Intracarotid 암 세포 주입 뇌 전이의 마우스 모델을 제작하기

요약

치료 옵션을 완화 남아있는 동안 그 빈도는 증가로 뇌 전이는 긴급 충족되지 않은 의료 요구되고있다. 암 세포의 intracarotid 동맥 주입을 통해 뇌 전이의 실험 동물 모델을 만들기 소설 개입 요법의 질병 생물학 및 평가의 기계론의 연구를 용이하게한다.

초록

전이, 환자의 신체 내에서 보조 사이트의 확산과 악성 세포의 성장, 암 관련 사망의> 90 %를 차지한다. 최근, 새로운 치료의 인상적인 발전은 극적으로 많은 암 환자의 생존과 삶의 품질 향상을 연장했다. 슬프게도, 뇌 전이 재발의 빈도는 빠르게 상승하고, 현재의 모든 치료는 단지 완화 있습니다. 따라서, 좋은 실험 동물 모델이 긴급하게 질병 생물학에 대한 심층 연구를 촉진하고 전임상 평가를위한 새로운 치료 요법을 평가하기 위해 필요하다. 그러나 암세포의 꼬리 정맥 주사를 통하여 생체 전이 분석에서 표준은 주로 폐 전이성 병변을 생성한다; 동물은 일반적으로 뇌 전이의 의미를 가지 전에 폐 종양 부담에 굴복. 종양 세포의 주입 심내 뇌를 포함한 여러 기관 사이트 전이성 병변을 생성; 그러나 variabi이 모델로 제작 종양 성장의 lity는 치료 효과를 평가하는 자사의 유틸리티를 완충, 큽니다. 뇌 전이의 연구를위한 안정적이고 일관성있는 동물 모델을 생성하려면, 여기에 우리가 종양 세포의 intracarotid 주입을 통해 집 마우스 (뮤스의 musculus)에서 실험적인 뇌 전이를 생성하는 절차를 설명합니다. 이러한 접근 방식은 기본 따라서 생물학적 메커니즘을 연구 및 신규 한 치료제를 평가하는 연구 노력이 용이 한 유사 성장과 사망률 특성 뇌 전이 - 함유 마우스의 다수를 생성 할 수있다.

서론

중추 신경계 (CNS)에 암의 전이는 파괴적인 질환, 뇌 실질 또는 ( "뇌 전이는"이 문서에 모두를 의미)를 leptomeninges를 포함 할 수있다. 1 ^{일, 2} : 그것은> 10 차 신경 교종을 상회, 주된 두개 내 악성 종양이다. 폐암, 유방암, 흑색 종 및 뇌 전이 ^3,4- 높은 빈도를 생성하는 세 가지 주요 종양 질환이다. 최근, 새로운 암 치료의 인상적인 발전이 크게 많은 암 환자의 생존 및 삶의 질 개선을 연장하고있다. 그러나, 재발시 뇌 전이의 빈도가 빠르게 증가하고있다. 예를 들어, 항 HER2 항체 트라 스투 주맵 (헤르 셉틴)은 HER2 + 유방암 환자에서 심각한 임상 적 효능을 보여 주었다; 아직 불안 추세가 등장했습니다이러한 환자 : 그 두개 외 전신 질환 초기에 나중에 뇌 전이 ^{5, 6, 7을} 개발 트라 스투 주맙 치료 혜택을 사람들의 1/3까지. 슬프게도, 뇌 전이 환자는 일반적으로 삶의 질 외상 저하를 경험하고, 거의 모든 현재의 치료에 불응하고, 진단 후 자신의 일 년 생존율은 ~ 20 % ^8입니다. 현재 (스테로이드, 두개골 방사선 치료, 선택된 환자에서 수술 적 절제 포함) 뇌 전이에 대한 치료입니다 단지 ⁹ 치료하지 완화. 따라서, 뇌 전이는 새로운 암 치료의 시대에서 다음 당당한 도전으로 부상하고있다. 환자가 병원에 ​​매일 직면 충족 문제를 해결하기 위해, 우리는 긴급하게 더 나은 뇌 전이의 기본 메커니즘을 이해하고 새로운 치료법을 개발하기 위해이 지식을 사용해야합니다.

전이성 암 세포에 의한 뇌의 성공적인 정착은 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 바이 패스 여러 생물학적 플레이어의 복잡한 상호 작용에 의해 매개되는 기능의 시리즈의 성능을 요구하고 뇌의 극한 탈출 생체 외 또는 시험 관내 시스템에서 효과적으로 요약되어 어느 것도 면역 방어 메카니즘 ^(10). 따라서, 생체 내 모델에서 적절하고 충실한 뇌 전이의 연구에 중요하다. 생체 전이 분석에서 종래의 폐에 박혀 될 셀의 대부분을 이끌어 꼬리 정맥 주사를 통해 암세포를 도입한다. 동물의 죽음은 폐 ^(11)에 종양 부담에 의해 발생하기 전에 뇌 전이 병변은 거의 이러한 모델에서 생산되지 않습니다. 암세포를 직접 뇌내 주입은 CNS에서 일관된 종양 생장을 생성 널리 차 신경 교종의 연구에 사용된다. 그러나이야UCH 주입이 모델의 생리 학적 관련성에 관해서, 주요 관심 사항 모두를 BBB 타협 및 주사 부위에서 외상시킨다. 또 다른 자주 사용되는 암세포 도입 경로, 심장 내 주사, 관리하고 CNS로 실험 전이를 생성 않기 쉽다. 그러나, CNS 이외 장기 사이트에 대한 동시 전이가 항상 일어난다 동물 ^{11 사망을} 일으킬 수있다 따라서,이 모델의 변동의 높은 생물학적 메커니즘이나 동물의 제한된 수의 치료제의 정량 평가가 부적절한다.

여기서 우리는 경동맥에 암세포를 주입 실험을 통해 뇌 전이를 생성하는 절차를 설명한다. 우리는 뇌 전이의 전이성 캐스케이드 개별 유전자 '기여를 해부하고 치료 개입의 효과를 평가하기 위해이 방법을 사용했다S ^{(12, 13).} 이 방법의 주요 이점은 재현성 및 변동의 낮은 정도의 높은 수준이다; 주요 단점은 미세 수술을 수행하기 위해 필요한 정교함 손재주이다.

프로토콜

윤리 문 : 모든 동물 연구는 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 사출에 대한 암 세포를 준비

1. 주입 이전에 암 세포를 하루나 이틀 종자. 전문 매체가 특정 세포주에 대한 문헌에 표시되지 않는 한, 10 % FBS로 보충 된 DMEM / F12 미디어를 사용합니다.
2. 37 ℃에서 2 분 - 1 트립신 (0.25 %) 이전에 한번 혈청이없는 배지로 세척하여 처음 80 % 합류 - 수술 당일 수확 세포들은 70에 도달 할 때. DMEM / F12 배지를 FBS 함유 10 %는 0.25 % 트립신을 종결 세포에 추가한다.
3. 3 분 동안 80 × g에서 원심 분리하여 세포. 세포주에 따라, 5 × ¹⁰⁶ 세포 / ml - 잔류 혈청을 제거 혈구와 세포를 세어 1 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)에 재현 탁 두번 무 혈청 배지에서 세포를 세척 하였다. 얼음에 보관주입 때까지.
   주 : MDA-MB-231 유방암 세포 K1735 흑색 종 세포는이 연구에 사용되었고, 두 세포주 / ml의 농도를 2 × ¹⁰⁶ 세포로 사용 하였다. 전이 분석의 결과에 영향을 미칠 수 overtreatment 최대한 짧게 트립신 처리 시간을 유지한다.

2. 종양 세포 주입을 위해 마우스를 준비합니다

1. 복강 내 (IP)에 의해 마우스 케타민의 주입 / 자일 라진 칵테일 (케타민 100 ㎎ / ㎏, 자일 라진 10 ㎎ / ㎏)를 마취.
2. 동물의 발을 곤란하게하여 완전한 마취를 확인하고 응답의 부족을 관찰합니다.
3. (단백질 젤 주조에 사용) 유리 접시에 마우스를 놓고 고무 밴드로 고정합니다.
4. 필요한 경우, 면도 또는 털 제거 제품을 소량 도포하고 종이 타월로 머리를 닦아 목 모발 제거. 참고 : 누드 마우스를 사용하는 경우가 체모를 가지고 있지 않는 한,이 단계를 건너 뜁니다.
5. 적용하여 목 피부를 청소포비돈 요오드 및 70 % 알콜.
6. 해부 현미경의 무대에 마우스를 놓습니다
7. 긴 수술 메스로 피부 ~ 1cm의 절개를합니다.
8. 퉁명스럽게 아래에있는 경동맥을 노출 이빨 집게로 근육을 해부하다.
9. 수술 집게와 인접 미주 신경에서 경동맥을 분리합니다.
10. 수술 집게를 사용하여 작은 목화 공에, 목화 공에서 어떤면을 분리 축축하고, 패션. 주사 원하는 사이트의 경동맥 아래에이 버퍼 수분 목화 공을 놓습니다.
11. 코튼 볼에 봉합 원위부 및 근위부를 놓고 느슨한 매듭을합니다. 주사 부위에 혈류를 차단하는 근위 매듭을 조인다.
12. 면화 공 경동맥 신선한 붉은 피와 완벽하게 가압 나타나는 경우 암 세포 주입을 진행합니다.

경동맥에 3. 암 세포 주입

1. 소용돌이와 100 μL O를 그립니다주사기로 F 암세포.
2. 해부 현미경, 천천히면 공의 꼭대기에 앉아 경동맥의 루멘에 (경사 최대) 31 G 바늘을 삽입합니다.
3. 천천히 경동맥 내로 주사기로부터 세포를 주입. 버퍼 암 세포가 순환으로 가압 될 때 사출 성공적인 인근 혈관 근육의 색을 변경하여 현미경으로 관찰 할 수있다.
4. 전체 볼륨의 주입이 완료되면, 역류 방지 부드럽게 원위 경동맥 리프트.
5. 빠르게 주입 프로세스를 완료 원위 매듭을 조인다.
6. 주입을 완료 한 후, 합자을 강화하고, 해부 현미경 하에서 미세 가위로 과잉 실크 봉합사 트림. 상처 부위를 덮도록 분리 근육 위로 이동한다. 두 스테이플 피부를 닫습니다.

4. 수술 복구

1. 가열 패드로 조작 된 동물 이동복구. 동물이 의식을 회복하는 데 60 분 - 그것은 30 걸릴 수 있습니다. 한편, 수술 후 통증 등의 피하 주사를 통해 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다. 참고 : 진통은 해당 지역의 IACUC 프로토콜을 승인에 따라 제공되어야한다.
2. 동물 각성과 정상적인 동작을 재개하면, 자신의 주택 위치에 마우스를 반환합니다. 며칠 후 수술 젤 음식 마우스를 제공합니다. 수술 기록을 유지하고 실내에 보관합니다.

생체 이미징 5. 비 침습적

1. 루시퍼 라제 리포터 작 제물로 표지 세포, 생체 내 이미징 시스템 ^(14)에 사용하여 암세포 주입 효율을 측정한다.
   주 : 이미징 연구 동물에게 과도한 스트레스를 방지하기 위해 주입 당일에 수행되지 않는다.

결과

분사의 품질이 평가 될 수있는 두 지점이있다. 첫 번째 가능성은 주입 중에 혈관 색을 변경하는 운전자의 관찰이다. 불량한 주사 누설 손쉽게 해부 현미경으로 관찰 할 수있다. 정상 및 보안 마우스 본체의 위치 (그림 1A)과지지면 공의 경동맥 (그림 1B)는 경동맥에 원활하고 성공적인 주입을위한 중요한 요소입니다. 주입 품질을 평가하기위한 두번째 포인트는 비 침습성 영상화 수술이다. 이를 위해, 암 세포는 일반적으로 주입 전에 루시페라아제 리포터 생체 표지된다. 일반적으로 24 시간 후 분사를 수행 생체 내 이미징의 동물에 스트레스를 최소화합니다. 강한 두개 암세포 부하 마우스 헤드 성공적인 주입 결과는 양성의 유일한 영역이다ignals (그림 2A).

토론

암 세포의 성공적인 경동맥 동맥 주입을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 수술 준비 마우스의 1) 깊은 마취; 2)면 지원의 상단에 경동맥의 정상 위치; 성공적인 주사 후 경동맥의 3) 단단히 결찰.

30 분 ~ 깊은 마취는 해부 현미경으로 꾸준한 수술 성능을 위해 일반적으로 필요하다. 우리는 마우스 마취 상업적으로 즉시 사용 케타민 / 자일 라진 칵테일을 사용합니다. 마취 사용 볼륨 조정에 유연성을 제공하는 생리 식염수에 2 : 1 또는 1 : 과용 가능성을 피하기 위해 케타민 / 자일 라진 칵테일 1로 희석 될 수있다. 대안 적으로, 비 - 제어 된 약물 tribromoethanol은 마취제로서 사용될 수있다; 그러나, 우리는 저하하는 tribromoethanol의 성향이 물질이 적은 안정적인 케타민 / 자일 라진 칵테일보다 효과적인 마취로 만드는 것으로 나타났습니다.

에이꾸준히 넣고 충분히 가압 경동맥 크게 암세포...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케타민 염산염/자일라진 염산염 용액	Sigma-Aldrich	K113
루틴 실체현미경 Leica M50 Leica		M50	현미경은 모듈식이며 특정 공간 요구 사항에 맞게 고도로 구성할 수 있습니다.
피부 절개를 위한	외과용 일회용 스케이프	Integra Miltex	4-410
조직 집게 - 1 x 2 치아	미세 과학 도구	11021-12	무글을 둔탁하게 해부합니다
Dumont #5 - 거울 마감 집게	Fine Science Tools	11252-23	경동맥을 분리하고 주사를 준비합니다
봄 가위	Fine Science Tools	15025-10	은 봉합사를 절단합니다.
EZ 클립 키트	스톨팅	59020	상처 cloure
BD 인슐린 주사기	Becton Dickinson	세포 주입 용	328438
IVIS 스펙트럼 In Vivo 이미징 시스템	PerkinElmer	124262

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