지방 유래 기질 세포는 환자 자신의 세포에서 새로운 조직을 엔지니어링하는 데 유용할 수 있습니다. 우리는 골형성 잠재력이 증가된 인간 지방 유래 기질 세포(ASC)의 하위 집단을 분리하기 위한 프로토콜을 제시한 다음 in vivo calvarial healing assay에서 세포를 적용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
침습성 암, 주요 부상 및 감염은 환자 자신의 몸에서 이미 존재하는 뼈로 재건하기에는 너무 큰 뼈 결함을 유발할 수 있습니다. 환자 자신의 세포를 사용하여 새로운 뼈를 성장시킬 수 있는 능력은 본래 뼈를 적출하는 병적 상태 없이 뼈 결손물을 적절한 조직으로 채울 수 있게 할 것입니다. 지방 유래 기질 세포(ASC)를 조직 공학의 원천으로 사용하는 것에 관심이 있는 이유는 이러한 세포가 풍부한 공급원, 즉 환자 자신의 지방 조직에서 얻어지기 때문입니다. 그러나 ASC는 이질적인 모집단이며 일부 하위 모집단은 다른 모집단보다 이 응용 프로그램에서 더 효과적일 수 있습니다. ASC의 가장 골형성 집단을 분리하면 뼈 공학 프로세스의 효율성과 효과를 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜에서 ASC는 인간 기증자의 피하 지방 조직에서 얻습니다. 마커 BMPR-IB를 발현하는 ASC의 하위 모집단은 FACS를 사용하여 분리됩니다. 그런 다음 이러한 세포를 in vivo calvarial defect healing assay에 적용하고 분류되지 않은 세포에 비해 향상된 골형성 재생 잠재력을 갖는 것으로 밝혀졌습니다.
서론
손상, 감염 또는 경부암 인한 주요 골 결손 환자의 회복 및 삶의 질에 큰 영향을 미친다. 다른 기술은 환자의 몸으로부터 뼈 건강 이러한 결함을 채우기 위해 존재하지만,이 이동은 자체 이환율과 합병증 1, 2, 3의 위험도를 전달한다. 또한, 일부 결함이 충분한 기증자 뼈 결함을 채우기 위해 사용할 수없는 너무 크거나 복잡하다. 보철 장치는 뼈 결함을 작성을위한 잠재적 인 옵션이 있지만 이러한 감염 위험, 하드웨어 오류 및 이물 반응 (4) 등 여러 가지 단점과 연결되어 있습니다.
이 때문에, 환자 자신의 세포를 이용한 생물학적 5 골 대체재 공학 가능성에 관심이있다. 지방 유래 기질 세포 (의 ASC)이들은 환자 자신의 지방 조직에서 풍부하게 가능하고 새로운 뼈 조직 (6, 7)를 생성하여 뼈의 결함을 치유 할 수있는 능력을 입증하기 때문에이 애플리케이션에 대한 가능성을 갖는다. 세포의 ASC는 여러 다양한 연구 집단은 특정 세포 표면 마커에 대한 선택하는 향상된 골 형성 활성 (8, 9)와 세포 집단을 생산할 수 있음을 보여 주었다이다. 가장 조골 전위의 ASC를 선택하면 이들 세포 시드 발판 큰 골 결손을 재생할 수있는 가능성을 증가시킬 것이다.
뼈 형태 형성 단백질 (BMP) 시그널링은 골 형성 분화의 ASC (10) 및 (11)에서 골 형성에 중요한 것으로 알려진 BMP 수용체 타입 IB (BMPR-IB)를 조절하는 매우 중요하다. 최근에, 우리는 수 b BMPR-IB의 표현을 보여 주었다전자는 강화 된 골 형성 활동 (12)의 ASC를 위해 선택하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 생체 내 두개골 결손 모델을 사용하여 골 형성 활동의 분석 뒤에 인간 지방에서의 ASC를 BMPR이-IB가 발현의 분리를위한 프로토콜을 보여줍니다.
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프로토콜
참고 : 샘플 동의를 주었다 환자를 얻었다. 모든 프로토콜을 검토하고 적절한 스탠포드 대학의 임상 시험 심사위원회의 승인을했다. 인간의 조직과 세포를 처리하는 동안, 항상 당신의 기관에 의해 지정된, 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2)주의 사항을 준수합니다.
시약 1. 준비
- FACS 버퍼를 준비 : 10 ML의 FBS, 188 5 ㎖ 폴록 사머 500 mL의 멸균 인산 완충 생리 식염수 5 mL의 펜 연쇄상 구균 (PBS)를 추가합니다.
- 혼합물을 소화 준비 : 0.375 g C.의 hemolyticum의 콜라게나 제 II 형 분말과 5 ㎖ 폴록 사머 멸균 199 / EBSS 매체 (188) 500 mL를 넣고.
- 표준 매체를 준비 : 50 ML의 FBS 500 mL를 둘 베코의 변형 이글 중간에 5 mL의 펜 연쇄상 구균을 추가합니다.
2. 수확과의 ASC의 분리
참고 : 적절한 기관 승인이 인체 조직을 사용하는 및 분리 시간 동안 제자리에 있는지 확인잃어버린 줄기 세포. 인간의 복부를 확보 측면에, 또는 선택 과목 지방 흡입 수술을받은 건강한 기증자로부터 피하 지방을 허벅지. 플라스틱 흡입 용기에 지방을 유지합니다.
- 원래 플라스틱 용기에 지방에 : 1 비율로 1 멸균 PBS를 추가합니다. (500 ㎖ 지방이 존재하는 경우, 500 ㎖의 PBS를 추가). 30 초 동안 부드러운 교반 혼합. 수층 흡인에 부착 된 10 mL의 플라스틱 피펫 수층을 하부 (도 1), 그리고, 흡에 정착 폐기 할 수있다.
- 대형 플라스틱 용기에 지방을 가만히 따르다하고 1 혼합물을 소화 추가 : 1의 비율. 용기를 닫고 70 % 에탄올로 외부를 청소합니다. 파라핀 필름으로 뚜껑을 밀봉.
- 30 분 동안 37 ℃에서 180 rpm에서 오비탈 진탕 컨테이너 선동.
- : 1 비율로 1 표준 매체를 추가하여 소화를 중화. (1,000 mL의 지방 혼합물이있는 경우, 1,000 mL로에게 표준 매체를 추가).
- 동일하게 (25)의 짝수로 액을 분배0 mL의 플라스틱 원뿔 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 4 ℃에서 20 분 동안 300 XG에 혼합물
- 뜨는을 대기음 그대로 펠렛을 떠날주의하십시오. 각 원뿔 튜브 5 mL의 표준 매체를 Resuspend 펠릿.
- 한 50ml의 원추형 원심 분리 튜브에 100 미크론 필터를 통해 현탁액을 필터. 그런 다음, 4 ℃에서 15 분 동안 300 XG에 원심 분리기.
- 상등액을 흡인하고 5 ㎖ 실온 RBC 용해 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 혼합물을 실온에서 15 분 (RT) 300 XG에서 원심 분리하여 실온에서 5 분 동안 방치시키고.
- 뜨는을 대기음 15 mL의 표준 매체에 펠렛을 재현 탁. 다시 한 50㎖ 원추형 원심 분리 튜브에 100 미크론 필터를 통해 필터링.
- 새로운 50 ML 원뿔에서, 밀도 기반의 분리 (시약의 목록 참조)을 위해 설계된 15 ML의 polysucrose 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 다음에, 45 ° 각도로 튜브를 들고 신중 측에 세포를 피펫튜브 polysucrose 솔루션의 상단에있는 세포 현탁액은 부드럽게 층 (그림 2) 그래서.
주 : 용액의 표면에 피펫 세포에 중요하다. 이 돌이킬 수없는 혼합물을 생성하므로 세포의 현탁액에 polysucrose 솔루션을 추가하지 마십시오. 마찬가지로, polysucrose 솔루션의 중심에 세포를 피펫하지 않습니다. - 실온에서 10 분 동안 300 XG에이 혼합물을 원심 분리기. 낮은 가속 사용 (2 - 10 명 중 3)이 단계 0으로 원심 분리기의 브레이크 기능을 설정합니다.
참고 : 중간에 흐림, 바닥에 분명, 연어 색의 상단에 : 세 가지 레이어가 표시됩니다. 중간 계층은 관심의 세포가 포함되어 있습니다. - 10 mL를 피펫을 사용하여 조심스럽게 중간 층을 제거하고 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 전송할 수 있습니다.
주 :이 완전히 중간층의 일부를 남긴다보다 상부 및 하부 층의 일부를 가지고 중간층 전송 과정에서하는 것이 좋다. <리> 혈구를 사용하여 세포를 세어 총 생균 수를 결정합니다.
참고 : 일반적으로 사용 트리 판 블루 세포 계산을 지원하기 위해 0.8 %의 최종 농도로 세포 혼합액에 첨가 하였다. 유력한 살아있는 세포는 파란색 염료를 차지하지 않습니다과 흰색이 나타납니다.
BMPR-IB 양성 세포와 세포 함유 비계의 준비를 위해 정렬 3. FACS
- 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. (2.13 단계에서 수행 된 세포 수에 기초하여) 100 μL 당 백만 세포의 농도로 FACS 완충액에 세포를 재현 탁.
- 라벨 플라스틱 원심 관에 적어도 1 천만 셀로 이동 "BMPR-IB." 별도로 표시된 별도의 플라스틱 원심 분리기 튜브에 100 μL FACS 버퍼에 백만 세포를 전송 "흠." 은 "흠"튜브에 1 mL의 FACS 버퍼를 추가합니다. FACS는 EXPER 부분을 정렬하는 동안 얼음에서 FACS 완충액 세포의 나머지 유지iment가 수행되고있다. 이 세포 레이블 "정렬되지 않은합니다." 컨트롤 나중에 실험에서 이러한를 사용합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 "BMPR-IB '관 형광 항 인간 BMPR-IB 항체의 적절한 양을 추가한다. 항체를 배포 부드럽게 상하 혼합물을 피펫.
참고 : 우리는 1:10 희석에 인간 BMPR-IB / ALK-6 APC - 복합 항체를 사용합니다 (자세한 내용은 시약의 목록 참조). 그러나, 다른 제조업체의 항체는 다른 권장 농도를해야합니다. - 빛을 유지하는 방법으로 얼음 양동이를 커버. 셀 / 항체 혼합물을 30 분 (또는 항체를 제조사의 지시에 따라) 동안 앉아 할 수있다.
주 : 안티 BMPR-IB 항체는 이차 항체를 필요로하는 차 접합 항체 오면, 제조업체의 지시에 따라 이차 항체와 얼음의 별도의 염색 공정을 수행한다. - 양쪽 튜브를 원심 분리기4 ℃에서 5 분 동안 300 XG. 펠렛을 대기음하지 않도록주의, 뜨는을 대기음. 1 ㎖의 FACS 완충액으로 펠렛 세포를 재현 탁. 또 다시 5 분 동안 300 XG에서 튜브를 원심 분리. 조심스럽게 상층 액을 흡인 및 1 mL의 1 백만 세포의 농도로 FACS 완충액에 세포를 재현 탁.
- 새로운 레이블이 유리 FACS 튜브로 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 "BMPR-IB", "흠"및 "정렬되지 않은"세포를 필터링합니다. 세포가 필터에 남아되지 않도록 500 μL FACS 버퍼와 필터를 씻어. 또한 "BMPR-IB 양성"을 표시 두 개의 플라스틱 원심 분리기 튜브에 2 mL의 표준 매체를 추가 "BMPR-IB 음성." FACS 기계에 정렬 된 세포를 수집하기 위해이 두 가지를 사용합니다.
- FACS 기계에서 형광 마커 음의 게이트를 정의하기 위해 흠없는 세포를 사용합니다.
- 100 미크론 노즐 각각 콘 튜브로 정렬 BMPR-IB 양 및 음의 세포를 사용하여표준 매체 이닝. FACS 기계가이 능력이있는 경우 정렬 동안 4 ° C에서 냉각이 튜브를 유지합니다.
참고 : 샤론 외 알에 의해 조브 제 13 조를 참조하십시오. FACS 정렬을위한 우수한 프로토콜. - 혈구를 사용하여, 각각의 튜브에 세포를 계산. 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에서 ""BMPR-IB 양성 "BMPR-IB 음성"및 "정렬되지 않은"튜브를 원심 분리기와 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의, 뜨는을 대기음. 그 후 250 μL 당 백만 세포의 농도를 표준 배지에서 세포를 재현 탁.
- 미리 잘라 4mm PLGA (폴리 [락트산 - 코 - 글리콜 산]) 하이드 록시 아파타이트로 코팅 된 지지체를 얻습니다. 24 웰 플레이트의 우물에 각 발판을 놓습니다. BMPR-IB 양성 정렬되지 않은, 그리고 BMPR-IB 음 (그림 3) : (. 내가합니다 .e, 20 셀) 세 그룹 중 하나에서 세포 현탁액 50 μL 각 발판을 커버.
참고 : 제발소호 등의 알에 의해 조브 제 14 조를 참조하십시오. PLGA 인공 지지체의 구성에 대한 자세한 내용은. - 부분 (골격의 탈수를 방지하기 위해)의 뚜껑 플레이트를 커버하고, 30 분 동안 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 배양한다 표준 배지 주변 빈 웰 채운다.
두개골 결함 및 ACS 함유 비계의 적용 4. 작성
참고 : 적절한 기관 승인이 살아있는 생쥐의 두개골 결함의 생성을 제자리에 있는지 확인합니다. 이 프로토콜은 스탠포드 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
- 이소 플루 란 가스 흡입 또는 주입 지속성 칵테일 마취제를 사용하여 CD-한 누드 마우스를 마취.
- 단독으로 가스를 사용하기 위해, 마취 실에 마우스를 위치시키고이 산소의 흐름을 시작 - 이소 플루 란 2 % 농도 3 L / 분. 마우스는 f를 일단ully 의식, absorbant 패드 따뜻한 물 순환 담요 위에이 발생하기 쉬운 배치하고 산소와 이소 플루 란의 동일한 농도와 마취 코 콘에 그 주둥이를 놓습니다. 조심스럽게 호흡을 모니터링하고 필요에 따라 이소 플루 란의 농도를 조정합니다.
- 전술 한 바와 같이 마취 챔버 내에 마우스를 마취, 주입 된 지속성 마취 칵테일을 사용하고 마취 칵테일 주입. 마취 실에서 마우스를 제거하고 그 행동을 관찰.
참고 : 마우스가 잠시 마취에서하지만 몇 분 내에 나타날 수있다 다시 완전히 주입 마취의 효과에 따라 마취해야합니다. absorbant 패드로 덮여 따뜻한 물 순환 담요에 마우스를 전송합니다.
참고 : 마취 칵테일을 위해, 우리는 생리 식염수에 케타민 10 ㎎ / ㎖과 자일 라진 1 ㎎ / ㎖를 포함하는 혼합물, 복강 전달하는 것이 좋습니다. 이 혼합물의 표준 용량은300 μL 100 ㎎ / ㎏과 자일 라진 10 ㎎ / ㎏을 케타민와 동일합니다 30 g을 마우스합니다. 주 사용 마취제에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. - 마취의 깊이를 결정하기 위해 발가락 핀치 책략을 사용합니다. 이 가볍게 외과 의사에 의해 핀치 때 적절하게 마취 마우스는 발을 철회하지 않습니다.
- 각막의 탈수를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
- 1 ㎎ / ㎏ 부 프레 노르 핀의 SR 피하을 관리 할 수 있습니다.
참고 : 우수한 통증 완화의 수술 결과 이전에 진통을 제공. - 전체 절차 동안 마우스의 호흡 속도를 모니터링한다.
참고 : - / 분 (100) 숨을 제대로 이소 플루 란에서 마취 마우스 (50)의 호흡이 있어야합니다. 증가 된 호흡은 감소 호흡 속도는 마취가 너무 깊은 나타낼 수 있습니다 동안 마취가 너무 빛을 나타냅니다.
- 포비돈 - IOD와 두개골의 지느러미 측면의 피부를 준비오프라인 용액을 70 % 에탄올 세번 하였다. 노출 수술 부위를 떠나, 멸균 커튼으로 드레이프.
주 : 멸균 수술 장갑을 착용하고 절차를 수행하는 동안 무균 기술을 유지한다. 그러한 멸균 드레이프와 멸균 도구로 멸균 표면과 객체를 터치합니다. 보조 조명, 오픈 봉합 패킷 등을 조정 한 - 15 블레이드 메스를 사용하여 지느러미 두개골의 대부분에 걸쳐 연장 시상 중간 선 절개를합니다. 미세 톱니 집게를 사용하여 오른쪽 마루 뼈를 노출시키는 절개 오른쪽의 피부를 철회.
- 멸균 4mm 다이아몬드 코팅 트레 드릴 비트와 드릴을 이용하여 마루 뼈 통해 결함 드릴. 경막 층에 뼈 과거의 결함을 연장하지 마십시오. (그림 4)
- 결함에 발판을 놓은 다음 나일론 봉합사를 실행하는 피부 절개를 닫습니다.
- 마우스를 모니터링하고 표준 수술 후 치료 a를 제공제도적 지침에 ccording.
- 그것을 복구하는 동안 깨끗한 케이지 내부에 깨끗한 종이 타월에 마우스를 유지합니다. 케이지의 절반은 따뜻한 물 순환 담요 위에 배치되어야하고, 마우스는 처음이 반으로 배치해야합니다.
- 이 ambulate하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스 방치하지 마십시오. 완전히 복구 될 때까지 다른 마우스와 케이지에 수술을 시행 한 마우스를 반환하지 않습니다.
- 테스트 할 각 지지체의 새로운 마우스로 위의 단계를 반복합니다. 뜨거운 구슬 살균기 또는 다른 적절한 방법을 사용하여 수술 사이에 수술 도구를 소독.
- 얼마 후 절차 후 2, 4, 6 및 8 주째에, 두개골 폐쇄 결함 비율을 분석하는 마이크로 CT 스캔을 사용한다.
참고 : 리바이스 등의 알에 의해 문서를 참조하십시오. 두개골 결함의 마이크로 CT 스캔에 대한 설명 (6). - 경우 실험 공단 인TE 클린 안락사 챔버에 넣어서 2 L / min의 속도로 챔버 내로 탄산 가스의 유동을 시작하여 마우스를 안락사. 호흡이 완전히 (후 약 10 분)을 중단 한 후 안락사를 확인하기 위해 자궁 경부 전위를 수행합니다.
- 실험 완료 후 선택적으로, 사용 단면 조직 학적 염색 결함 내 골 형성을 평가.
참고 : McArdle 등의 알에 의해 문서를 참조하십시오. 뼈를 준비 자세한 내용은 12 조직학에 대한 표본. 조직 학적 및 염색 기술 검토를 들어, 외과 병리학 (15)의 수동으로 조직 학적 설명서를 참조하십시오.
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결과
마이크로 CT 명확하게 두개골 결함을 보여줍니다 수술 당일에 이루어 스캔. 이 때 4mm 결함에 더 증식가 없을 것입니다. 후속 검사는 기준에 비하여 시간 경과에 따른 결함의 크기를 정량화하는 시간에 걸쳐 얻어진다. BMPR-IB-및 정렬되지 않은 세포 (그림 5)과 비교했을 때 BMPR-IB + 세포와 시드 결함은 결함의보다 신속한 폐쇄를 입증해야한다. 또한, 결함을 포함 두개골 부분 탈회 할 수 있고, 표준 방법을 사용하여 12 조직학을 위해 처리된다. Movat의 pentachrome 얼룩 염색 섹션은 다른 세포 집단 (그림 6)과 비교 BMPR-IB 세포로 치료 결함에 큰 골 재생을 공개합니다.
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토론
프로토콜 내에서 중요한 단계
의 ASC의 수확하는 동안, 중요한 단계는 콜라겐과 지방의 적절한 소화합니다. 부적절한 소화의 ASC의 낮은 수율 발생합니다. BMPR-IB + 세포를 FACS 정렬 동안 신중 양성하는 게이트를 정의하는 것이 중요하다. 너무 느슨하게 게이트를 정의하는 것은 순수하지 정렬 인구의 원인이 될 수 있습니다. 두개골 결함의 생성 동안, 두개골의 뼈를 통해 결함을 드릴하지만, 뇌경막에 진출하지 않는 것이 중요합니다. 이 넘치 출혈과 동물의 안락사를 필요로합니다 뇌, 노출의 원인이됩니다.
수정 및 문제 해결
두개골 결함 수술을위한 마취에 관해서는, 우리 연구소는 흡입 된 이소 플루 란을 사용하는 것을 선호하지만, 또 다른 옵션은 복강 일반 사에 최종 케타민 10 ㎎ / ㎖의 농도 및 자일 라진 1 ㎎ / ㎖를 포함하는 혼합물을 주입하는 것입니다선. 이 혼합물의 표준 ...
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공개 사항
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감사의 글
C.D.M.은 ACS(American College of Surgeons) 레지던트 연구 장학금의 지원을 받았습니다.M.S.H.는 CIRM(California Institute for Regenerative Medicine) 임상 펠로우 교육 보조금 TG2-01159의 지원을 받았습니다. M.S.H., H.P.L. 및 M.T.L.은 미국 악안면 외과 학회(ASMS)/악안면 외과 재단(MSF) 연구 보조금 상의 지원을 받았습니다. H.P.L.은 NIH 보조금 R01 GM087609과 Anthony Shu를 기리기 위해 Ingrid Lai와 Bill Shu의 선물로 지원되었습니다. H.P.L. 및 M.T.L.은 Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine과 The Oak Foundation의 지원을 받았습니다. M.T.L.은 NIH 보조금 U01 HL099776, R01 DE021683-01 및 RC2 DE020771의 지원을 받았습니다. D.C.W.는 NIH 보조금 1K08DE024269, Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine 및 Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award의 지원을 받았습니다.
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재료
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| 100 마이크론 셀 스트레이너 | Falcon | 352360 | |
| 15 블레이드 메스 | Miltex | 4-515 | |
| 24 웰 플레이트 | Corning | 3524 | |
| 40 마이크론 셀 스트레이너 | Falcon | 352340 | |
| 50 mL 원추형 원심분리기 튜브 | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon 나일론 봉합사, 18", P-3 바늘, | Ethicon | 1698G | |
| Anti-BMPR-IB 1차 항체 | R& D 시스템 | FAB5051A | |
| BioGel PI 수술용 장갑 | Mö lnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| 부프레노르핀 SR | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo 니들 드라이버 | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 누드 마우스 | Charles River | 086 | |
| 콜라겐분해효소 II형 분말 | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM 매체 | Gibco | 10564-011 | |
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| 드릴: Z500 브러시리스 마이크로모터 | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gicbo | 10437-077 | |
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| Fisherbrand 멸균 면 거즈 패드, 4" x 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| 난방 패드 | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS 매체 | GE 생명과학 | SH30253.01 | |
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| RBC 용해 버퍼 | 시그마 | 11814389001 | |
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참고문헌
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