Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

Summary

식물 세포 연결을 plasmodesmata (Pd), 역할 중앙 식물 생리학, 식물 바이러스 상호 작용. Pd 교통 위험은 신호 단백질 경찰을 직접 분류 하 고 있다. 그러나, 이러한 시퀀스에 대 한 우리의 지식을 초기 단계에서 아직도 이다. 우리는 Pd 대상 단백질에 Pd 지역화 신호를 식별 하는 전략을 설명 합니다.

Abstract

Plasmodesmata (Pd)는 셀 연결 게이트웨이 통해 크고 작은 분자는 식물 세포 사이 수송으로 작동. 생물 고분자, 그러한 단백질의 셀 전송에 특정 대상 신호를 포함 하는 활성 메커니즘을 통해 대부분 발생 Pd 전송 작은 분자, 이온과 물, 등의 수 동적으로 발생 추정, 반면에 분자를 수송. 식별된 plasmodesmata (Pd) 지역화 신호 (PLSs)의 부족은 심각 하 게 단백질 분류의 이해 제한 경로에 관련 된 식물 셀 고분자 전송 및 통신. 다양 한 식물에서에서 Pd 통해 트래픽을 알려진 내 인 성 및 바이러스 성 단백질 3 PLSs 보고 되었습니다 데이트, 내 생 식물 단백질에서 그들의 모든. 따라서, 그것은 필요 하 고 생활에 직접 Pd 대상에 대 한 충분 한 기능 PLS 시퀀스를 식별 하는 안정적이 고 체계적인 실험 전략을 개발 하는 중요 한 식물 세포. 여기, 우리가 같은 전략 패러다임으로 담배 모자이크 바이러스 (TMV)의 셀 운동 단백질 (MP)를 사용 설명. 이러한 실험을 확인 하 고 첫 번째 특징 식물 바이러스 PLS, PLS 시퀀스 가장 Pd 대상 단백질의 발견에 대 한 적용할 수 있습니다.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) 식물 개발 및 녹음 방송 요인에서 mRNA와 작은 RNA 분자에 이르기까지 morphogenesis의 키 레 귤 레이 터의 세포 수송을 위한 도관으로 작동 합니다. 또한,이 고분자 전송 용량 Pd의 활용 그들의 세포 확산에 대 한 대부분의 식물 바이러스에 의해 감염; 시 Pd를 통해 이동, 식물 바이러스 이동 단백질 (MPs), 특히 Pd^1,2,3,4,,56 대상 되 나 특수 단백질 진화 ^{, 7}. Pd 전송의 분자 경로 대부분 이러한 경로에 수송된 단백질을 대상으로 특정 시퀀스와 밀접 하 게 상호는. 따라서, 이러한 Pd 지역화 신호 (PLSs)의 진단 해당 Pd 전송 통로의 있을 수 있습니다. 이것은 Pd 전송⁸, 비유 하 여 예를 들어 다른 핵 지 방화 신호 (NLS) 시퀀스

Protocol

1. 식물 재료

1. 식물의 선택
2. 사용 하 여 관심, 즉, 하나는 내 인 성 단백질을 위한이 단백질을 인코딩합니다 또는 바이러스 성 단백질에 대 한 병원 체에 대 한 자연 호스트를 나타내는 단백질에 고유 식물 종. 또한, 선택 된 식물 종의 변이 유전자 변환의 선택한 방법에 순종 해야 합니다.
   참고: 정기적으로 Nicotiana benthamiana, TMV에 대 한 좋은 호스트를 나타내고 있는 Agrobacterium 중재 하는 유전자 변형 기술, 즉, agroinfiltration에 의해 효율적으로 변환 됩니다 있는 고용 연구 (3 단계 참조). 명. benthamiana 또한 쉽게 성장 하는 식물과 큰 잎, 쉽게 Agrobacterium으로 주사 되 고 쉽게 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석.
3. 식물 성장
   1. 명. benthamiana 씨 높은 밀도에서 젖은 토양에서 식물. 20-25 ˚C ~ 75 µmol 광자 m^{-2의 -1} 에서 빛의 아래 16 h와 어둠의 8 h에서 제어 환경 챔버에 그들을 유지. Euphyll의 직경에 0.5 cm를 도달 하면, 신중 하 ....

Results

충실 하 게 설명된 프로토콜에서 예상 결과 설명 하 고 식별 TMV MP PLS, 대표적인 데이터는 원 외. 에서 적응 ²¹. 그림 1A 먼저 전장 TMV MP (1-268), TMV의 MP PLS (함유 단백질, 1-50의 처음 50 아미노산 잔류물), 표현 하는 주요 구조를 요약 하 고 V4A 파생 상품 검색의 알라닌 CFP (생성으로 융합 단계 2.2, 5.2 및 6에에서 설명 된) 그림 1B 요약 하 고 이러한 태그 단백질의 subcellular 지 방화를 수량화 하는 반면. 그림 1C 설명 특성 주변 punctate Pd 지역화 패턴 coexpressed Pd 마커, PDCB1-DsRed2에 관해서는 TMV MP에 대 한 CFP 위한 TMV MP PLS-CFP 뿐만 관찰 (단계 5.1 참조). 그림 .......

Discussion

이 프로토콜은 4 명의 코어 성분: 시퀀스를 필요 하 고 충분 한 Pd, 길이, 점차적으로 줄어드는 조각으로 관심사의 단백질의 체계적인 부문 융합는 테스트 대상에 대 한 식별의 개념 태그와 고분자 화물, 및 Pd 생활에 대상에 대 한 기능 분석 결과 제공 하는 autofluorescent 단백질 조각 공장 테스트 융해 단백질의 과도 식 다음 조직. Note Agrobacterium 중재 과도 식 시간, 즉, 몇 일, 유사한 연구¹⁵에서 자주 사용 하는 유전자 변형 식물의 생산에 필요한 개월에 비해 상대적으로 짧은 기간 내에 데이터를 생성 합니다.

Coexpression subcellular 지 방화 마커 관심사의 단백질의 예를 들어, PDCB1 또는 무료 DsRed2, 보통 수행 multigene 표정 벡터에서. 그러나, 단일 벡터에 여러 식 카세트의 전송 기술적으로 문제가 있는 경우에, coexpress.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)	Zeiss	LSM5	유사한 기능을 가진 모든 CLSM이 적합합니다
컨포칼 현미경 이미징에 적합한 Zen 소프트웨어	Zeiss	2009 버전	이 소프트웨어는 사용된 CLSM과 호환되어야 합니다.
Quickchange II 사이트 지시 돌연변이 유발 키트	Agilent	200523
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
MES	Sigma-Aldrich	69892
바늘 없는 주사기	BD	309659
MgCl2	FisherScientific	M33-500
Spectinomycin	시그마-알드리치	S4014
리팜피신	시그마-알드리치	R3501
암피실린	시그마-알드리치	A0166