격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

요약

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리가 칼슘 이미징 시스템에 의해 sarcoplasmic 그물 캘리포니아^{2 +} 예약 및 cardiomyocytes에 확장기 칼슘 제거 기능을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다.

초록

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 심장 sarcoplasmic 그물 (SR) Ca^{2 +} 수축, 어떤 reuptakes 세포내 캘리포니아^{2 +} 휴식 동안에 대 한 저수지 역할을 합니다. SR Ca^{2 +} 예약 비트 사용할 수 심장 contractibility에 대 한 결정 이며, 세포내 캘리포니아^{2 +} 의 제거는 심장 심장 확장 기능에 대 한 중요 한. 당뇨병과 심장 마비 같은 병 태 생리 조건에서 장애인된 칼슘 클리어런스 및 SR Ca^{2 +} 저장소 cardiomyocytes에 심장 부전의 진행에 관련 수 있습니다. 여기, 우리는 미술관^{2 +} 예약 및 확장기 Ca^{2 +} 제거 프로토콜을 설명 합니다. 간단히, 단일 cardiomyocyte 효소 고립 되었고 세포내 캘리포니아^{2 +} 형광 Fura-2에 표시 된 칼슘 이미징 시스템에 의해 기록 되었다. 총 SR 캘리포니아^{2 +} 릴리스 유도 대 한 카페인을 고용, 우리 interlinking 자극 시스템 및 관류 시스템에 의해 자동 관류 스위치 프로그램을 미리. 다음, 모노 지 수 곡선 피팅 칼슘 과도 및 카페인을 이용한 칼슘 펄스의 붕괴 시간 상수를 분석 하는 데 사용 되었다. 따라, 기여의 SR 캘리포니아^{2 +}-ATPase (SERCA) 및 Na⁺-캘리포니아^{2 +} 교환기 (NCX) 확장기 칼슘 제거를 평가 했다.

서론

세포내 칼슘 ([캘리포니아^{2 +}]_나) 재활용 cardiomyocytes¹에서 수축 기 및 확장기 함수 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 우리가 알고 있듯이, 칼슘 유도 Ca^{2 +} 릴리스는 수축 하는 전기 신호를 변환 시킵니다 흥분 수축 연결, 시작 합니다. 막 도발은 유도 캘리포니아^{2 + 2 +} 채널, SR에서 ryanodine 수용 체 2 (RyR2)를 통해 세포질으로 출시 sarcolemmal L 형 Ca를 활성화 합니다. 과도 높은 세포질 캘리포니아^{2 +} myofibrils의 수축을 시작합니다. SR 캘리포니아^{2 +}를 사용 하 여 SR에 reuptaken는 심장, 동안 세포질 캘리포니아^{2 +} -ATPase 2 (SERCA2)와 나⁺-캘리포니아^{2 +} 교환기 (NCX)²를 통해 cardiomyocyte 밖으로 펌핑. 이 프로세스는 cardiomyocyte 재활용 수축-이완 이끌어 낸다.

심장 SR은 세포내 막 네트워크 주변 수축 성 기계입니다. 그것은 캘리포니아^{2 +} , 수축에 대 한 저수지 역할을 하 고 reabsorbs 세포내 캘리포니아^{2 +} 휴식 중. SR 캘리포니아^{2 +} 예약 비트 사용할 수 심장 수축에 대 한 결정 이다. 한편, 세포내 캘리포니아^{2 +} 의 제거가 심장 심장에 대 한 중요 합니다. 일부 병 태 생리 조건 등 당뇨병과 심장 마비, 장애인된 캘리포니아^{2 +} 클리어런스 우울 SR 캘리포니아^{2 +} cardiomyocytes에 저장소 관련 되어있을 수 있습니다 심장 부전^{2,3 과정 ,4}.

SR 캘리포니아^{2 +} 릴리스 및 cardiomyocytes에 확장기 Ca^{2 +} 제거 측정, 널리 사용 되는 방법은 두 가지: 패치 클램프^5,6, 카페인 유발 Ca 기반으로 NCX 전류의 무결성 ^{2 +} 캘리포니아^{2 +} 형광 이미징^7,,89에 따라 펄스. 전 접근 그는 캘리포니아^{2 +} SR에서 발표는 크게 셀에서에 의해 펌핑 NCX 사실에 따라 달라 집니다. 그러나,이 접근의 고급 장비와 숙련 된 작업의 요구에 의해 제한 됩니다. 현재 연구에서 우리가 SR 캘리포니아^{2 +} 예비 그리고 캘리포니아^{2 +} 제거 myocytes에서 카페인 유발 Ca^{2 +} 펄스는 캘리포니아^{2 +} 형광 이미징 시스템에 따라 측정 하 여 평가 하는 편리한 접근 방식을 설명 합니다. 간단히, 세포내 캘리포니아^{2 +} 형광 Fura-2로 표시 됩니다. Interlinking 자극 시스템 및 관류 시스템, 선물이 관류를 전환 하 고 시스템을 자동으로 속도 위한 프로그램. 10mm 카페인 빠르게는 미스터에 총 캘리포니아^{2 +} 출시를 유도 하기 위해 고용 되었다 지 수 감퇴 시간 상수 (타우) 칼슘 과도 및 카페인을 이용한 칼슘 펄스의 확장기 캘리포니아^{2 +} 제거 SERCA NCX의 기여를 적절 하 게 반영 하는 피팅, 모노 지 수 곡선에서 얻은 했다.

프로토콜

모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 실험 연구 센터, 중국 과학 아카데미의 중국 의료 및 절 강 대학에 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 되었습니다.

1. 솔루션 준비

1. 표 1에 설명 된 대로 모든 솔루션을 준비.

2. 격리의 왼쪽 심 실 (LV) Cardiomyocytes

참고: LV cardiomyocytes는 효소 Langendroff 관류 시스템을 사용 하 여 앞에서 설명한 ^{7 , 8 , , 9 10 , 11}.

Langendroff 관류 시스템을 설정합니다. 관류 시스템 표준 Tyrode (NT) 솔루션, 36.5 ° C에서 온도 설정를 튜브에서 모든 기포를 제거.
1. 그리고 무게 chloral 하이드 레이트 (400 mg/kg)의 복 주사 (ip)에 의해 Sprague-Dawley 쥐를 anesthetize. 5 분 후 꼬리 또는 발가락을 꼬집어 응답을 평가 하 여 마 취 상태 확인
2. 수술 시저와 칼 프로세스 아래 복 부 구멍을 열고, 칼 프로세스 들어올린는 시저와 가슴을 열고. 심 낭을 제거, 약간 리프트 심장 곡선된 겸 자와, 대동맥 아치, 식별 및 대동맥의 루트에서가 위, 심장 차단.
3. 60 mm 접시에는 마음을 전송 하 고 NT 솔루션으로 그것을 씻어. 대동맥 두 마이크로 해 부 집게와 고 Langendorff 관류 정에 마운트 누른 다음 단단히 대동맥 수술 봉합을 사용 하 여 정 맥에 선.
   참고: 숙련 된 연산자 15이이 프로세스를 완료할 수 있다 s.
4. 심장 관상 동맥의 순환 회복을 30 mL NT 솔루션 perfuse. 그런 다음 Ca ^{2 +} 30 mL는 perfusate 전환-무료 Tyrode 솔루션 (10 mM 황소자리, 1 mg/mL BSA)는 심장 박동을 중지. 다음, 효소 소화의 콜라 A 격리 솔루션 (0.6 mg/mL)는 perfusate 전환.
   참고: 당뇨병 쥐 없이 당뇨병 쥐, 또는 콜라 II와 실험에 대 한 실험에 대 한 사용 콜라 A.
5. 소화 20-25 분, 후 신속 하 게 변경 관류 솔루션 캘리포니아 ^{2 +}-무료 Tyrode 솔루션 추가 소화 중지. 다음, 집게로 마음을 잡고, 정에서 그것을 잘라 고 KB 솔루션을 포함 하는 35 mm 접시에는 마음을 배치 (표 1 참조).
6. LV 벽 집게와가 위를 해 부. 심 방, 우 심 실 및 것 접합 영역을 잘라. 나머지 조직이 이다 라스베가스; KB 솔루션과 새로운 35 mm 접시에 그것을 전송. 작은 조각으로 LV 조직 말하다.
7. 부드럽게 필터링 된 플라스틱 스 포 이트와 조각 플라스틱 하 고 다시 10 mL KB 솔루션에 중단.
8. 150 µ m 조리개 스테인레스 스틸 필터와 15 mL 원심 분리기 튜브에 셀 필터링. 30 s 및 삭제는 상쾌한 150 x g에서 원심. 다시 10 mL KB 솔루션, 무료 myocytes 정착 6 분에 대 한 일시 중단 상쾌한, 삭제 하 고 다시 10 mL KB 솔루션에 펠 릿을 중단.
   참고: 모든 단계 솔루션 100% O ₂ 기름에 36 ° C에서 수행 했다.

3. 칼슘 Reintroduction

1. KB 솔루션에서 20 분 동안 정착 후 상쾌한, 삭제 하 고 다시 칼슘 reintroduction 솔루션 A myocytes를 일시 중지 (0.3 m m 캘리포니아 ^{2 +}, 4.5 mL 캘리포니아 ^{2 +}-무료 Tyrode 솔루션, 1.5 mL NT 솔루션) 10 분에 대 한
2. 칼슘 reintroduction 솔루션 B 위의 절차를 반복 (0.3 m m 캘리포니아 ^{2 +}, 3 mL 캘리포니아 ^{2 +}-무료 Tyrode 솔루션, 3 mL NT 솔루션).
3. NT 솔루션 (1.2 m m 캘리포니아 ^{2 +}) 가능한 myocytes 정화 위의 절차를 반복 합니다. 이 솔루션에서 격리 된 LV myocytes를 저장 하 고 4-6 헤 내 공부

4. 설정 최대의 관류 시스템

1. 챔버 관류 ( 그림 1A)에 대 한 NT 솔루션 유입 튜브를 연결.
2. 대상 myocyte의 바늘 관류에 대 한 연결 (예를 들어, 관류 연필, 연필 이제부터 하 라고) 멀티 배럴 매니폴드 팁는 micromanipulator에 고정, 관류 시스템 제어 밸브에. 연필 ( 그림 1A)의 각 열에 NT 솔루션 및 10mm 카페인 솔루션 추가.
3. 어떤 공기 방울을 공기 막힘을 피하기 위해 튜브에 대피.
4. 물방울 개수 미크론 팁에서 10 연필 s, 수동으로 조정 흐름 레 귤 레이 터 3 물방울/10 미의 대략적인 속도에서 흐름의 속도 유지 하 고

5. 측정 세포내 캘리포니아 ^{2 +} 변이 및 Sarcomere 단축 ^{7 , , 8 9}

1. 슬라이드에서 피 펫 10 µ L 세포 현 탁 액 현미경, 셀 카운터로 핸드폰 번호를 계산 하 고 밀도 계산. 50, 000 셀/mL의 대략 농도에 myocytes 희석.
2. 추가 Fura-2 acetoxymethyl (오전) 주식 (칼슘 민감한 염료) 2 µ M. 최종 농도가지고 myocytes의 1 mL 정지로 실 온에서 20 분 동안 어둠 속에서 유지.
3. 30 s, 그리고 다시 중단 NT 솔루션 cardiomyocytes 2 번에 대 한 150 g에서 원심 분리기.
4. 차례 빛와 어둠 속에서 셀을 계속. 15 분 동안 관류 챔버에 myocytes 장소. 그런 다음 NT 솔루션 챔버 관류 (1.5 mL/min)를 시작 합니다. 5 분에 대 한 자극 (파 기간 4.0 ms, 펄스 진폭 8.0 V)를 사용 하 여 1 Hz 필드 자극에 myocytes 속도
5. 좋은 모양 myocyte 선택 (막대 모양, 가장자리, 샤 프와 크로스 강선 취소) 및 현미경 대물 렌즈 10x에서 안정적인 자극된 경련 (자발적 수축). 다음, 40 x, 현미경 배율 변경 하 고 수평 위치에 있는 myocyte를 유지 수 있는 CCD 카메라 방향 회전.
6. 셀 프레임 어댑터를 조정 하 여 단일 myocyte 프레임. 배경 지우기 확인.
7. 340 또는 380 nm 파장 여기 필터와 크 세 논 램프에서 방출 되는 빛에 myocytes 고 40 x 목표를 통해 myocytes 이미지. 510에서 형광 신호를 감지 nm. 한편,는 myocytes의 sarcomere 길이 변화 및 소프트에 지 모듈을 사용 하 여 동시에 녹화.
듀얼-여기 형광 광 전 증폭 관 시스템의 기록
8. 형광 칼슘 이미징 시스템의 녹음 프로그램 실행, 클릭 합니다 " 파일/새 파일 " 새로운 기록 파일을 만들고 클릭 하는 " 시작 "를 동기적으로 형광 및 sarcomere 버튼.

6. SR 캘리포니아 ^{2 +} 예약 및 확장기 캘리포니아 ^{2 +} 제거 기능 ^{7 , , 8 9} 평가

1. Interlink는 " 보조 아웃 "에 포트 와 자극 기는 " 아날로그에 " 밸브 제어 시스템에 포트 (예를 들어, 밸브 사령관, 재료의 표 참조) BNC 케이블 (TTL 신호를 동기화)을 여.
2. 미리 관류 밸브를 자동으로 앞에서 설명한 ^{8 , 9}; 전환 프로그램 작업에 대 한 자세한 내용은 다음과 같습니다.
   1. 프리셋 밸브에서 매개 변수 표 2에 의하여 소프트웨어를 제어 하 고 클릭에 " 다운로드 " 다운로드 순서 단추를 프로그램에 로드 된. 클릭은 " Trigg어 " 트리거 기능을 사용 하도록 단추.
      참고: 밸브 제어 시스템 TTL 신호를 받은 후 시퀀스를 실행할 수 있습니다.
   2. 미리 시퀀스 모드를 자극 하 고 표 3에 의하여 매개 변수 설정.
3. 설정에서 자극 기 " s 1 단계 " LV 페이스를 myocytes에서 1 Hz. NT 솔루션 1.5 mL/min의 속도로 바늘 관류 시작.
   참고: 챔버 관류 보다 바늘 스트림의 속도 이므로 바늘 스트림의 빛 굴절은 다릅니다 챔버 관류의 빛 굴절. 빛 굴절의 차이 대상 myocyte를 포위 하는 효과적인 바늘 관류의 범위를 나타냅니다.
4. (순서로 다운스트림 업스트림 하의), 낮은 전력 미세한 보기 아래 대상 myocyte를 선택 하 고 있는지 확인 하십시오 그것은 연필의 마이크로 팁에 의해 도달 될 수 있다. 400 x 현미경 배율을 변경 합니다. CCD 카메라 방향을 수평 위치에 있는 myocyte를 계속 회전 합니다. 셀 프레임 어댑터는 myocytes 채웁니다 적당 한 창 아래 사각형 조리개를 조정 합니다. 최소한의 배경; 인지 확인 다른 myocytes 또는이 창에서 죽은 세포 파편을 허용 하지 않습니다.
5. Micromanipulator에 고정 하는 연필의 위치를 조정 하 고 신중 하 게 마이크로 팁 현미경 배율 x 400 미만 대상 myocyte 비전 필드의 반지름의 거리에서 장소.
6. 주로 대상 myocyte를 커버 하는 myocyte 수 없습니다 휩 쓸 바늘 흐름 확인을 바늘 스트림 범위 조정.
7. 후 60 s 기본 자극 커서를 롤, 속도 " d 2 단계 ".
   참고: 프로토콜의 나머지 자극 기 밸브 제어 시스템에 의해 자동으로 실행 될 것입니다. 위의 설정에 따라 프로토콜 수 자동으로 실행 될 그림 2A, 1 Hz 60 NT 솔루션으로 서 기본에서 s. 성 고 2 지연 일시 중지 s, 10mm 카페인 관류 15로 빠르게 전환 s (기능 SR에서 캘리포니아 ^{2 +} 스토리지 출시), 다음 NT 솔루션으로 다시 전환 하는 고.
8. 개별 myocytes의 배경 형광 검출 기록의 끝에. 클릭은 " 일시 중지 " 근처 빈 영역에 미세한 보기 이동 파일 녹음, 일시 정지 버튼. 클릭은 " 기록 " 초, 녹화 재개 버튼 및 숫자 340 및 380 nm 강도 값 배경 보정에 대 한 기록.
9. 오픈는 " 작업/정 "에 값을 입력 하 고 대화 상자는 " 배경 " 형성, 각각, 소프트웨어 백그라운드를 빼서 Fura 2 비율 값을 수정할 수 있습니다.

7. 데이터 분석 ⁹

1. 칼슘 과도 및 기본 서 성 단계에서 단축 sarcomere의 측정, 평균 트 위치 펄스, 고 칼슘 과도의 시간 상수 같은 동적 매개 변수 분석 칼슘 과도 감퇴 (타우 1 Hz) 자동으로 소프트웨어를 사용 하 여.
   참고: 소프트웨어 부패 세그먼트에 잘 맞지 않는, 수동 모노 지 수 곡선 맞춤에 대 한 감소 추적 내보냅니다.
2. 카페인 유발 칼슘 펄스에 대 한 칼슘 제거 기능 분석에 대 한 가파른 파도 펄스를 선택. 신호 방해, 비정상적인 펄스, 또는 멀리 미드웨이 흘러 그 셀 제외.
3. 카페인 유발 칼슘 펄스 (Ca-카페인, 미술관 ^{2 +} 예비에의 인덱스)의 진폭을 측정.
4. 모노 지 수 곡선 피팅 (10 s 내구) 수동으로 소프트웨어 ( 그림 2C)에서 카페인을 이용한 칼슘 펄스 (타우-카페인)의 붕괴 시간 상수 얻을.

결과

여기, 우리가 설명 streptozotocin (STZ)-당뇨병 쥐 (DM)를 유도 및 나이 일치 Sprague-Dawley (SD) 쥐 예. 8 주 오래 된 남성 SD 쥐 (200 ± 20g) 컨트롤 그룹에 대 한 DM 그룹 또는 구 연산 염 버퍼 STZ (70 mg/kg, ip)의 단일 복 주사를 받았다. STZ 관리 후 1 주일 혈당과 쥐 > 16.7 mmol/L 당뇨병으로 간주 됐다. 8 주 후, LV myocytes 효소 격리 했다. 칼슘 reintroduction 후 myocytes 생존 상태에 남아 있는의 약 70-80%입니다. 막대 모양, 명확한 강선 및 안정적인 수축만 myocytes 기록 (그림 1B)에 대 한 선정 됐다. 그림 1A에서 같이, 우리 챔버 관류와 바늘 관류 myocytes에 대 한 설정 합니다. 관류 밸브 및 시스템 속도 자...

토론

SR에서 발표 하는 칼슘 속은 systole에에서 대 한 주요 캘리포니아^{2 +} 소스입니다. 어느 정도, SR 캘리포니아^{2 +} 콘텐츠의 진폭 및 소수 Ca^{2 +} SR에서 발표 반영 SR Ca^{2 +} 예비 심장 수축에 사용할 수 있는. 다른 한편으로, SR의 Ca^{2 +} 예약에 따라 SR 캘리포니아^{2 +} 재흡수, SR의 캘리포니아^{2 +} 누출 그리고 그들의 균형의 능력 SR에 걸쳐 심장^12,,1314동안. 우리의 실험에서 10 mM 카페인의 신속한 응용 프로그램 총 캘리포니아^{2 +} 출시와 RyR 채널을 개방 하 여 SR에 캘리포니아^{2 +} 재흡수를 방지 유도 목적 이다. 따라서, 카페인 유발 Ca

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NaCl	알파 Aesar	012314
MgCl2	알파 Aesar	012315
KCl	알파 Aesar	11595
HEPEs	시그마	H3375
D-글루코스	Alfa Aesar	A16828
NaOH	알파 Aesar	A18395
KOH	알파 Aesar	A18854
KH2PO4	알파 Aesar	011594
MgSO4	알파 Aesar	3337
L-글루타민	Alfa Aesar	A15031
타우린	Alfa Aesar	A12403
EGTA	시그마	E3889
콜라겐 분해 효소 A	Roche	10103586001
콜라겐 분해 효소 유형 II	Worthington	LS004177
BSA	Roche	735094
카페인	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
현미경	올	림푸스 올림푸스 IX 71
Langendorff 시스템	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 링크
관류 챔버	IonOptix	FHD
밸브 제어 중력 관류 시스템	ALA	VC 3-8
밸브 커맨더 소프트웨어	ALA	VC 3 1.0.1.2
정밀 유량 조절기	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold 관류 연필	AutoMate Scientific	04-08-[360]
미크론 탈착식 팁	AutoMate Scientific	360um id.
형광 측정 및 세포 치수 측정 시스템	IonOptix	하이퍼스위치
기록 소프트웨어	IonOptix	IonWizard 6.2.59
자극기	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley 쥐	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436