우리는 마우스 Wolffian 덕트 (WD)의 분리 및 배양 방법을 제시한다. 우리는 또한 형광 태그 항체 배양 / 갓 격리 WDS의 전체 마운트 면역 염색에 대한 자세한 절차를 보여줍니다. 함께, 이러한 기술은 WD의 개발, 코일 링, 및 분화에 대한 연구를 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
두발 형태 형성은 남성 생식 기관을 포함한 대부분의 포유 동물의 개발을위한 기본 요건이다. 부고환, 남성 생식 기관의 중요한 부분은 기억 정자 성숙 및 전송에 대한 책임이있다. 성인 부고환은 Wolffian 덕트 (WD)로 알려진 단순하고 직선 배아 전구체로부터 개발하는 높은 코일 튜브입니다. 고환에서 정자가 난자와 수정 할 수 없습니다로 부고환의 적절한 코일 링은 남성 불임 필수적이다. 그러나, 부고환 개발 및 권취를 담당하는 메카니즘은 부분적으로 전체 기관 배양 및 촬상 방법의 부족으로 불분명. 본 연구에서, 우리는 더 나은 다른 관형 기관을 연구하기 위해 적용될 수있다 WD의 권취 및 발전 과정을 시각화 관내 배양 시스템 및 전체 마운트 면역 형광 프로토콜을 설명한다.
서론
남성 생식은 주로 고환 이루어져 생식 세포의 발생과 분화 및 정자의 성숙, 전송 및 저장을 위해 요구되는 복잡한 도관 시스템 사이트. 부고환은 정관과 고환 및 생식 세포 (1)의 후 고환 발달과 성숙에 주로 관여를 연결하는 관 모양의 기관이다. 고도로 꼬인 성인 마우스 부고환 간단한 직선 전구체 튜브 Wolffian 덕트 (WD) (1)로부터 발생한다. 정자 여성 생식 세포이 기름지게하는 능력을 획득하는 부고환 복잡하고 코일 구조가 필수적이다. 남성 불임에 대한 이러한 중요한 장기가 형태로 개발하고 얻는 방법을 잘 이해되지 않는다. 다양한 신호 경로는 예 Wnt 신호 전달 경로 및 경로 3,4- 5 시그널링 안드로겐으로 WD의 발달에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 우리의 최근 작품은 벨의 요구를 설립했다고급의 Wnt는 태아 개발 4시 WD의 코일 링에 대한 시그널링. 그러나, 상기 연구는 부고환 내 상피 및 간질 세포 생후 부고환 권취, 세포 분화 및 세포 간 통신에 관련된 메커니즘을 이해하기 위해 필요하다.
유전자 변형 마우스 모델은 다양한 기관 시스템 (6)의 개발 및 질병을 기본 분자 메커니즘의 식별 ....
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프로토콜
동물 관리 및 실험 절차는 뉴 사우스 웨일즈 동물 연구 법, 뉴 사우스 웨일즈 동물 연구 규제 및 관리를위한 호주 코드와 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침에 따라 수행하고 확인 하였다 과학적 목적을 위해 동물의 사용합니다. 마우스에 착수 모든 절차는 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회에 의해 승인되었다.
1 시간 짝짓기
- 쌍 6~8주 세 남성 및 일광 사이클이 종료 직전 암컷 마우스.
- 질 플러그의 존재 이른 아침 (또는 8.00 이전 AM), 매일 매일 암컷을 확인합니다. 플러그의 날 0.5 DPC로 간주됩니다.
- (남성)없이 새로운 케이지에 질 플러그 여성을 전송하고 플러그의 날짜를 레이블을 붙입니다.
마우스 배아 생식소 능선 2. 분리
- 마우스 embryon을 분리후술하는 바와 같이 15.5 DPC 임신 여성에서 생식기 IC 리지는 약간의 수정 9에 기재된 바와 같이.
- 임신 한 여성이 오후에 의한 임신의 다음날에 들어갈 것으로 간주하는 시간으로 정오 전에 절개를 수행합니다.
- 자궁 경부 전위를 사용하여 15.5 DPC 임신 여성을 희생 ....
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결과
개발하는 동안, WD는 단순한 직선 튜브는 매우 복잡하고 코일 덕트로 변환되는 것을 특징으로 상당한 변화를 겪는다. 전술 한 방법을 사용하여, WDS는 배양 조건에서 유사한 변화를 겪는다. 여기에서 우리는 3 일 (그림 3) 배양 WDS의 결과를 보여 주었다. WD의 형태 형성에 관여하는 분자 메커니즘을 해부 배양액 다른 신호 경로를 표적 억제제 및 활성제로 보충 될 수있다. 그림 3C 특정 억제제, IWR1 (10) 시그널링의 Wnt의 존재 문화의 3 일 후 WD를 uncoiled 보여줍니다. 화살표 (그림 3B) 코일과 코일 WD (그림 3C)의 억제에 Wnt 신호 결과의 억제를 나타내는 WDS (도 3a 및 C)를 uncoiled로 표시 한. 따라서,이 배양 시스템 (STABLE) 중 관련된 분자 메커니즘을 절개하는데 사용.......
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토론
장기 배양 시스템은 기존의 세포 배양 시스템에 비해 많은 장점을 갖는다. 이 시스템은 서로 다른 세포 유형 사이의 원래 구조 관계와 상호 작용을 유지합니다. 이는 생체 내 시스템에서 모방하고 틈새 계수가없는 세포 배양 과정보다 더 정확한 정보를 제공한다. 기관 배양 물 시스템의 사용은 심지어 전체 동물을 사용하여보다 이점이있다. 이 전체 동물, 쉽게 관리 및 기관 배양 물 시스템의 유지 보수 등을 또한 사용의 높은 비용을 포함하는 다양한 약학 제 또는 약물 절연 / 배양 기관 및 기관의 직접 반응하지 전신 일 수를 테스트 할 수있다 공부했다.
배아 WDS의 성공적인 문화를 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 손상된 조직이 잘 성장하고 낭포 성이되지 않는 조직은 자신의 무결성을 손상시키지 않고 신중하게 수집해야합니다. 의 상단에 미디어의 초과필터는 WDS의 낭포 성 성장으로 이어집니다. 우리는 어떤 오염없이 조직 문화 후드 외부 .......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
우리는이 원고의 중요한 읽기 위해 부인과 종양학 그룹의 구성원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 부분적으로 국립 보건 의료 연구위원회, 호주 연구위원회, 그리고 암 연구소 NSW (PST)에서 자금을 지원합니다. MK 뉴캐슬 대학원 연구 활동의 대학을받는 사람입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 24웰 플레이트 | Corning, USA | 3524 | 는 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다 |
| . Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | 다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다 |
| Dulbecco의 Modified Eagle Medium : 영양소 혼합물 F-12 (DMEM / F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 ° 사용 전 C 수욕 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, 호주 | SH30034.02 | 배양 매체에 사용되는 10% FBS |
| -글루타민 | GE Healthcare Life Sciences, 미국 | SH30034.01 | 1% 농도 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% 농도 |
| Whatman Nuclepore 폴리카보네이트 Track-Etch를 사용했습니다. | Whatman, 미국 | 110409 | 멤브레인 (0.8 &마이크로; m) |
| IWR1 | 시그마, 미국 | 10161-5mg | 100 &마이크로; M 농도 |
| 파라 포름 알데히드 (PFA) | 전자 현미경 과학, 미국 | 15710 | 16 % 재고, 4 %는 PBS에 사용됩니다. 독성 - 장갑을 착용하고 싱크대에 버릴 수 없습니다 |
| 에탄올 | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, milliQ 물로 25, 50 및 75%를 만듭니다. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | 점성이 있어 |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | 분배하는 동안 매우 점성이 있고 조심스럽게 |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | 은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다 |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | 다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다 |
| 염화나트륨 | Thermo Scientific Fisher, 미국 | 465-500g | 은 다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다 |
| Cytokeratin8 / Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1 : 250 차단 완충액 |
| 활성 및 베타; 카테닌 | 세포 신호 기술, 미국 | D13A1 | 1:200 차단 버퍼 |
| 인산-히스톤 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 차단 버퍼 |
| Alexa488 염소 안티-토끼 IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, 미국 | 111-545-047 | 1:250 차단 버퍼 |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, 미국 | 112-585-072 | 1:250 차단 버퍼 |
| 글리세롤 | Thermo Fisher Scientific, 미국 | 242-500ml | 는 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다 |
| n-프로필 갈레이트 | Sigma, USA | 2370-2 | |
| -(4-amidinophenyl)-1H -인돌-6-카르복사미딘 (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | 핵산(DNA) |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | Thermo Fisher 사이언티픽, 미국 | 2225-500ml | 솔벤트 |
| 커버 슬립 (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP- |
참고문헌
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal develop....
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