여기서 우리는 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석을 통해 황색 포도상 구균과 이후 분석에서 대사 물질의 추출을위한 프로토콜을 기술한다.
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이 논문에서
요약
초록
세균성 병원균을 저지하기위한 노력의 일환으로, 호스트는 종종 감염의 사이트에있는 영양소의 이용을 제한 할 수 있습니다. 이 제한은 규제 요인은 세포의 신진 대사를 조절, 대응되는 키 대사의 존재비를 변경할 수 있습니다. 최근에는 단백질과 RNA의 숫자가 독성 유전자 발현의 중요한 규제로 등장했다. 예를 들어, 코디 단백질 분지 쇄 아미노산 및 GTP의 레벨에 응답하고 널리 낮은 G + C 그램 양성 세균에 보존된다. 황색 포도상 구균의 글로벌 레귤레이터로서, 코디 독성 대사 유전자 수십개의 표현을 제어한다. 우리는 황색 포도상 구균이 코디가 부분적으로 잠재적 호스트 환경에서 발생하는 영양소 제한 조건에 적응하기위한 노력의 일환으로 자사의 대사 상태를 변경하는 데 사용하는 가설을 세웠다. 이 논문은 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토 그래피를 이용하여 S. 구균에서 대사를 추출하여 분석하는 방법을 설명trometry,이 가설을 테스트하기 위해 개발 된 프로토콜입니다. 이 방법은 또한 연속 chemostat 문화를 사용하지 않고 생물학적 정상 상태와 일정한 통기를 유지하는 등 엄격하고 재현성을 보장 모범 사례를 강조한다. USA200의 메티 실린 감수성 황색 포도상 구균에 대한 상대 UAMS -1- 모 균주를 분리은 동질 코디 돌연변이 아스파 테이트 (예를 들어, 트레오닌과 이소류신) 유래의 아미노산의 현저한 증가를 나타내 및 (그 전구체 감소 예, 아스파라긴산 및 O의 -acetylhomoserine ). 이러한 결과는 RNA-서열 분석으로 얻어진 전사 데이터와 상관 관계가 다음 코디 널 돌연변이의 10 및 800 배 사이의 상향 조절이 경로의 유전자가 있었다. 사체와 대사 체의 글로벌 분석을 커플 링하는 것은 환경이나 영양 스트레스에 직면했을 때 박테리아가 PHY를에 잠재적 인 통찰력을 제공하고, 신진 대사를 변경하는 방법을 밝힐 수영양 결핍과 관련된 iological 변화는 감염 동안 경험했다. 이러한 발견은 새로운 항 감염 제 및 치료제의 개발을위한 방법을 포장 할 수있다.
서론
세균성 병원체는 호스트 환경에서 많은 도전에 맞설해야합니다. 면역 세포에 의한 직접 공격뿐만 아니라, 호스트는 세균의 생존과 복제, 생성 영양 면역 1, 2 필수 영양소를 담즙산이. 이러한 적대적 환경에서 살아 남기 위해, 세균성 병원균은 병원성 인자를 배포합니다. 이러한 요소 중 일부는 박테리아가 면역 반응을 회피 할 수 있도록; 다른 인자는 조직 유래 성분 3, 4, 5를 소비하여 누락 된 영양소를 보충 할 수 있도록 세균 등 히알루, thermonuclease, 리파제 등의 소화 효소를 분비를 포함한다. 실제로, 병원성 세균, 6 인자 (7)의 생산 세포의 생리 학적 상태를 묶어 규제 시스템 진화, 클래스 = "외부 참조"> 8, 9, 10까지.
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프로토콜
버퍼 솔루션 1. 준비
- 인산 완충 식염수 준비, 초순수로 1 배의 최종 농도로 10 배 PBS의 원액을 희석하여 (PBS pH를 7.4) (증류수 및 탈) 물.
- 아세토 니트릴 2 ㎖, 메탄올 2 ㎖, 초순수 H 2 O 1 ㎖, 포름산 19 μL (0.1 mM의 최종 농도)을 조합하여 켄칭 용액을 준비한다.
- LC-MS 초순수에 포름산 (0.2 % [v / V를] 최종 농도)을 첨가하여 용매를 준비한다.
- 아세토 니트릴, 포름산 (0.2 % [v / V를] 최종 농도)을 첨가하여 LC-MS를 용제 B를 준비한다.
참고 : 모든 솔루션은 최고 순도의 시약을 사용할 수 (일반적으로 고성능 액체 크로마토 그래피 등급)로 작성한다. 솔루션은 각 실험 전에 신선 준비하고 사용하기 전에 얼음에 보관해야합니다.
정상 상태 S. 구균 성장 2. 설립
- 행진 S.의 aureu냉동 글리세롤로부터 트립신 콩 한천 (TSA)에서 격리에 대한 관심의 변종. 16-24 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
- 트립 틱 소이 브로스 (TSB) 각 균주의 단일 콜로니로 멸균 유리 배양 관의 다른 ....
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결과
우리는 풍부하고 복잡한 배지에서 체외 성장 동안 S. 구균 세포 내 대사 풀을 분석 하였다. 원리 증명 된 바와 같이, 우리는 비교 메티 실린 감수성 S. 구균 골수염 간 대사 프로파일 UAMS -1- (야생형 [WT]) 및 글로벌 전사 조절 코디 (Δ 코디) (26)가없는 동종의 균주를 분리. 프로토콜의 단계 2에 기술 된 바와 같이 정상 상태에서, WT 및 코디 균주의 지수 배양, TSB 배지에 설립되었다. 야생형과 코디 -null 돌연변이 문화의 성장 동작은 성장 수율과 속도 (그림 1)에서 경증 차이, 유사 하였다. RNA-SEQ 및 마이크로 어레이 기술을 사용하여, 우리와 다른 아스파 테이트에서 파생 된 아미노산의 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 여러 유전자가 코디 -null.......
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토론
모든 작은 분자 대사는 중앙 대사 경로에서 공통의 기원을 통해 서로 연결되어있다. 기하 급수적으로 성장하는 동안 박테리아 세포는 특정 조건 하에서 생리 상태의 스냅 샷을 제공하는 생물학적 대사 안정 상태에있다. 코디 ILV와 GTP에 응답하여 영양 자족을 모니터링합니다. ILV 및 GTP 풀 강하 같이, 코디 활성 가능성 점진적 영양분 고갈 (30)의 증가에 적응하는 그것의 표적 유전자의 발현을 조절, 감소된다. 코디 결핍 균주 ILV 및 GTP 환경에서 소모하는 것처럼 행동하지만만을 코디 숙달 균주 성장 거동에 대하여 매우 경미한 차이 (도 1)를 나타낸다. 따라서, 이들 균주의 대사 물질의 정상 상태 풀의 비교는 영양분이 부족한 경우 신진 대사가 재구성되는 정도를 공개 할 수있는 독특한 기회를 우리에게 제공한다. 그것은 주목해야한다 OU코디 활성 (ILV하고 GTP가 지수 상에 가장 풍부하다) 최대화 될 때 R 실험 대사 존재비를 조사. 그러나 다른 .......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 독립 수상에 NIH 통로 (GM 099,893을 부여) 교수 시작 기금 SRB에,뿐만 아니라 연구 프로젝트 그랜트 (GM 042219 부여)에 의해 부분적으로 투자되었다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 해석, 또는 출판을 위해 작업을 제출하기로 결정에서 아무런 역할이 없었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Material/Equipmenta | |||
| DeLong Culture Flask (250 mL) | Belco | 2510-00250 | |
| 사이드암 플라스크, 500 mL | Pyrex | 5340 | |
| 3-홀 고무 스토퍼, #7 | Fisher | 14-131E | |
| 스테인레스 스틸 필터 홀더/frit | VWR | 89428-936 | |
| 페트리 접시, 35mm | 코닝 | 430588 | 조직 배양 처리되지 않음 |
| 혼합 셀룰로오스 에스테르 막, 0.22 μ m 기공 크기 | Millipore | GSWP02500 | |
| 내충격성 튜브, 2mL | USA Scientific | 1420-9600 | |
| 실리카 비드, 0.1mm | Biospec Products Inc | 11079101Z | |
| Precellys 24 균질화 Bertin | Instruments | EQ03119-200-RD000.0 | |
| Micro BCA 단백질 분석 키트 | Pierce (Thermo Scientific) | 23235 | |
| Cogent Diamond 수소화물 타입 C 컬럼 | Agilent | 70000-15P-2 | |
| Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 시리즈 | Agilent | G6230B | |
| Quat 펌프, 1290 시리즈 | Agilent | G4204A | |
| 빈 펌프, 1290 시리즈 | 애질런트 | G4220A | |
| 밸브 드라이브, 1290 시리즈 | Agilent | G1107A | |
| Isocratic 펌프, 1290 시리즈 | Agilent | G1310B | |
| TCC, 1290 시리즈 | Agilent | G1316C | |
| 샘플러, 1290 시리즈 | 애질런트 | G4226A | |
| 온도조절기, 1290 시리즈 | Agilent | G1330B | |
| Chemical | |||
| Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211825 | |
| Difco Agar, | Granulated Becton Dickinson | 214530 | 고체 매체는 1.5% [w/v] 한 |
| 천 인산염 완충 식염수(pH 7.4)를 포함합니다. 10x | Ambion | AM9624 | 릴로 신선을 1x로 희석합니다. |
| Fisher Scientific | A955-500 | Optima LC-MS | |
| 메탄올 | Fisher Scientific | A456-500 | Optima LC-MS; 독성 |
| 포름산 | Sigma Aldrich | 94318 | 질량 분석의 경우 98% |
| Software | |||
| MassHunter | Agilent | G3337AA | |
| Bacterial Strain | >Species | Strain | >Genotype |
| SRB 337 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | wild type |
| SRB 372 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | Δ codY::erm |
| a나열된 화학 물질 및 재료는 설명된 방법에 따라 다르며 표준 실험실 화학 물질 또는 소모품은 포함하지 않습니다. |
참고문헌
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
- Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
- Ibberson, C. B., et al.
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