이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

단순함의 힘 : 같은 성게 배아

7.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55113

⸱

2017년 2월 16일

이 논문에서

요약

이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.

초록

배아 발달 과정에서 성체 형태의 다양한 세포 유형과 조직을 생성하기 위해 필요한 세포 간 신호 전달 경로는 현저히 적습니다. 그러나 매년 개별 신호 경로의 더 많은 구성 요소가 발견되고 있으며, 연구에 따르면 상황에 따라 이러한 경로 대부분에서 상당한 혼선이 발생한다고 합니다. 이러한 복잡성으로 인해 모든 생체 내 발달 모델 시스템에서 세포 간 신호 전달을 연구하는 것은 어려운 작업입니다. 또한 차세대 차등 스크린에서 생성된 대규모 데이터 세트에서 식별된 신호 경로와 관련된 분자를 특성화하기 위해 효율적인 기능 분석이 필요합니다. 여기에서는 성게 배아에서 세포 운명과 축 사양을 제어하는 신호 전달 경로의 구성 요소를 효율적으로 식별하는 간단한 방법을 보여줍니다. 성게와 유사한 배아의 게놈 및 형태학적 단순성은 복잡한 신호 상호 작용을 이해하기 위한 강력한 생체 내 발달 모델을 만듭니다. 여기에 설명된 방법론은 개별 경로에서 새로운 신호 전달 분자를 식별하기 위한 템플릿으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다른 많은 유기체의 다양한 경로에서 분자 간의 상호 작용을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

유전자 조절 네트워크 (GRNs) 신호 전달 경로는 성인 동물 신체 계획을 작성하는 데 사용되는 배아 발달 동안 유전자의 시공간적 식을 설정. 세포 간 신호 전달 경로는 세포가 통신하는 수단을 제공하는 이러한 규제 네트워크의 필수적인 구성 요소이다. 이러한 세포의 상호 작용을 수립하고 배아 1, 2 중에 다양한 지역과 중 규제 및 분화 유전자의 발현을 수정. 세포 외 분비 조절제 (리간드 길항제) 수용체 공동 수용체 간의 상호 작용은 신호 전달 경로의 활동을 제어한다. 세포 내 분자의 구색은 세포의 변형 된 유전자 발현, 분할 및 / 또는 형상의 결과로 이러한 입력을 transduces. 주요 경로에있는 세포 및 세포 수준에서 사용되는 키 분자의 대부분은 있지만공지 그것은 개개 신호 경로의 복잡성으로 인해 많은 부분에서 불완전한 지식이다. 또한, 다른 신호 경로는 종종 세포, 세포 내에서 양 또는 음 중 서로 상호 작용하고 전사 레벨 3, 4, 5, 6. 중요....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 높은 처리량 모르 폴리 노 디자인 전략

  1. 관심의 유전자 (들) (예를 들어 후보 유전자 접근 방식, 시스 - 규제 분석, RNAseq 및 / 또는 단백체 차동 화면)를 확인합니다.
  2. 자주 업데이트되는 웹 사이트에서 게놈, transcriptomic 및 유전자 발현 데이터를 사용 (예 : SpBase http://www.echinobase.org (20)와 S. purpuratus 게놈 검색에 http : ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html)을 시공간 발현 프로파일이 문제의 발달 메커니즘과 겹치는 것을 확인합니다. 어떤 발현 데이터가 없다면, qPCR에 프라이머를 생성 및 / 또는 인 시츄 프로브는 안티센스 유전자 발현 패턴을 평가.
  3. 시공간 발현 패턴을 결정한 후, 게놈 웹 사이트로부터의 DNA 서열을 얻었다.
    1. 번역 차단 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 생성하는 오 시퀀스를 획득F 5 '비 - 번역 영역 (5'UTR) 직접 상류에서 SpBase 또는 S. purpuratus 게놈 검색 웹 사이트에서 표현 된 시퀀스 태그 (EST) 데이터베이스....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

성게 배아에서 우리는 3 가지의 Wnt 신호 지점 (이 Wnt / β-catenin이,이 Wnt / JNK와의 Wnt / PKC) 4, 25 상호 작용은 전후방 (AP) 패턴에 적용의 Wnt 신호 전달 네트워크를 형성하는 것으로 나타났습니다. 이러한 시그널링 이벤트의 가장 중요한 결과 중 하나는 초기 넓게 표현 전방 neuroectoderm (ANE) GRN가 낭배의 시작 (S.의 purpuratus HPF 24)에 의해 전방 기둥 주위의 작은 영역에 제한된다 있다는 것이다. 이러한 결과는이 Wnt / β-catenin의 신호가 32 세포 단계에서 배아의 후방 절반 ANE 유전자의 활성화를 방지 함을 나타냅니다. 그리고,이 경로는 점진적으로 아래로 60 세포 단계 초기 낭배의 배아의 앞쪽 절반에 ANE GRN을 조절 비표준의 Wnt / JNK 신호 .......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

여기에 제시된 방법은 .. 많은 연구소가 해부 일찍 성게 개발 과정에서 유사한 분석을 사용하는 기본적인 발달 메커니즘을 지배하는 신호 전달 경로와 GRNs을 이해하는 척추 동물보다 작은 게놈과 형태 학적 복잡성 배아를 사용하는 능력을 보여주는 예입니다 다른 세포 운명 사양 이벤트에 관련된 신호 전달 경로 (예 노치 헤지 호그, TGF-β의와 FGF 신호) 27, 28, 29, 30, 31. 이 성게 연구는 후구 동물 9, 27, 30 <사이에서 보존되는.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

원고를 주의 깊게 읽고 편집해 주신 Robert Angerer 박사님께 감사드립니다. NIH R15HD088272-01, 미시시피 주립 대학의 연구 개발 사무소 및 생물 과학부는 RCR에 이 프로젝트를 지원했습니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
번역 차단 모르폴리노 및/또는 스플라이스 차단 모르폴리노Gene Tools LLC사용자 정의www.gene-tools.com
GlycerolInvitrogen15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)Invitrogen, Life TechnologiesD1821Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM GradeElectron Microscopy Sciences15710
MOPSSigma AldrichM1254-250G
Tween-20Sigma Aldrich23336-0010
포름아미드Sigma Aldrich47671-1L-F
효모 tRNAInvitrogen15401-029
Normal Goat SerumSigma AldrichG9023-10mL
알칼리성 포스파타아제 접합 항디곡시제닌 항체Roche11 093 274 910
테트라미솔 염산염(레바미솔)Sigma AldrichL9756-5G
Tris Base UltraPureResearch Products Internationall Corp56-40-6
염화나트륨Fisher ScientificBP358-10
염화마그네슘Sigma Aldrich7786-30-3
BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이Roche11 383 221 001
4 니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드(NBT)Roche11 383 213 001
디메틸 포름아미드시그마 알드리치D4551-500mL
염화칼시그마 알드리치P9541-5KG
중탄산나트륨시그마 알드리치S5761-500G
황산마그네슘시그마 알드리치M7506-2KG
염화칼슘시그마 알드리치C1016-500G
트 륨

참고문헌

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (201....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

세포 운명 결정축 신호 전달 경로유전자 조절 네트워크신호 전달 분석진화 발생 생물학배아 축 연구단순 생물 모델복합 신호 상호작용