1 분 동안 2,000 XG에 그것을 원심 분리기.
  6. 용출액을 1 M Tris-HCl (pH8.0)을 10 ㎕의 중화; 피펫 또는 와류 장치를 이용하여 잘 혼합한다.

5. 알킬화 및 트립신

  1. 100 mM의 NH 4 HCO 3, CH 3 CN 10 μL, 혼합물에 디티 오 트레이 톨의 2 μL (112 μl의 총 부피)의 50 μl를 추가합니다.
  2. 56 ° C에서 30 분 동안 샘플을 인큐베이션.
  3. 실온에서 10 분 동안 샘플을 놓는다.
  4. 요오도 아세트 아미드 시료에 333 mm의 10 μl를 첨가하고 37 ℃에서 30 분 동안 어두운 데에서 부화.
  5. 혼합물에 트립신의 10 μL (33 NG / μL)을 추가하고 37 ° C에서 하룻밤을 품어.

(6)에게. LC-MS / MS 분석

  1. 밤새 트립신 처리 후, LC-MS / MS 시설이나 분석 12 타사 질량 분석 실험실로 최종 제품을 수송.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 강한 신호 ARIP4 약 160 KDa의뿐 모의 샘플 제어 및 몇몇 다른 미지의 단백질의 것과 (도 1)을 확인 하였다. LC-MS / MS 분석은 펩티드 복합체 ARIP4 FLAG 비드 (표 1)의 분획 내의 잠재적 인 펩티드 공동 인자를 모두 식별. P62 (Sequestosome1)는 공지 ARIP4 공동 인자 (11)는이 시스템 (11)의 유효성을 확인하는 분석 (표 1)에서 확인되었다. 우리는 또한 ARIP4와 상호 작용하는 많은 다른 이전에보고 된 단백질을 확인했다. 이러한 방식으로, Sumo2 10 DryK (13)는 LC-MS / MS 분석을 통해 검출 하였다. ARIP4 펩티드는 또한 I...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

효율적인 형질 감염 프로토콜이 성공적인 결과를 얻는 것이 필수적이다. 따라서, 우리는 면역 FLAG 태그가 단백질 수준을 결정하는 웨스턴 블롯 분석을 사용하는 것이 좋습니다. 이 단계는 IP가 성공적으로 수행되었는지, 그들의 관심 단백질이 제대로 또한, 과발현되어 있는지 확인하려면 사용자 수 있습니다. FLAG 태그가 단백질 수준은 질량 분광 분석에 앞서 확인하여야한다.

모의 샘플 위양성 결과를 얻는 피하고 진정한 상호 작용 배경을 판별하는 음성 대조군으로 사용한다. 인간 단백질을 연구 할 때 또한, 실험은 오염을 방지하기 위해, 비교적 깨끗한 환경 (예를 들면, 클린 룸)에서 수행되어야한다. 높은 염 농도 (0.3-0.4 M)으로 단백질을 추출 버퍼 때때로 핵 단백질을 추출하기 위해 사용될 수 있지만하는 0.1 ~ 0.15 M 염 농도와 IP 버퍼가 대부분이며열 좋습니다. 이 IP 절차는 단백질 - 단백질 상호 작용을 방해하지 않고 진행 할 수 있습니다. 상...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders(HT), Takeda Science Foundation(HT) 및 Japan Society for the Funds-in-Aid for Young Scientists(B)의 지원을 받았습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 2000 형질주입 시약Thermo Fisher Scientific11668019
프로테아제 억제제 칵테일(EDTA 무료)(100x)nacalai tesque03969-21
ANTI-FLAG M2 친화력 젤Sigma-AldrichA2220
Micro Bio-Spin 컬럼BIO-RAD732-6204

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430(2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498(2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein PreparationNuclear CofactorLC MS MS AnalysisProtein InteractionTranscriptional RegulationImmunoprecipitationMass SpectrometryFlag Tagged ProteinsHEK 293 CellsSilver Staining

Related Articles