정확 하 게 초파리 조직에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍부 및 지역화 프로세스와 관련 된 개발을 공부 하 고 중요 합니다. 여기에 번데기 날개를 해 부하는 간단한 프로시저의 설명이 이다. 이 날개는 몇 가지 기법 (immunohistochemistry, PCR 분석 결과, 등)에서 샘플으로 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법
이 논문에서
요약
초록
초파리 melanogaster 의 날개 개발 조직 수준에서 morphogenesis 공부에 대 한 이상적인 모델입니다. 이러한 부속 라는 날개 imaginal 디스크 배아 발달 동안에 형성 하는 세포의 그룹에서 개발. 애벌레 단계에서 imaginal 디스크 성장, 세포의 수를 증가 하 고 monolayered 상피 구조를 형성. 번데기의 경우, 내부 imaginal 디스크 밖으로 새싹 되는 날개의 앞 여백 선 따라 bilayers에 접어. 이 과정 동안, 경도 primodia 정 맥 정 맥 셀 날개의 장래 등 쪽과 복 부 표면에 시작 됩니다. 번데기 단계에서 각 표면의 정 맥 세포의 줄무늬 꽉 튜브;를 생성 하기 위해 의사 소통 동시에 간 정 맥 그들의 형성을 시작합니다.
적절 한 분자 마커의 도움으로 개발 하는 동안 날개를 구성 하는 주요 요소를 식별 가능 하다. 이러한 이유로 정확 하 게이 구조에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍요로 움과 날개의 개발 프로세스에 관련 된 지역화를 공부 하 고 중요 합니다.
절차는 여기 조작 번데기 날개, 날개를 해 부하는 번데기 단계에서 하는 방법에 자세한 지침을 제공에 초점을 맞추고 설명 합니다. 번데기 조직의 해 부 3 탈피 애벌레에 있는 그들의 대조 물 보다 수행 하기 위해 더 어렵습니다. 이 때문에이 이렇게 신속 하 고 효율적인 고품질 샘플을 얻기 위해, 개발 되었다. Immunostain 및 마운트 하는 방법의 세부 사항은 단백질 또는 세포 구성 요소, 시각화 수 있도록 이러한 날개 샘플 프로토콜에서 제공 됩니다. 작은 전문 그것 시간의 짧은 금액에 8-10 고품질 번데기 날개를 수집 가능 하다.
서론
초파리 날개 날개 imaginal 디스크에서 개발 된다. 이러한 날개 디스크의 원시 배아 상피에서 invaginate는 20-30 imaginal 셀의 작은 그룹으로 배아 개발 하는 동안 옆으로 배치 됩니다. 유 충 탈피 세 번째 단계로 성장 하는 동안 유사 분열에서에서 발생 합니다 imaginal 셀에 특정 특성의 숫자 (약 50000 셀)을 제기 하 고 날개를 형성 디스크1,2,3, 4. 셀 확산, 그들은 패션 관 상피, 자동 접이식 소형 나선 결과. Pupation, 동안 디스크 상피 형태 2 층 날개 밖으로 망원경 그리고 경도 정 맥 시작 그들 사이 격차는 날개 발달5,6동안 두 번 발생 합니다.
항상 혈관의 배치는 동일한 패턴; 쉽게 모든 변경 내에서 혈관 형성을 식별 하는 기능 돌연변이 매우 표시 (예: 누락 되거나 추가 정 맥, 정 맥의 위치, 등등에....
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프로토콜
주 1
1. 수집 및 경작 번데기입니다.
- Puparium 대형 (APF) 또는 교양된 튜브에서 젖은 페인트 브러시를 사용 하 여 prepupae 후 0 h를 제거 하 고 거의 완전 한 개발 기간에 새로운 튜브에 넣어 (2.1 및 2.2 참조).
참고: 파리의 건강 한 인구 표준 자란 프로토콜을 사용 하 여 유지 되어야 합니다. 3 또는 4 일 후 달걀 누워 있다, 성인 개인의 최적의 개발 있도록 튜브에서 제거할 수 있습니다. 그들은 세 번째 탈피 애벌레 pupation 시작 될 때까지 일정 한 온도에서 유지 관리 됩니다. 애벌레/번데기 전환 0 h APF를 간주 하는 prepupa의 형성에 의해 표시 됩니다. prepupa 앞쪽 spiracles 튀어나온 모양 둥근 된 직사각형을 움직이지 흰 애벌레입니다.
주 2
2입니다. 양도, 해 부 및 고정입니다.
- 칠하기 붓에 번데기 (2 h 개발 시간이 되기 전에 완료) 전송 더블 양면 테이프와 현미경 슬라이드를 준수. 등 쪽 측 및 두 부와 행 끝 같은 방향으로 향하게 하는 형태로 pupae를 놓습니다. ....
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결과
프로토콜에는 날개의 익숙한 형태를 유지 하는 번데기 날개 샘플을 얻기 위해 간단한 방법을 제공 합니다. 이 준비에서 2 차원 또는 3 차원 분포 및 날개의 분화 중 단백질의 농축 조사로 예상 될 수 있는 이미지의 더미를 얻을 수 있다. 유사한 프로토콜 수집 보완 deoxyribonucleic acid (cDNA), PCR 반응에 사용 된 서식 파일을 합성 하는 데 필요한 큰 번데기 날개 샘플 (관련 된 50-80 번데기 날개)를 사용할 수 있습니다 (2.9에 참고 참조).
그림 1 :에서 hedgehog 통로 유전자
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토론
이 비디오에서 설명 하는 해 부의 방법은 다양 한 기법에 대 한 다른 개발 단계에서 초파리 번데기 날개의 높은 품질의 샘플을 준비 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 면역 형광 검사, PCR 분석 실험, cDNA 합성 생체 외에서 개발 날개). 이 방법의 관점에서 관련 된 과학자 24-30 h APF를 사용 했습니다. 그러나 젊은 이상 번데기의 해 부에 필수적인 단계 내에서 아무런 장애물이 있어야 한다. 변화는 작은 무대 번데기를 수용 하 여야 할 수 있습니다.
프로토콜 한 번데기 또는 여러 pupae 동시에 해 부를 수행 수 있습니다. 쉽게 해 부 날개의 많은 수를 도달 하는 절차를 가속 수 있습니다. 이 경우 동시에 4-5 pupae의 행을 제거 하는 옵션이입니다. 함께 번데기를 제거 하거나 불가능, 계속 동일한 슬라이드에 개별적으로 제거할 수 있습니다 (III 비디오의 섹션을 참조 하십시오: "여러 pupae 해 부"). 에서.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 CSIC confocal 현미경 검사 법;와 그녀의 기술 지원에 대 한 마리 디 Doménico를이 프로젝트에 주어진 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 그의 원고 교정;에 대 한 호세 레오나르도 Báez를 루치아노 코레아 비디오;의 창조에 그의 헌신을 비디오에 대 한 그녀의 목소리와 블루밍턴 초파리 재고 센터 제공 하는이 연구에 사용 하는 주식에 대 한 대출에 대 한 나탈리 아 Rosano 하. 이사벨 게레로 의해 단일 클로 널 항-Ptc 개발 Apa1에서는 발달 연구 Hybridoma 은행 (DSHB)는 NICHD의 후원을 얻은 고 아이오와의 대학, 생물학 학과, 52242 아이오와 시, IA에 의해 유지.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시원한 빛 조명이 있는 실체 현미경 | Nikon | ||
| 흔들 플랫폼 | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| 현미경 슬라이드 | StarFrost | 8037/1 | |
| 커버 안경(24 x 32mm) | Deltalab | D102432 | |
| 집게 | F.S.T | 11252-00 | |
| 가위 | Lawton | 63-1400 | |
| 멀티웰 플라스틱 접시 | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 또는 p200 피펫 | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% 파라포름알데히드 | 시그마 | 158127 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 | T8787 | |
| BSA | 바이오 베이직 INC. | 9048-46-8 | |
| 글리세롤 | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol 시약 | Ambion | 15596026 | |
| DEPC 처리 수 | MO. BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 염소 안티 마우스 IgG (H + L), 2 mg / mL (작업 희석 1/800) | Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μ g/mL (working dilution 1/100) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | NICHD의 후원하에 DSHB의 Isabel Gerrero가 제작하고 아이오와 대학교, 생물 과학과, 아이오와 시티, IA 52242에서 유지 관리. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) | Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin, 300 U/1.5 mL 메탄올 (1/600 working dilution) | Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (플라이 스톡) | Bloomington Drosophila Stock Center |
참고문헌
- Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T.
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재인쇄 및 허가
