방법 논문

증발 감소 문화 조건은 미세 적정 플레이트에서 다세포 회전 타원체 형성의 재현성을 증가

DOI:

10.3791/55403

⸱

2017년 3월 7일

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

이 논문에서

요약

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마이크로 타이 터 플레이트에서 배지의 요철 손실 균일 다세포 타원체 종양 형성의 재현성에 영향을 미친다. 배양 조건을 개선하면 구형 형성의 재현성 및 액체 오버레이 기술을 사용하여 회전 타원체 기반 분석의 결과를 개선 상당한 매체 손실을 감소시킨다.

초록

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밀접 생체 조건에서 모방 종양 모델 잠재적 항암제의 스크리닝을위한 약물 발견 및 개발에서 점점 인기를 끌고있다. 다세포 종양 회전 타원체 (MCTSes)를 효과적으로 리드 최적화 및 목표 검증을위한 시험 관내 모델들이 우수하고, 고형 종양의 생리적 조건을 모방. MCTS 배양에 사용할 수있는 다양한 기술 가운데 아가 액체 오버레이 방법 MCTS 생성하기위한 가장 저렴한 방법이다. 그러나, 높은 처리량 스크리닝 액체 오버레이를 사용 MCTS 배양의 안정적인 전송은 아가로 마이크로 타이 터 플레이트 (MPS)의 코팅 우물 걸쳐 균일 MCTS 형성의 irreproducibility 포함한 많은 한계에 의해 손상 될 수있다. 의원 약물 전체 플레이트의 사용을 방지 판의 외부로부터 매체의 과도한 증발 인한 효과 가장자리 상당히 쉽다테스트합니다. 이 원고는 균일 한 MCTS 형성의 확장 성 및 재현성을 높일 수있는 액체 오버레이 기술에 대한 상세한 기술 향상된 기능을 제공합니다. 약물 치료가 발표 된 후 또한, MCTS의 평가에 대한 간단한, 반 자동 및 보편적으로 적용 할 수있는 소프트웨어 도구에 대한 자세한 내용은 있습니다.

서론

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종양에서의 암 세포는 생리 학적으로 외 매트릭스와 세포의 상호 작용에 의해 둘러싸인 복잡한 3 차원 (3D) 구조로 배열된다. 거의 모든 조직에서의 세포는 3 차원 환경에 상주 종양 특성을 모방 관내 종양 모델에서 더 많은 생리 학적 관련성에 대한 필요성은 여러 차원 배양 기술 1, 2, 3의 발전을 가져왔다. 이 모델은 현재 3D 2의 치료제로의 전이 및 세포 반응에 종양 미세 환경의 역할을 연구 기초 연구 도구가되고있다. 또한, 2 차원 (2D) 세포 배양 4에 비해, 3D 모델 세포 신호 전달 경로에 영향을 종양 기질 상호 작용의 더 나은 이해를 위해 허용한다.

암세포의 다세포 종양 타원체 (MCTSes)는 자주 차원 셀 (C)에 사용되는생체 내 종양에 상대 친밀감으로 인해 ulture 모델. 사용하는 여러 방법 중에서, 아가 - 코팅 된 플레이트에 MCTS 발생의 액체 오버레이 기술 (LOT)의 리드 최적화 목표 검증 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11에 대한 상당한 관심을 받고있다. 이것은 LOT 6, 7을 사용 MCTS 배양 화합물 라이브러리의 파일럿 화면을 실행할 수 있었다 성공적으로 최근의 연구로부터 명백하다. 그러나, 매체의 증발에 의한 불균일 손실 MCTS의 형태와 성장에 잘 - 투 - 잘 변화는 미세 적정 플레이트를 사용하여 LOT (의원)을 함께 일반적인 장애물이다. 결과적으로, 불균일 MCTSes의 형성 의미 관련성 타협약리학 적 검정 8, 12, 13에서의 데이터. 분배 유닛 자동 액체를 사용하는 경우 재현성 문제 이외에, LOT 계 고 처리량 분석에 영향을 미치는 또 다른 실질적인 문제는 의원 코팅은 아가 로스이다. 분배 유닛은 아가로 오스 겔을 방지하기 위해 가열 유지 될 수 있지만, 분배 카세트 배관의 막힘 로봇 시스템 (6)에 대한 잠재적 관심사이다.

이러한 문제들을 극복하기 위해, 우리는 최근에 MCTS 문화 (8)의 LOT에 약간의 수정을 고안했다. 이러한 변형은 주로 흔히 높은 처리량 스크리닝 실험실에서 발견되는 장비를 이용하여 MP들에서 요철 매체 손실을 방지 할 수있는 방법에 기초한다. 3 걸쳐 균일 한 크기와 재현 MCTSes의 생성에 대한 수정 LOT의 자세한 절차84 웰 플레이트 (WPS)가 여기에 표시됩니다. 원고은 특히 단면적의 측정에 대한 명확히 한정된 경계를 갖고 있지 않은 부분적으로 분해 된 약물 처리 MCTSes에서 MCTS 크기의 평가 반자동 루틴을 보여준다.

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프로토콜

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아가로 오스 코팅 된 플레이트 1. 준비

  1. 저 융점 아가로 오스 0.75 g을 달아 혈청없이 mL의 맥코이의 5A 매체의 (또는 페놀 레드없이) (100)에 추가합니다. 전자 레인지에서 솔루션을 가열 완전히 아가 로스를 용해마다 1-2 분 소용돌이 친다. 를 살균 할 수있는 솔루션을 압력솥.
  2. [정보 70 ° C로 냉각시키고, 아가 멸균 층류 상자 진공 여과에 의하여 500 ㎖, 0.22 μm의 필터 최상부 통해 필터링. 한 번에 전체 솔루션을 사용하지 않는 경우 작은 볼륨으로 0.75 % 여과 아가로 오스 솔루션 (FAS)을 나누어지는. 추운 방 또는 최대 4 주 동안 4 ° C 냉장고에이 즉시 사용 아가로 오스 솔루션 무균를 저장합니다.
  3. 흐름 상자에 멸균 인산 완충 생리 식염수 (PBS)와 다음 70 % 에탄올 (EtOH로)와 함께 콤비 시약 디스펜서 및 주요 카세트에 플라스틱 - 금속 - 팁 분배 카세트와 작은 튜브를 연결합니다.
  4. 사용하기 전에, FAS I의 저장 분취 가열 n은 전자 레인지가 녹아있다. 총리는 아가로 오스 솔루션 코트 384도, 조직 문화 (TC)와 분배 카세트 FAS의 15 μL와 마이크로 플레이트 "특별한"처리 한. 접시에 아가로 오스는 세포를 파종하기 전에 15 ~ 20 분 동안 냉각시킵니다. 추운 방에 4 ° C에서 멀리 직접 빛으로부터 폴리에틸렌 봉지에 싸여 무균 아가로 오스 - 코팅 된 플레이트를 저장합니다.
    주 : 원액에서 아가 로스의 농도 변화를 방지하기 위해 0.75 % FAS 반복 가열을 피한다. 상술 된 조건 하에서 저장 될 때 아가 - 코팅 된 플레이트는 최대 2 주 동안 저장 될 수있다. FAS는 판의 코팅 동안 가열을 필요로하지 않습니다.
  5. 카세트 팁 및 튜브에 남아있는 아가로 오스를 제거하기 위해 70 ~ 80 ° C를 멸균 수로 프라이밍에 의해 분배 카세트를 청소합니다.

2. 세포 배양 및 MCTS 형성

  1. 배양 인간 결장 암종 HCT116 세포, 전술 한 바와 같이아가씨 = "외부 참조"> 8.
  2. 아가로 코팅 된 384 웰 냉장에서 TC 마이크로 플레이트가 처리 필요한 수를 제거하고 15 분 동안 실온 (RT)로 평형화.
  3. 70 % EtOH로 멸균 PBS와 표준 튜브 분배 카세트를 프라이밍에 의해 세포 파종의 콤비 시약 디스펜서를 준비합니다. 필요한 μL로 시딩 볼륨과 디스펜서 수동 설정 버튼을 이용하여 매체에 토출 속도를 조정한다.
    주 : 전체 세포 시딩 공정은 무균 조건에서 층류 상자에서 수행된다.
  4. 재조합 세포 분해 효소를 이용하여 조직 배양 플라스크에서 부착 세포를 해리. 완전 성장 배지 50 μL에 웰 당 2.5 × 104 세포 / ml의 밀도로 시드 셀 무균 비이커에 세포 현탁액 재고 확인. 이상의 384 WP 시드 때 비이커의 바닥에 침강을 방지하기 위해 자기 교반기를 사용하여 세포를 교반한다.
  5. 허용플레이트는 실온에서 30 분간 휴식 후 4 × g에서 15 분 동안 원심 분리한다.
  6. 한편, 증착 환원성 환경 뚜껑을 가지고 짧은면에서 멸균 H 8ml의 2 O 5 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)로 채우기 5 ㎖ 피펫 (도 1A)를 사용하여 (좌우). 먼저, 서서히 상하로 피펫 팁을 스위핑 좌측 홈통으로 액체를 충전 4㎖를 분배. 오른쪽 골이 단계를 반복합니다.
    참고 : 액체가 뚜껑의 중심에 병합 및 가스 교환 (그림 1A)에 대한 간격을 두지 않는 쪽 골짜기에 추가되었는지 확인합니다. 뚜껑의 외관 및 이후에 384- 웰 TC 플레이트의 외측에 웰 H의 H 2 O의 삼출 2 O 결과 과량 추가.
  7. (그림 2A를 멸균 H 2 O와 384 웰 TC 플레이트의 액체 저장소를 채우고 액체로 채워진 환경 뚜껑 일반 판 뚜껑을 교체).
  8. 95 % 습도, 5 % CO 2, 20 % O 2와 37 ° C 회전 배양기에서 플레이트를 배치하고, 세포를 4 일 동안 MCTSes으로 응집 할 수있다. 갑자기 떨어지는 습도 수준을 방지하기 위해, 후속하는 일이 너무 오래 동안 인큐베이터의 도어를 열지 않도록.

로봇 형 시스템을 사용하여 3. 중간 교환

  1. MCTS 형성 다음날 4 일, 잘 자동화 마이크로 플레이트 워셔 디스펜서를 사용하여 당 사전 예열 매체의 30 μL를 추가합니다. MCTSes 추가 3 일간 성장하도록 허용합니다. 그들은 실험에 원하는 크기를 달성 할 때까지 정기적으로 3 일마다 배지를 교체합니다.
  2. 각 웰로부터 매체의 볼륨을 정의 대기음 경험적 와셔 매니 폴드의 Z -height을 조정한다. 기음 30 웰 당 매체의 μL 신선한 사전 예열 매체의 30 μL로 교체합니다.
    주 : 세탁기 매니 폴드 아래로 이동하는 분배 속도와 속도를 설정가장 낮은 속도로 우물에 우물에서 난류를 최소화합니다.

MCTS 4. 높은 콘텐츠 이미징 및 반 자동화 된 이미지 분석

  1. 이미지 4X 공기 목적을 이용한 고 함량 자동 촬상 시스템의 MCTS (NA 16).
  2. 숫자와 간격은 Z -stacks 및 웰 당 전체 MCTS를 캡처 실험에서 원하는 픽셀 비닝을 조정 MS (11)의 노출 시간 및 4 × 4의 비닝을 설정한다.
  3. 프로그래밍 언어로 작성된 사내 루틴을 사용하여 "읽어"에서 설명한 바와 같이, 이미지를 단계적으로 처리한다.
    참고 :하는 .m 코드와 .txt 인 추가 정보 파일은 보조 코드 파일 (그림 1B)로 사용할 수 있습니다. 루틴 측정 2D 이미지에서 MCTS 지역, 전공 및 부전공 축, 경계, 그리고 견고.

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그림 1 :환경 뚜껑의 제조 및 반자동 루틴의 흐름도. 올바른 (왼쪽)과 초과 액체를 충전 (오른쪽) 양 (여기, 5 % DMSO) 가득 증발 감소 환경 뚜껑 (A) 이미지. 화살표는 액체를 추가 단측 통을 나타낸다. 별표는 DMSO의 정확한 양의 첨가 다음 뚜껑의 중앙의 간격을 나타낸다. (B)이 반 자동화 영상 분석 루틴에 포함 된 단계를 도시하는 플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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결과

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특히 주변 우물에서 매체의 요철 손실은 작은 문화 볼륨이 의원에 자주 발생하는 문제입니다. 예를 잘 조절 온도 / 가습 시스템 및 증발 감소 의원과 접시 뚜껑 인큐베이터 실질적으로 개선 된 배양 조건은, 우물 8에서 매체의 상당한 손실을 줄일 수 있습니다. 상대 증발을 측정하기 위해 오렌지 G (OG)의 동일한 양을 각 웰에 첨가하고, 3 일 동안 OG 흡광도의 변화는 표준 회전 044 정규 환경 뚜껑 판에 기록 하였다. 플레이트 웰 플레이트 (도 2A)의 가장자리로부터의 거리에 기초하여 6 개의 그룹으로 나누었다. 그룹 1-4에서 표준 인큐베이터 (그림 2B)에서 일반 뚜껑 접시에 시간이 지남에 OG의 흡광도에 큰 변화가 있었다. OG 흡광도의 변화로부터도했지만그룹 환경 뚜껑 / 회전 인큐베이터 조합 (그림 2C)에서 판 1 우물, 변...

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토론

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필터링 된 아가로 오스와 384 잘 TC 플레이트 코팅

LOT의 표준 관행 코트로 오스 및 / 또는 분배 장치를 필요로하는 플레이트, 아가 로스 겔 (6)의 가열을 방지하기 위해 유지되어야을 1.5 % 저 융점 아가로 오스를 사용하는 것이다. 직경이 0.2 내지 0.4 mm에 이르기까지 작은 튜브 구멍 액체 분배 카세트를 사용하여 여러 판을 준비하는 동안 아가로 오스의 겔은 잠재적 인 문제이다. 이 분배 동안 추가 가열을 필요로하지 않기 때문에 분배 카세트 막힘의 잠재적 문제를 해결하기 위해, 0.75 %, FAS를 사용 하였다. 또한, 또한, 0.75 % FAS만큼 빠르게 필터링되지 않은 1.5 % 또는 0.75 % 아가 용액 겔화하지 않는 것을 관찰 하였다. 0.75 % FAS를 사용하여, 상기 분배 카세트를 막힘없이 코팅 전체 384- 웰 TC 플레이트를 35 미만의 걸린다. 카세트는 잔차를 제거하기 위해 온수로 프라이밍하여 끝에 세...

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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이 작품은 교육, 청소년, 체육 (LO1304)의 체코 교육부와 체코의 기술기구 (TE01020028)에서 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 환경 뚜껑의 정지 영상을 촬영 박사 락스 바라나에게 감사의 말씀을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아가로스시그마-알드리치A9414저융점
맥코이의 5A 미디엄시그마-알드리치M8403
" 빠른" Filtermax 필터TPP995050.22 μ m, 500 mL
멀티드롭&트레이드; 콤비 시약 디스펜서 Thermo Fisher Scientific5840300
소형 튜브 디스펜싱 카세트 Thermo Fisher Scientific24073295메탈 팁 
384웰 TC 플레이트 PerkinElmer6057308플레이트 유형- CellCarrier
표준 튜브 디스펜싱 카세트Thermo Fisher Scientific24072670
MicroClime 환경 뚜껑LabcyteLLS-0310
DMSOSigmaD4540
로터리 인큐베이터(SteriStore)HighRes Biosolutions23641일련 번호: D00384
마이크로플레이트 세탁기 디스펜서 BioTek미지정모델: EL406 
고함량 이미징 시스템 (CellVoyager)Yokogawa Electric Corporation미지정모델: CV7000
오렌지 G뉴잉글랜드 바이오랩스B7022S
TrypLE™ 익스프레스 재조합 세포 해리 시약Thermo Fisher Scientific12604021Phenol red free

참고문헌

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재인쇄 및 허가

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