마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적

Summary

미생물 군집의 개발은 환경 구조, 구성원의 풍부 성, 형질 및 상호 작용을 포함하는 여러 요소의 조합에 달려있다. 이 프로토콜은 틈새 크기 및 감금과 같은 핵심 요소가 근사 될 수있는 femtoliter 우물에 포함 된 수천 개의 공동체를 동시에 추적하기위한 합성, 미세 제작 환경을 설명합니다.

Abstract

미생물 군집의 개발은 공동체 구성원의 공간 분포와 활동을 극적으로 바꿀 수있는 복잡한 결정 론적 요인과 확률 론적 요인의 조합에 달려있다. 우리는 수천 개의 세균 공동체를 신속하게 조립하고 추적하는 데 사용할 수있는 마이크로 웰 어레이 플랫폼을 개발했습니다. 이 프로토콜은 플랫폼의 유용성을 강조하고 플랫폼 내의 배열 앙상블 내에서 간단한 2 인 커뮤니티의 개발을 광학적으로 모니터링하기위한 용도를 설명합니다. 이 시연은 유형 VI 분비 병원성을 연구하기 위해 개발 된 일련의 돌연변이 체의 일부인 Pseudomonas aeruginosa 의 두 가지 돌연변이 체를 사용합니다. mCherry 또는 GFP 유전자의 염색체 삽입물은 각 마이크로 웰 내에서 커뮤니티 구성원의 풍부 성과 위치를 모니터링하는 데 사용할 수있는 별개의 방출 파장을 지닌 형광 단백질의 구성 적 발현을 촉진합니다. 이 프로토콜은 상세한 메토d 어레이의 우물에 박테리아의 혼합물을 조립하고 시간 경과에 따른 각 구성원의 상대적 성장을 측정하기 위해 시간 경과 형광 이미징 및 정량적 이미지 분석을 사용합니다. 마이크로 웰 플랫폼의 파종 및 조립, 어레이 내 미생물 군집의 정량 분석에 필요한 이미징 절차 및 모두 논의 된 미생물 종간의 상호 작용을 밝힐 수있는 방법.

Introduction

미생물 군집은 환경의 구조, 세포 사멸, 분열, 단백질 농도, 세포 소기관 수 및 돌연변이와 관련된 확률 적 과정과 같은 결정 론적 요인에 의해 형성된다. 자연 환경에서 이러한 영향이 지역 사회의 구성과 활동에 미치는 영향을 분석하는 것은 거의 불가능합니다. 자연 구조에 의해 가려지고 화학 및 생물학적 환경에 묻혀 지역 공동체 구성원을 확인하고 자연 환경 내에서 시공간적 분포를 해결하는 것은 매우 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 최근의 노력은 지역 사회 기능에 대한 공간 조직의 중요성을 강조하고 진행중인 연구 ^{2 , 3 , 4} 에서 회원 수와 조직 모두를 설명 할 필요성을 지적했다.

그것( 예 : 토양 구조, 식물 뿌리, 해양 입자 또는 장 미세 덩어리), 산소의 존재 또는 부재, 그리고 미생물의 도입과 같은 화학적 환경 ( 즉 , 영양소와 이차 대사 산물의 이용 가능성) 병원성 종은 모두 미생물 군집의 구성, 구조 및 기능에 영향을 미친다. ^{5 ,}

Protocol

1. 실리콘 마이크로 웰 어레이 제작

1. 파릴 렌 코팅
   1. 시판중인 파릴 렌 코팅 시스템을 사용하여 제조사의 사양 및 지침 (설정 : 기화기 설정 포인트 = 160 ° C, 퍼니스 설정 포인트 = 650 ° C)에 따라 실리콘 웨이퍼에 1-1.5 μm의 파릴 렌 N을 입금하십시오.
      참고 : 약 6 g의 파릴 렌 N을 챔버에로드하면 1-1.5 μm 두께의 코팅이 생성됩니다.
2. 포토 리소그래피
   1. 접착 촉진제 인 20 % 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS)과 80 % 프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA) ( 표 3 참조)를 사용하여 파릴 렌 N- 코팅 웨이퍼를 3,000 rpm으로 45 초 동안 스핀 코팅 하십시오. 접착 촉진제와 함께 2 ML 전송 피펫을 채우고 전체 웨이퍼에 뿌려. 회전시키기 전에 웨이퍼를 약 10 초 동안 그대로 두십시오.
   2. 양성 - 양성으로 2 mL 이동 피펫을 채 웁니다.ne photoresist ( 표 2 참조) 웨이퍼의 중앙에 포토 레지스트를 분배합니다. 약 1.5 μm 두께의 레지스트 코팅을 생....

Results

여기에 제시된 실험 플랫폼은 박테리아 공동체에 대한 높은 처리량과 높은 함량의 연구를 위해 고안되었습니다. 이 설계로 인해 다양한 크기의 우물에서 자라는 수천 개의 공동체를 동시에 분석 할 수 있습니다. 이 마이크로 웰 어레이 디자인을 사용하면 초기 종자 밀도, 우물 크기 및 화학적 환경에 대한 최종 커뮤니티 구성의 의존성을 결정할 수 있습니다. 이 작업은 마이크로 웰 어레이에서 2 인 커뮤니티의 성장을 보여주고 커뮤니티 구성 및 조직을 분석하는 방법을 제시합니다.

모델 시스템은 P. aeruginosa의 VI 형 분비를 연구하기 위해 Mougous 실험실에서 설계되었습니다. 이 시스템은 GFP 또는 mCherry 형광 기자를 포함하는 몇 가지 돌연변이 균주로 구성됩니다. 이 작품에서는 2 가지 다른 변형을 사용했습니다. 첫 번째는 GFP로 표.......

Discussion

이 기사에서는 박테리아 공동체 개발에 대한 높은 처리량 및 고감도 생체 이미징 기반 분석을 가능하게하도록 설계된 마이크로 웰 어레이 장치 및 실험 프로토콜을 발표했습니다. 여기 시위의 초점은 지역 사회 개발에 접촉 매개 형 VI 형 분비의 효과를 연구하는 것이었지만, 배열은 유연하고 다양한 미생물 군집 및 미생물 - 미생물 상호 작용에 대한 연구를 수용하도록 설계되었습니다. 여기에서의 작업은 구성원의 풍부함과 위치를 쉽게 추적 할 수 있도록 형광성 마커를 구성 적으로 표현하는 박테리아의 사용에만 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 화학 환경을 변화시킴으로써 성장 또는 섭동 후에 개별 우물에서 생물학적 물질을 샘플링 할 수있는 기회는 원칙적으로 지역 사회 조성 및 유전자 발현을 확인하는데 사용될 수있다.

각 실리콘 장치는 다양한 웰이있는 마이크로 웰을 포함하는 수십 개의 어레이로 구성됩니다.직경은 2x, 3x 또는 4x 직경 피치로 구성되며 3 & 3.5μm 사이의 깊이로 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Parylene N	특수 코팅 시스템	CAS NO.:1633-22-3
Parylene coater	특수 코팅 시스템	Labcoter 2 Parylene 증착 장치 PDS2010
실리콘 웨이퍼	WRS 재료	100mm 직경, 500-550μ m 두께, 프라임, 10-20 저항률, N / Phos< 100>,
접착 촉진제	Shin-Etsu, Microsci, MicroPrime	P20, 접착 촉진제
포지티브 톤 포토레지	Rohm and Haas Electronics Materials LLC(Dow 소유)	Microposit S1818, 포지티브 포토레지스트(코드 10018357)
Quintel Contact Aligner	Neutronix, Quintel Corp	NXQ 7500 마스크 Aligner,
반응성 이온 에칭 도구	, Oxford 악기	Plasmalab 시스템 100 반응성 이온 에칭기
R2A 육수	TEKnova	R0005
소 혈청 알부민	시그마	A9647
다중 모드 플레이트 리더	Perkin Elmer	Enspire, 2300-0000
형광 현미경	Nikon	Eclipse Ti-U
자동 스테이지	이전	ProScan III
CCD 카메라	Nikon	DS-QiMc
스테이지 탑 환경 제어 챔버	In Vivo Scientific	STEV ECU-HOC
인산염 완충 식염수	ThermoFisher Scientific	14190144
UltraPure Agarose	ThermoFisher Scientific	16500500
25 x 75 mm No. 1.5 coverslip	Nexterion	고성능 #1.5H 커버슬립
형광 참조 슬라이드	Ted Pella	2273
물리적 스타일러스 프로필로 KLA	Tencor	P-6
실험실 와이프	Kimberly Clark	Kimipe KIMTECH SCIENCE 브랜드, 34155
상용 소프트웨어	Nikon	NIS Elements
Zeiss 710 컨포칼 현미경	Zeiss
필터 큐브	니콘	니콘 FITC (96311), 니콘 텍사스 레드(96313)