격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

요약

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리가 칼슘 이미징 시스템에 의해 sarcoplasmic 그물 캘리포니아^{2 +} 예약 및 cardiomyocytes에 확장기 칼슘 제거 기능을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다.

초록

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 심장 sarcoplasmic 그물 (SR) Ca^{2 +} 수축, 어떤 reuptakes 세포내 캘리포니아^{2 +} 휴식 동안에 대 한 저수지 역할을 합니다. SR Ca^{2 +} 예약 비트 사용할 수 심장 contractibility에 대 한 결정 이며, 세포내 캘리포니아^{2 +} 의 제거는 심장 심장 확장 기능에 대 한 중요 한. 당뇨병과 심장 마비 같은 병 태 생리 조건에서 장애인된 칼슘 클리어런스 및 SR Ca^{2 +} 저장소 cardiomyocytes에 심장 부전의 진행에 관련 수 있습니다. 여기, 우리는 미술관^{2 +} 예약 및 확장기 Ca^{2 +} 제거 프로토콜을 설명 합니다. 간단히, 단일 cardiomyocyte 효소 고립 되었고 세포내 캘리포니아^{2 +} 형광 Fura-2에 표시 된 칼슘 이미징 시스템에 의해 기록 되었다. 총 SR 캘리포니아^{2 +} 릴리스 유도 대 한 카페인을 고용, 우리 interlinking 자극 시스템 및 관류 시스템에 의해 자동 관류 스위치 프로그램을 미리. 다음, 모노 지 수 곡선 피팅 칼슘 과도 및 카페인을 이용한 칼슘 펄스의 붕괴 시간 상수를 분석 하는 데 사용 되었다. 따라, 기여의 SR 캘리포니아^{2 +}-ATPase (SERCA) 및 Na⁺-캘리포니아^{2 +} 교환기 (NCX) 확장기 칼슘 제거를 평가 했다.

서론

세포내 칼슘 ([캘리포니아^{2 +}]_나) 재활용 cardiomyocytes¹에서 수축 기 및 확장기 함수 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 우리가 알고 있듯이, 칼슘 유도 Ca^{2 +} 릴리스는 수축 하는 전기 신호를 변환 시킵니다 흥분 수축 연결, 시작 합니다. 막 도발은 유도 캘리포니아^{2 + 2 +} 채널, SR에서 ryanodine 수용 체 2 (RyR2)를 통해 세포질으로 출시 sarcolemmal L 형 Ca를 활성화 합니다. 과도 높은 세포질 캘리포니아^{2 +} myofibrils의 수축을 시작합니다. SR 캘리포니아^{2 +}를 사용 하 여 SR에 reuptaken는 심장, 동안 세포질 캘리포니아^{2 +} -ATPase 2 (SERCA2)와 나⁺-캘리포니아^{2 +} 교환기 (NCX)²를 통해 cardiomyocyte 밖으로 펌핑. 이 프로세스는 cardiomyocyte 재활용 수축-이완 이끌어 낸다.

심장 SR은 세포내 막 네트워크 주변 수축 성 기계입니다. 그것은 캘리포....

프로토콜

모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 실험 연구 센터, 중국 과학 아카데미의 중국 의료 및 절 강 대학에 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 되었습니다.

1. 솔루션 준비

1. 표 1에 설명 된 대로 모든 솔루션을 준비.

2. 격리의 왼쪽 심 실 (LV) Cardiomyocytes

참고: LV cardiomyocytes는 효소 Langendroff 관류 시스템을 사용 하 여 앞에서 설명한 ^{7 , 8 , , 9 10 , 11}.

Langendroff 관류 시스템을 설정합니다. 관류 시스템 표준 Tyrode (NT) 솔루션, 36.5 ° C에서 온도 설정를 튜브에서 모든 기포를 제거.
1. 그리고 무게 chloral 하이드 레이트 (400 mg/k....

결과

여기, 우리가 설명 streptozotocin (STZ)-당뇨병 쥐 (DM)를 유도 및 나이 일치 Sprague-Dawley (SD) 쥐 예. 8 주 오래 된 남성 SD 쥐 (200 ± 20g) 컨트롤 그룹에 대 한 DM 그룹 또는 구 연산 염 버퍼 STZ (70 mg/kg, ip)의 단일 복 주사를 받았다. STZ 관리 후 1 주일 혈당과 쥐 > 16.7 mmol/L 당뇨병으로 간주 됐다. 8 주 후, LV myocytes 효소 격리 했다. 칼슘 reintroduction 후 myocytes 생존 상태에 남아 있는의 약 70-80%입니다. 막대 모양, 명확한 강선 및 안정적인 수축만 myocytes 기록 (그림 1B)에 대 한 선정 됐다. 그림 1A에서 같이, 우리 챔버 관류와 바늘 관류 myocytes에 대 한 설정 합니다. 관류 밸브 및 시스템 속도 자.......

토론

SR에서 발표 하는 칼슘 속은 systole에에서 대 한 주요 캘리포니아^{2 +} 소스입니다. 어느 정도, SR 캘리포니아^{2 +} 콘텐츠의 진폭 및 소수 Ca^{2 +} SR에서 발표 반영 SR Ca^{2 +} 예비 심장 수축에 사용할 수 있는. 다른 한편으로, SR의 Ca^{2 +} 예약에 따라 SR 캘리포니아^{2 +} 재흡수, SR의 캘리포니아^{2 +} 누출 그리고 그들의 균형의 능력 SR에 걸쳐 심장^12,,1314동안. 우리의 실험에서 10 mM 카페인의 신속한 응용 프로그램 총 캘리포니아^{2 +} 출시와 RyR 채널을 개방 하 여 SR에 캘리포니아^{2 +} 재흡수를 방지 유도 목적 이다. 따라서, 카페인 유발 Ca

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NaCl	알파 Aesar	012314
MgCl2	알파 Aesar	012315
KCl	알파 Aesar	11595
HEPEs	시그마	H3375
D-글루코스	Alfa Aesar	A16828
NaOH	알파 Aesar	A18395
KOH	알파 Aesar	A18854
KH2PO4	알파 Aesar	011594
MgSO4	알파 Aesar	3337
L-글루타민	Alfa Aesar	A15031
타우린	Alfa Aesar	A12403
EGTA	시그마	E3889
콜라겐 분해 효소 A	Roche	10103586001
콜라겐 분해 효소 유형 II	Worthington	LS004177
BSA	Roche	735094
카페인	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
현미경	올	림푸스 올림푸스 IX 71
Langendorff 시스템	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 링크
관류 챔버	IonOptix	FHD
밸브 제어 중력 관류 시스템	ALA	VC 3-8
밸브 커맨더 소프트웨어	ALA	VC 3 1.0.1.2
정밀 유량 조절기	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold 관류 연필	AutoMate Scientific	04-08-[360]
미크론 탈착식 팁	AutoMate Scientific	360um id.
형광 측정 및 세포 치수 측정 시스템	IonOptix	하이퍼스위치
기록 소프트웨어	IonOptix	IonWizard 6.2.59
자극기	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley 쥐	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436