포유류 스트레스 과립으로 세포질 초점을 분류하는 방법

요약

스트레스 과립 (SGs)은 다양한 스트레스에 노출 된 세포에서 형성되는 비 세포 성 세포질 구조입니다. SG는 mRNA, RNA 결합 단백질, 작은 리보솜 서브 유닛, 번역 관련 인자 및 다양한 세포 신호 전달 단백질을 포함한다. 이 프로토콜은 선량있는 SG를 탐지, 특성화 및 정량화하기위한 몇 가지 실험적 방법을 사용하는 워크 플로를 설명합니다.

초록

세포는 갑작스런 환경 변화로 종종 어려움을 겪습니다. 스트레스 조건에 노출 된 세포에서 형성되는 세포질 리보 뉴클레오타이드 복합체 인 스트레스 과립 (SGs)은 세포 대사 및 생존의 다양한 측면과 연관되어있다. SG는 세포 신호 전달 경로, 전사 후 유전자 발현 및 스트레스 반응 프로그램을 조절합니다. 이러한 mRNA- 함유 과립의 형성은 세포 번역에 직접 연결된다. SG 어셈블리는 억제 된 번역 개시에 의해 유발되고, SG 해체는 번역 활성화 또는 억제 된 번역 신장에 의해 촉진된다. 이 관계는 SG 구성에 의해 더 강조됩니다. 핵심 SG 요소는 번역 사전 개시 복합체, mRNA 및 선택된 RNA 결합 단백질 (RBP)이 정지 된 것입니다. SG 어셈블리의 목적은 번역 적으로 정지 된 하우스 키핑 (housekeeping) mRNA를 격리함으로써 세포 에너지를 보존함으로써 스트레스 반응성 단백질의 향상된 번역을 허용하는 것입니다. additi에서stalled translation preinitiation complexes와 같은 핵심 구성물에 SG는 다른 단백질과 신호 분자를 과다하게 포함하고있다. SG 형성의 결함은 스트레스에 대한 세포 적응을 손상시킬 수 있고 따라서 세포 사멸을 촉진시킬 수있다. SG 및 이와 유사한 RNA 함유 과립은 신경 퇴행성 장애 및 암을 비롯한 다수의 인간 질환과 관련되어있어 RNA 과립 아형의 분류 및 정의에 최근 관심을 갖게되었습니다. 이 프로토콜은 포유류 SG를 특성화하고 정량하기위한 분석을 설명합니다.

서론

세포는 스트레스에 반응하는 많은 메커니즘을 사용합니다. 일부 반응은 전사 후 수준에서 일어나며 mRNA 번역 및 / 또는 안정성을 조절하는 것과 관련됩니다 ^{1 , 2} . 스트레스 - 조절 된 mRNA 번역 정지 및 분해는 특이 적 비 막성 세포 초점의 형성과 관련되며, 가장 잘 특징 지어지는 스트레스 과립 (SGs) ³ . SG는 스트레스 ( 예 : 산화, 열 쇼크, 영양 결핍 및 바이러스 감염)에 반응하여 번역 상 체포 된 세포에 비 번역 mRNP를 집중시키는 세포질 초점입니다 ⁴ . 비 번역 mRNA 외에도 SG에는 번역 개시 인자, RNA 결합 단백질 및 다양한 신호 단백질 ^{5가 들어} 있습니다. SG는 억제 된 단백질 번역 및 변형 된 RNA 신진 대사의 바이오 마커이며 세포 생존 및 세포 사멸, 신호 전달 경로와 관련되어있다s 및 핵 과정 ⁵ .

SG는 동적 엔티티이며, 그 형성은 셀룰러 변환 ⁶ 의 ....

프로토콜

1. 세포 준비

1. 그림 1A 에 표시된 대로, 24 웰 플레이트의 12 우물에 autoclaved coverslips을 추가; 이것은 각 coverslip을 데리러 진공에 첨부 된 살균 파스퇴르 피펫을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 부드럽게 우물의 측면에 coverslip을 눌러서 coverslip가 우물에 떨어질 수 있도록 흡입을 해제하십시오.
2. 플레이트 1 x 10 ⁵ U-2 OS (U2OS) osteoscomcoma 세포를 최종 용적 500 μL의 배양액에 넣습니다. 플레이트의 측면을 위아래로 여러 번 움직여 셀이 고르게 분포되도록합니다.
3. 부드럽게 coverslip 깨끗한 P1000 팁 coverslip가 우물의 바닥에 있는지 확인하고 coverslip 아래에 거품이 있는지 확인하십시오.

2. 스트레스 셀

1. 다음날, 시각적으로 세포가 균등하게 흩어져 있는지 확인하고 커버 슬립을 가로 질러 균등하게 합쳐져 있는지 확인하십시오.mples은 결과의 재현성에 악영향을 줄 수 있습니다. 거꾸로 조직 문화 현미경에 10X 목적을 사용하십시오.
2. 37 ° C로 매체를 예....

결과

스트레스 유발 초점은 반드시 SG가 아닙니다. SG는 mRNA, 번역 개시 인자 및 RNA 결합 단백질을 포함하고 활성 번역과 평형을 이루는 세포질 초점으로 분류됩니다. 위의 프로토콜은 주어진 응력이 진정한 SG를 유도하는지 여부를 특성화하기위한 템플릿으로 사용할 수 있습니다.

SGs는 단백질과 mRNA를 포함한 다른 알려진 SG 마커와 함께 국소화됩니다. SA와 VRB는 G3BP1, eIF4G 및 eIF3b를 포함하는 세포질 초점을 유도한다 ( 도 2A ). 이러한 마커의 동시 발색은 라인 스캔 분석 및 증가 된 확대율을 갖는 단일 채널 이미지를 사용하여 확인됩니다 ( 그림 2A ). 또한, 이러한 초점은 polyA FISH로 표시된 Mrna를 포함하고 oligo (dT) 신호는 G.......

토론

만성 스트레스는 여러 질병에 대한 면역 조직 학적 연구에서 입증 된 바와 같이 다양한 세포 내 초점을 형성합니다. 예를 들어, 대부분의 신경 퇴행성 질환은 불용성 단백질의 세포 내 응집체를 특징으로합니다. 그러한 응집체에서 SG- 관련 단백질의 존재는 그러한 초점이 SG라고 결론을 내리기위한 기초가된다. SG 마커 양성 세포질 초점이 새로운 스트레스 자극으로 치료 된 세포에서 관찰되는 경우에도 유사한 결론이 도출된다. 이 프로토콜은 선의 SG를 식별하는 간단한 워크 플로를 제공합니다.

구성과 동역학의 특성을 포함하여 추정 SG를 확인하기 위해서는 몇 가지 기준을 충족해야합니다. 첫째, SGs는 translational stalled mRNPs를 포함하는 세포질 초점입니다. 따라서, 첫 번째 접근법은 두 가지 현미경 기반 기술, 즉 polyA-FISH 및 IF를 사용하여 조성을 특성화하는 것이다. 물고기는 시각적으로 신뢰할 수있는 방법입니다.SGs와 공존하는 m.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
U-2 OS	ATCC	ATCC® HTB-96&트레이드;	일반적으로 쓰여지는 "U2OS" Culture at 37 ° C 10% FBS/DMEM에서 5% 미만의 CO2
Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	4.5g/L 포도당, 피루베이트 및 페놀 레드 함유 10% FBS, 10mM HEPES 및 페니실린/스텝토마이신 사전 예열 이전 약물 희석
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F2442-500ml	를 보충하는 데 사용됩니다
.	Thermo Fisher Scientific	15630-080	배지 페
니실린 스트렙토마이신	Sigma	P0781-100ml	배지 보충에 사용
24웰 플레이트	Costar	3524
실험실 티슈(kimwipes)	KIMTECH SCIENCE	34120
성장 커버 안경용 커버 글라스	Fisher Scientific	12-545-82	사용 전 오토클레이브 조직 배양 후드에서 멸균 상태 유지
나트륨(메타)비소 ≥ 90% (SA)	Sigma	S7400-100G	물에 1m 농도로 용해시킨 다음 100 &마이크로로 희석합니다. M 작업 원료로서의
Vinorelbine (VRB)	TSZ CHEM	RS055	10 mM
Puromycin	Sigma	P9620	번역 수준 (리보푸로마이실화)을 평가하는 데 사용됨 -활성 번역 물에 10 mg/mL
에메틴 디하이드로클로라이드 수화물	Sigma	E2375	로 희석일반적인 번역 수준을 평가하기 위해 퓨로마이신과 함께 사용 활성 번역 - 물에 10mg/mL
Cycloheximide (CHX)	Sigma	C4859	활성 translation 와의 SG 연결을 평가하는 데 사용 물에 10mg/mL
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Lonza / VWR	95042-486	Wash buffer for immunofluorescence
파라포름알데히드 시약 등급, 결정질 (PFA)	Sigma	P6148-500G	흄 후드의 뜨거운 PBS에 4% 용액을 만들고 용해될 때까지 저어줍니다 부분 표본은 -20°C에서 저장할 수 있습니다. C 몇 달 동안 위험, 환기 사용 특수 폐기물
메탄올, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	Prechill -20 ° C 사용 전 특수 폐기물에 폐기
Normal Horse Serum (NHS)	Thermo Fisher Scientific	31874	PBS 에서 5%로 희석 4°C에서 보관을 위해 아지드화나트륨을 첨가합니다. C 면역형광
차단 솔루션 에탄올, 순수, 200 프루프 (100%), USP, KOPTEC	Decon Labs / VWR	89125-188	물로 70%로 희석
Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드	Fisherbrand	12-550-15
마우스 안티 G3BP1 항체 (TT-Y)	Santa Cruz	sc-81940	4 ° C 1/100 희석
토끼 anti eIF4G 항체 (H-300)	Santa Cruz	sc-11373	4 ° C 1/250 희석
염소 항 eIF3η (N-20) 항체	Santa Cruz	sc-16377	eIF3η eIF3b Store at 4 ° C 1/250 희석
마우스 안티 puromycin 12D10 항체	Millipore	MABE343	4 °에서 저장; C 1/1,000 희석
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	715-225-150	Reconstitute in water per manufacturer' s 명령어는 4 ° C 1/250 희석
Cy3 AffiniPure 당나귀 안티 토끼 IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	711-165-152	제조사에 따라 물에서 재구성 s 명령은 4°Eg에 저장합니다. C 1/2,500 희석
Cy5 AffiniPure 당나귀 안티 염소 IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	705-175-147	제조사에 따라 물에서 재구성 s 명령은 4°Eg에 저장합니다. C 1/250 희석
Hoechst 33258 용액	Sigma	94403-1ML	2차 항체로 배양 dH20에서 ><0.5 mg/mL 저장 -4°C에서 보관; C
Cy3 Streptavidin	Jackson Immunoresearch	016-160-084	제조사별 수중 재구성 s 지침, 그런 다음 4 °에 보관하십시오. C 1/250 희석
올리고-(dT)40x 프로브 비오틴화	통합 DNA 기술(IDT)/		수중에서 100ng/mL로 재구성, 분취 및 -20°°C에서 보관; C 사용 전에 혼성 버퍼 1/50에 희석 맞춤 주문
혼성화 상자	/	/	바닥에 가습된 종이를 추가하여 모든 보관 슬라이드 박스로 수분 챔버를 만드십시오 - 사용 전에 상자를 미리 예열하십시오
20x SSC 버퍼	Thermo fisher Ambion	AM9763	RNase Free water (DEPC 처리)를 사용하여 2x SSC로 희석하십시오 RT 에 보관하십시오. FISH
용 세척 버퍼PerfectHybPlus 혼성화 버퍼	시그마	H7033-50ml	용 블록 및 프로브 배양 버퍼
	홈메이	드/	믹스 5g " 냉용성" 폴리 (비닐 알코올) 20 mL의 PBS < / > 혼합에 의해 초음파 처리에 의해 혼합 한 후, RT 에서 O / N을 교반 한 후 글리세롤 5 mL와 20 % 아지드 나트륨 0.2 mL를 첨가하고, 20 분 동안 20,000 g에서 RT 원심분리에서 16 시간 동안 교반하고, 큰 펠릿 < > 부분 표본 점성 액체를 버리고, -20 °의 장기 보관; C, 1 주일 4 ° C
Parafilm "M"	Sigma	P7793-1EA
폴리(비닐 알코올)	Sigma	P-8136-250G	비놀
글리세롤	Sigma	G5516-100ML	비놀
아지드나트륨	Fisher Scientific	S2002-5G	방부제 및 vinol 물에 20% 희석

배지 HEPES (1 M) 에 물에 용해 로 희석 FISH 슬라이드 장착 매체 제조용 시약