가속된 동맥 경화의 토끼 모델: 장 골 동맥 풍선 상해의 방법 론 적 관점

Summary

동맥 경화 증의 동물 모델 메커니즘을 이해 하 고 패 개발 또는 파열, 산업화 된 세계에서 죽음의 주요 원인이 방지 하기 위해 새로운 접근을 조사 하기 위해 필수적입니다. 이 프로토콜 풍선 부상과 콜레스테롤 풍부한 다이어트의 조합을 사용 하 여 토끼 장 골 동맥에 동맥 경 화성 플 라크를 유도.

Abstract

급성 관상 동맥 증후군 관상동맥 폐색 동맥 경 화성 플 라크 개발 및 파열에서에서 유래한 공업화 한 세계에서 사망의 주요 원인입니다. 뉴질랜드 화이트 (NZW) 토끼는 동맥 경화 증의 연구를 위한 동물 모델로 서 널리 사용 됩니다. 그들은 개발 atherogenic 다이어트; 먹 일 때 자연 스러운 병 변 그러나,이 4-8 개월의 긴 시간이 필요합니다. 더욱 강화 하 고 가속 atherogenesis, atherogenic 다이어트와 기계적 내 피 상해는 종종 사용 됩니다. 유도 하는 토끼의 동맥 경 화성 플 라크에 대 한 제시 절차 atherogenic 다이어트 먹이 NZW 토끼의 왼쪽된 장 골 동맥에 피를 방해 하는 풍선 카 테 터를 사용 합니다. 풍선 카 테 터로 인 한 이러한 기계적 손상 시간 종속 방식에서 neointimal 지질 축적을 시작 하는 염증 성 반응의 사슬을 유도 합니다. 동맥 경 화성 플 라크 풍선 부상 쇼 neointimal 두껍게 광범위 한 지질 침투와 높은 평활 근 셀 내용, 대 식 세포의 존재에 따라 거품 세포 파생. 이 기술은 간단 하 고, 재현 고 제어 길이 장 골 동맥 내 플 라크를 생성 한다. 모든 절차는 20-30 분 이내 완료 됩니다. 절차는 낮은 사망률과 안전 하며 또한 상당한 내 병 변 취득에 높은 성공. 풍선 카 테 터의 절차 2 주 이내에 동맥 경화 동맥 상해 결과 유도 한다. 질병 병리학을 조사를 위해이 모델을 사용할 수 있습니다 진단 이미징 새로운 치료 전략을 평가 하 고.

Introduction

취약 한 동맥 경 화성 플 라크의 파열¹선진국 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 지난 수 십년 동안 연구 패 진행에 관련 된 여러 분자 및 세포 메커니즘을 펼쳐는, 뿐만 아니라 질병 진행의 복잡 한 메커니즘을 해명 뿐만 아니라 새로운 테스트 노력 필요 아직도 계속 치료 접근 한다. 여러 동물 모델 연구는 동맥 경화를 제안 되었습니다. 유전자 조작, 콜레스테롤 먹이 또는 기계적 피 상해는 쥐, 토끼 또는 minipigs를 포함 하 여 동맥 경화의 가장 동물 모델에서 공유 하는 표준 전략. 이러한 가운데, NZW 토끼에 민감합니다 콜레스테롤 다이어트 동안 정상적인 쥐와 생쥐 마음이 크게 식이 콜레스테롤^2,,34를 흡수 하지 않습니다. 토끼는 저절로 대동맥 병 변 세포 콜레스테롤 풍부한 다이어트^5,6먹 일 때 일부 섬유 구성 요소와 함께 풍부한 개발. 그러나, 동맥 경 화성 plaquesby 콜레스테롤 다이어트 혼자^6,7 먹이 유도 하기 위해 4-8 개월의 긴 준비 시간 실험 설정의 대부분을 위한 주요 결점은. 상대적으로 짧은 시간에 병 변을 유발에 대 한 추구, 높은 콜레스테롤 다이어트와 풍선 상해의 조합 Baumgarter 및 Studer⁸에 의해 개발 되었습니다. 이 기술은의 전반적인 목표는 2 주 이내에 콜레스테롤 토끼에 거품 세포 (인간에서 지방 조 흔과 유사)의 구성 된 동맥 경 화성 플 라크를 유도 하는 것입니다. 현재 기술 NZW 노인 토끼의 장 골 동맥으로 고급 풍선 카 테 터를 사용 하 여 Baumgarter의 방법에 따라 동맥 벽 상해의 절차를 설명 합니다.

콜레스테롤 풍부한 음식과 함께 부상 풍선 유도 드 endothelialization에서 동맥 경화 이어질 것입니다. 풍선 부상 동맥 경 화성 병 변 형성을 촉진 하 고 균일 한 크기와 분포의 플 라크를 생성 합니다. 내 두껍게 상해 다음 몇 일 이내에 시간과 내 세포 침투 시작의 기간 동안 증가 합니다. 상당한 대 식 세포와 지방 줄무늬 풍선 상해의 7-10 일 후에 나타나기 시작 하 고 미국 심장 협회에서 분류에 따라 병 변의 유형 II로 표시 됩니다. 토끼 풍선 부상은 종종 플 라크 구성 공부 대동맥에서 수행 됩니다. Neointimal 내 피 세포 접착 분자의 높은 수준의 표현. 플 라크 중간 절 개 및 adventitial 변화에 연관 됩니다. 동맥 경 화성 병 변 지질, 확산 부드러운 근육 세포 (SMCs), 교원 질 섬유 및 재생성된 endothelium 아래에 축적 하 고 자연에서 주로 유형 II는 염증 세포의 구성 됩니다. 토끼 플 라크의 토폴로지 배포 원칙에 인간 aortas ^9,10 에 보고 유사 했다, 대동맥 장 골 동맥에 비해 크기가 큰 큰 길이에서 플 라크를 생산할 것 이라고. 그러나, 토끼에 있는 아 테 롬의 사이트로 장 골 동맥을 사용 하 여의 주요 장점은 접근, 인간 관상 동맥¹¹, 균일 한 병 변 개발¹², 높은 조직 요소 근육 콘텐츠에서 유사성은 활동¹³ 그리고 형태학 및 angiographic 끝점을 상업적으로 제조 된 소자의 평가 허용 하는 인간의 관상 동맥에 비해 일관 된 배 차원. 침략과 비-침략 적 방법 살아있는 동물에서 토끼 장 골 동맥에 플 라크를 분석 조사 있다. 이전 보고서 자기 공명 또한 2.35 테슬라 미스터 시스템 ¹⁴ 의 도움으로 (MRI를) 영상 사용 설명, 혈관 내 초음파 (IVUS) 또는 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 카 적당 수 이미지에 적용 토끼 장 골 동맥에 동맥 경 화성 플 라크입니다. 장 골 동맥은 초음파 이미징 고해상도 진단법을 사용 하는 경우 그리고 대동맥이 기술 또한 탐험 수 있습니다.

지난 10 년간에서이 토끼 모델 풍선 부상의 더욱 패 진행¹⁵, 플 라크 회귀¹⁶의 메커니즘을 이해 하 있었습니다. 새로운 치료제 스타 틴, 표준 antiplatelet 에이전트, 항 산화 제^17,18 everolimus 같은 약물 방출 스 텐트 등의 영향을 연구 하는 모델 사용 되었습니다 또한, 또는 zotarolimus 방출 스텐^19,20 neointimal 두껍게. 이 모델은 또한 혈관 내 영상 카 테 터²¹이미징 근 적외선 형광의 조사에 사용 되었습니다.

Protocol

이 실험 프로토콜 Cantonal 수의 사무실, Fribourg는 스위스 연방 수의 사무실, 스위스 (FR 2015/58)에 의해 승인 되었습니다.

참고: 남성 NZW 토끼 2.8 3.2 k g 사이 무게 사용 되었다. 동물 (12 h 빛 및 어두운 주기, ad libitum 물과 식량 제공) 기존의 조건 하에서 보관 되어 있었다. 풍선 노출 전에 동물 1 주 동안 그들은 정상적인 차 다이어트 지 루 했다에 대 한 acclimated 했다. 순응의 1 주 후 토끼 높은 지방 (8.6%)의 구성 하는 atherogenic 다이어트에 전환 했다 하 고 포화 지방산 205 mg/kg (1%) 콜레스테롤 다이어트 전체 연구 기간에 대 한. 왼쪽 장 골 동맥에서 풍선 손상 다이어트 개시 후 1 주 수행 및 동물 풍선 부상 4 주 또는 2 주 후 희생 되었다.

1. 수술 전 절차

1. 유리 구슬 소독 기 또는 다른 적합 한 악기와 함께 사용 하기 전에 모든 수술 기구를 소독.
2. 준비 풍선 카 테 터 어셈블리를 확인 하 고.
   1. 첨부 1 mL luer 잠금 주사기 luer 잠금 부분 풍선 카 테 터의 정상적인 염 분으로 가득합니다. 신중 하 게 덫을 놓은 공기의 부재에 대 한 모니터링 합니다. 누수를 확인 하 고 주사기의 플런저를 눌러 적절 한 풍선 인플레이션 확인.
3. 토끼의 무게 및 37 thermopad 설정 ° c.
4. Buprenorphine 솔루션을 사용 하 여 0.3 밀리 그램의 농도에 / ml. 0.01 mg/kg의 복용량을 피하 주사 하.
5. Anesthetize 10-15 분에 대 한 유도 실에서 5 L/분 O ₂와 5 %isoflurane 토끼
6. 외과 플랫폼에 계속 생리대에 마 취 토끼를 놓습니다. 패치 및 온도, 호흡, 심전도 모니터링 하는 클립.
7. 적합 한 마 취 기계에 연결 된 얼굴 마스크를 토끼의 주 둥이 연결 합니다. 마 취와 isoflurane 2.5 L/min O ₂ (4.0%)를 유지 합니다. 적절 한 anesthetization (개 그, pinnae 반사의 손실 및 근육의 부족으로 표시)를 확인 하십시오.
8. 안과 연 고는 각 막 건조 하지 않도록 두 눈에 적용 됩니다. 노출만 더 낮은 사지와 토끼를 메 마른 외과 시트와 함께 드러 워 진.

2. 수술 프로토콜

1. 동물 발기를 사용 하 여 무릎 관절 바로 아래 복 부 영역에서 제거.
2. 적당 한 살 균 제는 피부를 청소 하 고 느슨한 머리를 제거 하는 영역을 면봉.
3. Saphenous 동맥을 찾아서 메스를 사용 하 여 길이에 약 1.5 ㎝의 작은 피부 절 개를 하 게.
4. 대 퇴 정 맥, 대 퇴 신경 손상 없이 작은 곡선된 겸 자도 saphenous 동맥의 작은 부분을 노출.
5. Saphenous 동맥 아래 두 개의 느슨한 합자 루프 (5-0 실크) 놓고 한 합자 루프는 동맥의 말 초 끝을 묶어. 장 골 동맥에서 혈액의 흐름을 막으려고 합자 위에 microvascular 클램프 장소.
6. Papaverine 동맥 팽창 하 고 vasospasm을 방지 하기 위해 한 방울 몸에 붙이기도 적용.
7. 묶인된 합자의 도움으로 saphenous 동맥을 올리고 확인 작은 arteriotomy 절 개는 24를 사용 하 여 게이지 바늘.
8. 미세 집게와 절 개 플랩 상승 하 고 천천히 동맥의 루멘으로 정 맥 선택 또는 지도 바늘을 삽입.
9. Saphenous 동맥에 2 프랑스어 Fogarty 동맥 embolectomy 카 테 터를 삽입합니다. 정 맥 선택 및 microvascular 클램프 제거.
10. 6 마크 (20-25 cm)에 해당 하는 위치 약까지 카 테 터를 미리 장 골 분기점 위에 2-5 cm.
11. 1 mL 주사기를 사용 하 여 0.1 mL 정상적인 염 분 또는 6의 공칭 압력에서 풍선을 부 풀 려 ^{16 , 22}에 설명 된 대로 규제 수동 공기 펌프를 사용 하 여 atm.
12. 집게와 풍선 카 테 터를 누른 테 회전 하는 동안 삽입 지점 장 골 arterytoward 통해 6 cm에 의해 다시 끕니다.
13. 주사기의 플런저를 후퇴 하 여 풍선을 수축.
14. 완료 내 피 노출 되도록 단계 2.10 2.13 세 번 반복.
15. 카 테 터를 제거 하 고 출혈을 멈추게 하는 arteriotomy 사이트의 바로 위에 합자 루프를 즉시 넥타이.
16. 상처 주위 적합 한 살 균 모두를 적용 하 고 혈 병을 떨어져 면봉. 5-0 봉합, 피부 절 개를 닫고 povidone-요오드 솔루션 수술 사이트 소독.
17. 2.1에 2.16는 contralateral에 장 골 새로운 카 테 터를 사용 하 여 단계를 반복 하십시오.
18. 눈에서 안과 연 고를 면봉.

3. 수술 치료

1. sulfadoxine 관리 40 mg/kg 및 trimethoprim 8 mg/kg 또는 다른 적합 한 항생제는 수술 직후.
2. 마 취 회복 기간 동안 깨끗 한 압력가 감 금 소에 열 패드를 통해 토끼를 유지.
3. 모니터링 패치 및 클립 제거.
4. 복구 후 자신의 집 새를 토끼를 반환. 주사 피하 buprenorphine 0.05-0.1 mg/kg 게시물-operatively 48 헤 또 다른 2 주 또는 4 주에 대 한 계속 atherogenic 다이어트에 대 한 모든 6-12 h.

4. 조직 수확 및 분석의 패 구성

1. 2 주 (초기 얇은 패)에 대 한 풍선 상해의 3 주 후, 위에서 설명한 대로 isoflurane 비슷한 방식으로 사용 하 여 토끼 anesthetize.
2. 흉 강 열고 intracardial exsanguination에 의해 토끼를 안락사.
3. ²³에 설명 된 대로 장 골 동맥을 분리.
   1. 짧게, 복 부를 열고는 retroperitoneum 노출. 장 골 분기점 쪽으로 대동맥을 추적 하 고 분기점 위에 그것을 넥타이. 조심 스럽게 노출 하 고 격리 두 장 골 동맥 주위 조직을 제거.
4. Dissect 두 장 골 동맥과 버퍼링 차가운 인산 염에 그들을 담가. 집게의 도움으로 혈전을 제거 합니다. 각 장 골 동맥 characterise 걸쳐 동맥 플 라크의 두께를 4-6 세그먼트로 분할.
5. 즉시 형 최적의 절삭 온도 화합물, 포함 된 스냅-동결 액체 질소를 사용 하 여 동맥 세그먼트를 포함 하 고-70 ° C. 준비 5 µ m ²⁴에 설명 된 대로 cryostat를 사용 하 여 두꺼운 섹션에서 그것을 유지.
6. 수행 조직학, 면역 형광 검사 또는 ^{10 , 25}에 설명 된 대로 morphometry, 플 라크 지질 및 세포질 내용에 대 한 얼룩 immunohistochemical.
   참고: 짧게, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 동맥 섹션 린스 하 고 0.2%를 사용 하 여 permeabilize 트리톤. PBS 가진 섹션 린스를 안티 α-SM 걸 (1: 200) 또는 RAM11 항 체 (1: 200) 37 ° C에서 1 시간에 대 한 섹션 2% 소 혈 청 알 부 민 30 분 품에 대 한 비 특정 사이트를 차단 합니다. PBS 가진 섹션 린스 하 고 PBS 37 ° C. 씻어 다시 30 분에 대 한 적절 한 이차 항 체와 그들을 품 어 Hoechst 추가 (5 µ g/mL) 10 분 핵 감지.

Results

장 골 동맥의 풍선 부상 합병증 (그림 1) 없이 성공적으로 수행 되었다. 총 수술 시간 30 분 부상에 대 한 20에서 배열 했다 수행 하나의 장 골 동맥, 및 두 동맥에 대 한 35 ~ 45 분. 토끼 풍선 부상 후 1 시간 이내 복구. 모든 동물 상당한 체중 감소 없이 건강 한 나타났다. 아니 감염, 부 종 또는 동맥 혈전 증 발생 했습니다. 상처 영역 봉합 사이트에서 몇 가지 가벼운 섬유 증 외 정상적 이었다. Atherogenic 다이어트 먹이의 4 주, 다음 토끼 전시 콜레스테롤 혈 증 44 ±의 18 m m/l.

그림 2A, 그림 2E, 그리고 그림 2I 표시 오른쪽 손상 되지 않은 장 골 동맥 (풍선 부상 ...

Discussion

토끼 장 골 동맥 경화 모델은 아 테 롬 연구에서 널리 이용 된다. 이 프로토콜은 토끼 빠르게 자발적인 병 변만 콜레스테롤 다이어트와 함께 개발에 비해 더 심각 하 고 고급 패 개발. 중요 한 것은, 동물 수술에서 신속 하 게 복구합니다.

Atherogenesis 위한 주요 자극은 endothelium 부상 하 고 혈관 벽²⁶distends 풍선 카 테 터로 인 한 기계적 손상 이다. 이 이렇게 대 식 세포 신규 모집 및 지질 축적 때 hypercholestorolemic 다이어트, 혈관 평활 근 세포 이동과 확산, 향상 된 매트릭스와 관련 된 염증으로 특징 개장 응답 유도 합성, 고 시간 종속 패션^15,16에 침략 neointima의 설립. 풍선 카 테 터 삽입 절차의 가장 중요 한 부분입니다. 강제로 삽입 풍선 피하기 위해 주의 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
뉴질랜드 흰 토끼	찰스 리버 연구소, 프랑스	Cre:KBL(NZW)
콜레스테롤이 풍부한 다이어트	Ssniff spezialdiä ten	Ssniff EF K 고지방 및 콜레스테롤
유리 구슬 살균기-Germinator 500	VWR, Leicestershire, UK	101326-488
Fogarty 풍선 색전절제술 카테터, 2 French	Edwards Lifesciences, Switzerland	120602F	일회용
전용 Luer Lock Syringe	Becton, Dickinson and Company, USA	309628
Thermopad Type 226	Solis, Swiss AG	397387
Buprenorphine- Temgesic	Reckitt Benckiser AG, Switzerland	7.68042E+12
Isoflurane	Piramal Critical Care, Inc, Bethlehem, PA 18017	2667-46-7
마취 machine-combi-vet Base 마취 시스템	Rothacher Medical GmbH, 스위스	CV 30-301-A
Cardell touch 수의학 바이탈 사인 모니터	Midmark, Ohio, USA	8013-001
안과 연고-Humigel	Virbac, France
동물 이발기	Aesculap AG, Germany	GT420
소독제-베타딘 용액	MundipharmaMedicalCompany, Switzerland	14671-1203
Dumont #7 Forceps	FST Germany	11274-20
중소형 마이크로가위	Medline International, 스위스, Sà rl	UC4337
미세혈관 클램프	FST, 독일	18051-28
파파베린	ESCA 화학, 스위스	RE 356 803
Vein Pick	Harvard Apparatus, Cambridge, UK	72-4169	일회용
	Laboratorium Dr. G. Bichsel AG, 스위스	1330055
Polysorb 5-0 봉합사	Covidien AG, 스위스	UL 202	모노필라멘트
Sulfadoxine 및 Trimethoprim-Trimetazol	Werner Stricker AG, 스위스	Swissmedic Nr. 50'361
방부제-octenisept	Schü LKE & Mayr AG, 스위스	GTIN: 4032651214068
인산염 완충 식염수	Roth	1058.1
이소부탄올-2-메틸부탄	Sigma-Aldrich, 스위스	M32631-1L
최적 절삭 온도 화합물-Tissue-Tek	VWR Chemicals, 벨기에	25608-930
저온 유지 장치	Leica, Glattbrugg, 스위스	Leica CM1860 UV
유리 슬라이드- Superfrost Plus	Thermo Scientific	4951PLUS4
Mayer's Haematoxylin	Sigma-Aldrich, Switzerland	MHS32-1L
Eosin 0.5% aq.	Sigma-Aldrich, 스위스	HT110232-1L
오일 레드 O	Sigma-Aldrich, 스위스	O0625-25G
α-평활근 액틴 항체	Abcam, UK.	ab7817
대식세포 클론 RAM11 항체	DAKO, 스위스	M063301
Hoechst	Abcam, 영국.	ab145596
Goat polyclonal Secondary 항체 (Chromeo 546)	Abcam, UK.	ab60316
Alexa Fluor 488/547	Abcam, 영국.
글리세르겔 장착 매체, 수성	DAKO, 스위스	C056330
Movat 펜타크롬 염색용 헤마톡실린	Sigma-Aldrich, 스위스	H3136-25G
Movat 펜타크롬 염색용 염화철	Sigma-Aldrich, 스위스	157740-100G
Movat 염색용 요오드	Sigma-Aldrich, 스위스	207772-100G
Movat 펜타크롬 염색용 요오드화 칼륨	Sigma-Aldrich, 스위스	60400-100G-F
Movat 염색용 알시안 블루	Sigma-Aldrich, 스위스	A5268-10G
Movat 펜타크롬 염색용 강암	Sigma-Aldrich, 스위스	320145-500ML
Movat 펜타크롬 염색용 브릴리언트 크로세인 MOO	Sigma-Aldrich, 스위스	210757-50G
Movat 펜타크롬 염색 용 산 Fuchsin	Sigma-Aldrich, 스위스	F8129-50G
Movat 펜타크롬 염색 용 티오 황산	나트륨 Sigma-Aldrich, 스위스	72049-250G
Movat 펜타 크롬 염색 용 포스 포 텅스텐 산	Sigma-Aldrich, 스위스	79690-100G
Crocin Movat 펜타 크롬 용 크로신 염색	Sigma-Aldrich, 스위스	17304-5G
EUKITT for Movat 펜타크롬 염색	Sigma-Aldrich, 스위스	03989-100ML