방법 논문

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

DOI:

10.3791/55818

⸱

2017년 6월 30일

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1Department of Large Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

이 논문에서

요약

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여기에서는 MCS (Magnetic-activated Cell Sorting)를 사용하여 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)에서 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 개체군을 분리하는 방법을보고합니다. 이 방법은 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)와 비교할 때 지방 조직 1g 당 APC의 증가 된 분리를 허용합니다.

초록

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Paracrine 신호를 통한 혈관 기능의 주요 조절자인 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)의 확장은 비만 동안 고혈압 발생과 직접적으로 관련이 있습니다. 비대 및 증식의 정도는 저장소 위치, 성별 및 존재하는 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 표현형의 유형에 달려 있습니다. 지난 10 년 동안 APC와 전 지방 세포 분리에 사용 된 기술은 특정 세포 표면 마커를 기반으로 개별 세포를 식별 할 수있는 정확성을 획기적으로 향상 시켰습니다. 그러나 APC와 지방 세포의 분리는 세포의 취약성으로 인해 어려움이 될 수 있습니다. 특히 손상되지 않은 세포가 세포 배양에 사용되어야하는 경우 특히 그렇습니다.

MCS (Magnetic-activated Cell Sorting )는 지방 조직의 무게 단위 당 더 많은 수의 APC를 분리하는 방법을 제공합니다. MCS에 의해 수확 된 APC 는 시험 관내 프로토콜에 사용되어 prea세포에 의해 유지되는 다작 및 지방 형성 잠재력의 분석을 허용하는 성장 인자 칵테일의 사용을 통해 지방 세포로 이들을 분화시킨다. 이 실험은 대동맥 및 장간막 PVAT 저장소에 초점을 두었습니다.이 저장소는 확장 중에 심혈관 질환 발병에서 중요한 역할을합니다. 이 프로토콜은 정의 된 APC 인구를 분리, 확장 및 차별화하는 방법을 설명합니다. 이 MCS 프로토콜을 사용하면 최소한의 장비 또는 교육으로 세포 정렬이 필요한 모든 실험에서 격리를 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 세포 표면 마커의 존재를 기반으로 특정 세포 인구의 기능을 결정하기 위해 추가 실험을 도울 수 있습니다.

서론

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혈관과의 근접성 때문에 혈관 주위 지방 조직 (Perivascular Adipose Tissue, PVAT)은 혈관 기능 1 에서 중요한 파라 크린 신호 전달 요소입니다. 이 지방 조직의 팽창은 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cells, APC)의 표현형에 따라 다릅니다 2 , 3 . 지방 세포로부터의 분리는 주요 지방 세포가 약하고 부력이 있고 크기가 다양하기 때문에 어렵습니다. 특정 분리 기술은 또한 염증 단백질 합성을 증가시키고 지방 생성 유전자 발현을 감소시킴으로써 세포 표현형 및 형태를 변화시킬 수 있으며, 세포의 완전성을 유지하는 프로토콜의 중요성을 강조한다.

1 차 세포 ​​및 특이적인 전 지방 세포 모집단의 배양 은 생체 내 성장 에 대한 환원 주의적 접근법을 제공하고, 동등한 세포 유전 학적 구성을 유지한다.이 세포들을 가지고있는 노화는 노화 또는 노화로 인한 악화로 인해 제한됩니다 6 . 피하 및 망막 저장소를 비롯한 다양한 지방 저장소의 전 지방 세포는 또한 특정 해부학 적 부위에서 세포를 수집하는 중요성을 강조하는 증식의 차이를 보여준다. 비 PVAT 백색 지방 저장소의 선구 세포는 이전 연구 7,8,9에서 특징 지어졌지만 PVAT APC 표현형에 대해서는 알려진 바가 적다.

여기에 설명 된 기술은 형태와 생존력, 증식 및 분화 가능성에 미치는 영향을 최소화하면서 특정 APC 집단과 정의 된 APC 집단을 분석 할 수 있습니다. MCS (Magnetic-Activated Cell Sorting)는 배양액과 같이 다운 스트림 응용 분야에 적합합니다. 구슬이 세포를 변경하지 않고 용해되기 때문입니다. MCS는 또한 경제적이며 일단 항체가 손상되면농도가 표준화 되었기 때문에 유동 세포 계측법의 필요성은 미미합니다. PVAT 선구 물질에 대한 시험 관내 연구는 또한 이러한 일차 세포가 가질 수있는 잠재력을 엿볼 수 있습니다.

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프로토콜

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이 문서에 설명 된 모든 절차는 Michigan State University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 제정 한 지침을 따릅니다. 모든 버퍼와 미디어는 빛으로부터 보호되어야합니다.

1. 버퍼, 미디어 및 기기 준비

  1. Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered 용액 (KRBB) 준비 : 135 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼륨, 1 mM 황산 마그네슘, 0.4 mM 인산이 수소 칼륨, 5.5 mM 포도당, 1 % 항생제 / 항균제 (10,000 units / mL 페니실린, 10,000 μg / mL 스트렙토 마이신, 25 μg / mL 암포 테리 신 B) 및 10 mM HEPES (pH = 7.4). 이 용액은 4 ℃에서 멸균 한 상태에서 3 주 동안 안정하다.
  2. Collagenase Type 1 용액을 준비하십시오 : 4 % Bovine Serum Albumin (BSA)가 함유 된 KRBB 1mg / mL. 이 용액은 37 ° C에서 보관해야하며 4 시간 동안 안정합니다.
  3. 적혈구 용해 용액 준비 : 154 mM ammonium chloride, 10 mM potassium bicarbonate, 및 0.1 mM EDTA. 4 ° C에서 최대 1 개월간 보관하십시오.
  4. MCS 차단 버퍼 : DMEM / F12 미디어베이스, 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 5 % 정상 당나라 혈청, 40 μL / ML F (ab) 단클론 항 쥐 IgG를 준비합니다. 4 ° C에서 최대 1 개월간 보관하십시오.
  5. MCS 완충 용액 준비 : 인산염 완충 식염수 (PBS, pH = 7.5), 0.5 % BSA 및 2mM EDTA. 4 ° C에서 최대 1 개월간 보관하십시오. 유리 용기에 넣고 37 ° C로 가열 한 후 15 초 동안 진공을 가하여 De-gas 용액을 만든다. 사용하지 않은 상태로 봉인 된 상태로 두십시오.
  6. FBS, FCS, 1 % 항생제 / 항균제 (10,000 units / mL 페니실린, 10,000 μg / mL 스트렙토 마이신, 25 μg / ml), Dalbecco 's Modified Eagles Medium (DMEM) / ml amphotericin B), 44.05 mM 중탄산 나트륨, 100 μM 아스코르브 산, 33 μM 비오틴, 17 μM 판토텐산, 2 mM L- 글루타민 및 20 mM HEPES. 4 ° C에서 2 주 동안 무균 상태로 유지하십시오.
  7. APC &표피 성장 인자 10 ng / mL, 백혈병 억제 인자 (10 ng / mL), 혈소판 유도 성장 인자 BB (10 ng / mL) 및 염기성 섬유 모세포 성장 인자 5 ng / mL). 4 ° C에서 2 주 동안 무균 상태로 유지하십시오.
  8. APC 유도 배지 : 10 % FBS, 2.5 μg / mL 인슐린, 0.5 mM 2-isobutyl-1-methylaxanthine (IBMX), 1 μM dexamethasone 및 200 pM T3 (triiodothyronine 갑상선 호르몬)가 포함 된 APC Media를 준비하십시오. 4 ° C에서 2 주 동안 무균 상태로 유지하십시오.

2. 지방 세포 전구 세포 분리

  1. 기관 지침에 따라 쥐를 마취. 쥐를 등받이에 놓습니다. 발가락 핀치를 통한 마취 깊이와이 고통스러운 자극에 대한 반사 반응의 상실을 확인하십시오.
    참고 :이 프로토콜은 10 주 된 Sprague Dawley 쥐와 70 mg / kg의 pentobarbital을 복강 내 주사를 통해 전달합니다.
  2. 수직 정중 절개를 만들어라.흉골 부위의 흉골과 회음부의 가위. 복강에 접근하여 상 장간막 동맥, 작은 장간막 저항 혈관 (mPVAT) 및 흉부 대동맥 (aPVAT)을 노출시킵니다.
    1. 장간막과 대동맥에 모든 연결을 단절하고 동물에서 혈관을 제거하십시오. 해부 현미경과 KRBB로 가득 찬 페트리 접시를 사용하여 PVAT를 분리하고 혈관을 관찰하고 PVAT를 분리합니다.
    2. 이 실험에서는 비 PVAT 지방 저장소를 나타내는 생식선 (Gonadal, GON)을 수집합니다. 10 밀리미터 HEPES (산도 = 7.4)와 KRBB에 얼음에 격리 지방 패드를 놓으십시오.
    3. 바이오 안전성 (biosafety) 두드림에서 조직 약 50 mg을 콜라게나 제제 I 용액 1 mL가 들어있는 1.7 mL 튜브에 옮기고 조직 가위 (1 - 3 mm 조각)로 말하다.
  3. 1 시간 동안 rotisserie 인큐베이터 (또는 궤도 진탕기를 가진 인큐베이터)에서 37 ° C에서 배양하여 샘플을 소화합니다. biosafety 후드에서 100과 40을 통해 소화 된 물질을 순차적으로 걸러냅니다. μm 세포 스트레이너를 50 mL 튜브에 넣었다. 생성 된 여과 액을 4 ℃에서 원심 분리하여 300 x g에서 10 분간 원심 분리한다.
    참고 : 여기에서 프로토콜의 모든 단계는 세포를 살균 유지하기 위해 생물 안전성 보닛에서 수행되어야합니다.
  4. SVX 세포가 들어있는 상등액과 resuspend 펠렛을 1X 적혈구 용적 완충 용액 1 mL에 넣고 1.7 mL 미세 튜브에 옮긴다. 빛으로부터 보호 된 RT에서 5 분간 세포를 인큐베이션하고 4 ℃에서 300 x g에서 5 분간 원심 분리한다.
  5. SVF Basal Media에 상청액을 붓고 남아있는 세포 펠렛을 재용 해하십시오. Trypan 블루 솔루션으로 살아있는 세포를 계산하기 위해 20 μL 하위 샘플을 수집합니다.
    참고 : 격리 할 수있는 SVF 셀의 수는 사이트마다 다릅니다. 조직 1mg 당 평균 SVF 수는 다음과 같습니다. aPVAT = 5.0 ± 2.0x10 3 , mPVAT = 1.04 ± 0.62x10 4 , GON = 2.4 ± 1.2x10.

3. 자기 활성화 셀 정렬

_content "> 참고 : 4 ℃에서 모든 단계를 수행하여 CD34 및 PDGFRα 세포 표면 마커를 기반으로 SVF에서 APC를 분리합니다.

  1. 300 x g에서 5 분간 세포를 회전시킨다. 뜨는을 붓고 1 X 10 6 세포 / ML에서 MCS 차단 버퍼에 세포 펠렛을 resuspend 20 분 동안 품어.
    참고 : 1x10 6 - 2 x 10 8 세포 / mL의 세포 현탁액을 효과적으로 분리 할 수 ​​있습니다.
  2. 4에서 30 분 동안 FITC - 결합 마우스 안티 CD34 (1 μg / 1 X 10 6 셀) 5 μL와 세포를 품어 ° C. 300 xg 및 4 ° C에서 5 분간 세포를 스핀.
    1. 항 -FITC 마이크로 비드 4 μL와 4 ° C에서 5 분간 MCS 완충액 96 μL (총 부피 100 μL)와 함께 항온 배양하여 CD34 + 및 CD34 - 세포를 분리한다.
  3. 자성 분리기를 스탠드에 부착하고 컬럼 날개가 앞쪽에있는 MultiSort (MS) 컬럼을 분리기에 넣으십시오. 5 mL포집 관을 상부 관 홀더의 MS 칼럼 아래에 놓는다.
  4. MCS Buffer Solution으로 헹구어 MS Column을 준비하십시오. 컬럼 상단에 500 μL의 MCS Buffer를 넣고 완충액을 통과 시키십시오. 유출 물을 버리고 수거 튜브를 교체하십시오.
  5. 준비된 MS 칼럼에 항체 표식 세포 현탁액을 적재하십시오. 레이블이없는 세포가 들어있는 플로우 스루를 수집하십시오.
  6. 탈기 된 MCS 완충액 3x 500 μL로 MS 칼럼을 세척하십시오. 이전 단계에서 통과 흐름과 결합하여 전달 unlabeled 세포를 수집합니다.
  7. 마그네틱 분리기에서 MS 컬럼을 제거하고 새로운 수집 튜브에 놓습니다. MS 칼럼에 MCS 완충액 1 mL 피펫. 즉시 자석으로 표시된 세포로 분획을 즉시 플러싱하지만, 칼럼과 함께 제공된 플런저를 천천히 적용하여 과잉 가스가 칼럼에 들어 가지 않도록하십시오.
    참고 : 격리 된 셀 번호는 사이트마다 다릅니다. SVF 집단으로부터 분리 된 CD34 + APC의 평균 수조직의 mg은 aPVAT = 2.6 ± 0.43x10 2 , mPVAT = 9.6 ± 1.4x10 2 , GON = 1.3 ± 0.22x10 3 이다.
  8. 300 × g 및 4 ℃에서 5 분간 세포를 스핀. 4시 30 분 1시 200 분 솔루션 / 1 X 10 6 세포 토끼 항 PDGFRα 10 μL에 수집 된 CD34 + 분만 품어 ° C.
    1. 300 XG 및 4 ° C에서 5 분 동안 세포를 다시 원심 분리하십시오. 분리 된 단계 3.3 ~ 3.7을 반복하여 안티 토끼 IgG microbeads 4 μL와 MCS 버퍼 96 μL로 표시된 세포를 품어.
      참고 : 격리 된 셀 번호는 사이트마다 다릅니다. 조직 1mg 당 CD34 + 개체군으로부터 분리 된 PDGFRα + APC의 평균 수는 aPVAT = 2.4 ± 0.64, mPVAT = 8.4 ± 2.4, GON = 10.4 ± 1.9이며 이는 이전에 격리 된 개체군의 0.5-10 %이다.

4. 세포 배양 및 Adipogenesis 유도

  1. SVF 문화및 2 일마다 교체하는 기초 배지의 6-Well 조직 배양 판에서의 APC. 3 연속 통로 후, 8 웰, 24 웰, 48 웰 및 96 웰에서 평가되는 증식 검정을위한 1 x 10 2 세포 / 웰의 검정색 96 웰 웰 배양 플레이트 및 24 웰 플레이트 또는 50,000 세포 / 웰에서의 플레이트 질적 및 정량적 인 지방 생성 분석을위한 48-Well 조직 배양 플레이트에서 10,000 세포 / 웰.
  2. 분화를 위해 표시된대로 뼈 형태 형성 단백질 4 (3.3 nmol / L)로 유도하기 전과 48 시간 후의 합류 후 APC 기초 배지 보충. APC 유도 미디어를 사용하여 세포를 부화시키기 위해 100 % confluency (0 일) 48 시간 후 세포를 유도하십시오.
  3. 48 시간 후, 미디어를 변경하여 IBMX 및 dexamethasone이없는 APC 유도 매질에서 14 시간 동안 세포를 유지하고 매 48 시간마다 배지를 교환하십시오.
  4. FACS에 의해 검증 된 MCS 격리.
    1. 자기 적으로 분리 된 50 μL (50,000 셀)의 하위 샘플을 가져옵니다.FACS 용액으로 세척 하였다.
    2. 원심 분리기 세포와 PDGFRα + 세포를 라벨에 당나귀 안티 - 토끼 IgG Dylight 405의 1 : 1,000 솔루션 100 μL에 resuspend. 빛과 4 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.
    3. Flow cytometer에서 488 nm (FITC) 및 405 nm (Dylight 405) 필터를 사용하여 분석 할 때까지 세포를 세척하고 2 % 포름 알데히드 용액 200 μL로 resuspend하십시오.
      참고 : 배양 된 세포에 의한 지질 축적은 형광을 측정하는 마이크로 플레이트 판독기에서 지방 친화 지방 세포 형광 분석을 사용하여 정량적으로 평가되고 지질 축적을위한 교정자로 전 지방 세포를 사용합니다. 지질 축적은 또한 지질 염색 및 세포가 지질을 함유하지 않는 전체 세포의 비율을 관찰 할 수있는 역상 현미경에서 수행되는 영상화에 의해 정 성적으로 측정됩니다. 485 nm에서 여기와 572에서 방출로 형광을 측정 할 수있는 모든 플레이트 판독기nm는 디지털 이미지를 캡처 할 수있는 카메라가있는 모든 현미경뿐만 아니라 분석에도 적합합니다.

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결과

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전 지방 세포의 증식 능력과 지방 세포 전구체의 지방 형성 잠재력은 시험 관내에서 유지 되는 특성이다 11 . 정량적 DNA 분석을 사용하여 도금 후 8, 24, 48 및 96 시간에 수컷 랫트의 aPVAT, mPVAT 및 GON으로부터 분리 된 SVF 및 APC의 시험 관내 증식을 평가 하였다. 같은 장소의 SVF 세포와 비교하여 96 시간까지 증식이 적은 aPVAT의 APC를 제외하고는 모든 시점에서 SVF 팽창률의 차이가 관찰되지 않았다 ( 그림 1 ).

Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4)로 자극 한 컨 플루 언트 APC는 표준 유도 전 48 시간 동안 분화를 보였다. 이것은 형광 지질 ...

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토론

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현재 실험의 중심은 PVAT 저장소에서 APC를 분리, 확장 및 지방 생성 유도하는 것입니다. 여기서 우리는 표면 마커 CD34 및 PDGFRα를 발현하는 세포의 동정에 기초한 APC의 분리 프로토콜을 제시한다. 이러한 표면 단백질은 이전 APC에서 높은 증식 속도와 다양한 지방 저장소 14 , 15 에서 흰색 또는 갈색 지방 세포로 분화 할 잠재력으로 확인되었습니다. 이러한 특정 마커를 기반으로 세포를 선택함으로써 우리는 선택된 PVAT에서 관찰되는 지방 세포 표현형과 일치하는 여러 지방 저장소에서 유사한 APC 개체군을 분리 할 수있었습니다. 우리의 실험에서 우리는 성장 인자 BMP4를 보충함으로써 APC 분화를 향상시켰다. 이전에 Macotela와 동료들은 내장 지방 저장소의 특정 APC 집단이배양 배지에 지방 성장 인자 BMP2 또는 BMP4가 보충되지 않으면 분화 될 때 피하 저장소

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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Contreras와 Watts Laboratories와 William Raphael 박사. 이 실험은 NHLBI F31 HL128035-01 (조직 분해 프로토콜 표준화), NHLBI 5R01HL117847-02 및 2P01HL070687-11A1 (동물) 및 NHLBI 5R01HL117847-02 (세포 분리 및 배양)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Tissue Dissection
Dissecting DishesHandmade with Silicone
Culture Petri DishPyrex7740 유리
실리콘 엘라스토머Dow CorningSylgard 170키트
꼰 실크 봉합Harvard Apparatus51-7615SP104
실체 현미경 MZ6Leica10447254
Stereomaster 현미경 광섬유 광원Fisher Scientific12562-36
Vannas 가위George Tiemann & Co160-150
파편 집게George Tiemann & Co160-55
조직 가위George Tiemann & Co105-400
KRBB 용액
Sodium ChlorideSigma-Aldrich7647-14-5
염화칼Sigma-Aldrich7447-40-7
황산마그네슘Sigma-Aldrich7487-88-9
인산칼륨 이염기성Sigma-Aldrich7758-114
포도시그마-알드리치50-99-7
항생제/항진균제코닝30-004-CI
HEPES코닝25-060-CI
강한>조직 소화
콜라겐분해효소 유형 1Worthington 생화학LS004196
소 혈청 알부민(BSA)Fisher Scientific9048-46-8
적혈구 용해 버퍼BioLegend420301 1X 작업 솔루션
수조Thermo-Fisher Scientific2876상호 쉐이킹 목욕
바이오세이프티 캐비닛Thermo-Fisher Scientific1385
로티세리 인큐베이터Daigger
100 & 마이크로; m 세포 여과기Thermo-Fisher Scientific22-363-549Yellow
40 µ m 세포 여과기Thermo-Fisher Scientific22-363-547블루
혈구계Cole-ParmerUX-79001-00
Trypan BlueSigma-Aldrich93595
Cell Isolation
OctoMACS KitMiltenyi Biotech130-042-108
(DMEM):F12 MediumCorning90-090중간 염기
태아 소 세럼 (FBS)Corning35016CVUSA Origins
Normal Donkey SerumAbCamAB7475
Anti-CD34Santa CruzSC-7324FITC-conjugated
Anti-PDGFRαThermo-Fisher ScientificPA5-17623
당나귀 안티 래빗 IgGJackson ImmunoResearch712-007-003
인산염 완충 식염수(PBS) 10XCorning46-013-CM1X 작업 솔루션
EDTAFisher Scientific15575020
Cell Culture
CO 2 세포 인큐베이터Thermo-Fisher Scientific51030285 Heracell 160i 
6웰 플레이트Corning3516TC 처리된
48웰 플레이트Corning3548TC 처리된
96웰 플레이트, 블랙 월코닝353376TC 처리된
중탄산나트륨시그마-알드리치144-55-8TC 처리
태아 송아지 혈청(FCS)코닝35011CVUSA Origins
아스코르브산시그마-알드리치50-81-7
비오틴시그마-알드리치58-85-5
판토텐산, 시그마-알드리치137-08-6
L-글루타민코닝61-030
뼈 형태 생성 단백질 4 (BMP4)Prospec BioCYT-081
표피 성장 인자 (EGF)PeproTech400-25
백혈병 억제 인자PeproTech250-02
혈소판 유래 성장 인자 BBProspec BioCYT-740
염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)PeproTech450-33
인슐린코닝25-800-CRITS 솔루션
IBMXSigma-Aldrich28822-58-4
덱사메타손Sigma-Aldrich50-02-2
T3 (Triiodothyronine)Sigma-Aldrich6893-023
세포 분석
CyQUANT 증식 분석Thermo-Fisher ScientificC7026
AdipoRed 형광 분석 시약LonzaPT-7009
Oil Red O Lipid Dye 시약시그마-알드리치O1391In Solution
M1000 마이크로플레이트 리더테칸
이클립스 도립 현미경니콘
디지털 사이트 DS-Qil 카메라니콘
사 륨 당 < EF4894C

참고문헌

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