시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.
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이 논문에서
요약
초록
Endocytosis, 동안 융합된 시 냅 스 소포는 신경 단자, 소포 재활용 및 따라서 반복적인 신경 발생 중 시 냅 시스 전송의 유지 보수에 대 한 허용에서 검색 됩니다. 병 적인 조건에서 장애인된 endocytosis 시 냅 스 강도 및 뇌 기능 감소에 지도 한다. 여기, 우리 포유류 hippocampal 신경 문화에서 시 냅 스에서 시 냅 스 소포 endocytosis를 측정 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 등 synaptophysin VAMP2/synaptobrevin, pHluorin, 증가 하는 pH에 민감한 녹색 형광 성 단백질으로 기공을 lumenal 측면에서 시 냅 스 기공을 막 단백질을 융합 하 여 시 냅 스 소포 단백질 endocytosis를 모니터링의 형광 강도 pH로 증가합니다. Exocytosis, 동안 기공을 루멘 pH 증가, endocytosis 기공을 루멘 동안 pH는 다시 acidified. 따라서, pHluorin 형광 강도의 증가 나타냅니다 퓨전, 반면 감소의 이라는 시 냅 스 소포 단백질 endocytosis를 나타냅니다. 기록 endocytosis를 pHluorin 이미징 메서드를 사용 하 여, 우리 소포에 의해 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 통풍 관의 전자 현미경 (EM) 측정 하 여 기공을 막 endocytosis 모니터링. 마지막으로, 우리는 높은 칼륨 유도 도발은 후 다양 한 시간에 신경 터미널 막 구 덩이의 형성을 모니터링합니다. HRP 통풍 관 및 막 구 덩이 형성의 시간 과정 endocytosis의 시간 과정을 나타냅니다.
서론
신경 전달 물질 시 냅 스 소포에 저장 되며 exocytosis 발표. 시 냅 스 소포 막과 단백질은 endocytosis에 의해 내 면 그리고 exocytosis의 다음 라운드에서 다시. 시 냅 스 소포 endocytosis 시 냅 스 소포 풀을 유지 관리 하는 것이 중요 하다 고 플라즈마 막에서 튀어나온 소포를 제거 합니다. Endocytosis 시간 과정에 라이브 셀1,,23측정 하는 신랄 한 상황에서 침묵 중립 pH에 dequenched, pH에 민감한 녹색 형광 단백질 pHluorin 사용 되었습니다. PHluorin 단백질 시 냅 스 소포 단백질, synaptophysin 등 VAMP2/synaptobrevin의 lumenal 측에 일반적으로 붙어 있다. 휴식, pHluorin 시 냅 스 소포의 5.5 pH 루멘에 침묵 이다. 원형질 막에 소포 융해 노출 pH가 7.3 ~ extracellular 해결책에 기공을 루멘 pHluorin 형광에 있는 증가 결과로. Exocytosis, 뒤에 그 복구 된 소포 내 기 다시 산성화 시 냅 스 소포 단백질 endocytosis 인해 증가 형광 자연 붕괴 후 감퇴 반영 endo....
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프로토콜
참고: 다음 프로토콜 pHluorin 이미징 방법 및 교양 hippocampal 신경. pHluorin 모니터 시 냅 스 소포 단백질 통풍 관에 살아있는 세포에 사용 되는 EM 방법에 설명 하 고 그들 시 냅 스 소포의 감지 및 ultrastructural 변경.
동물 보호 및 절차 NIH 지침을 따라와 NIH 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1. pHluorin 이미징
- Hippocampal 신경 문화
- 준비 해 마 버퍼 (HB) 4mm NaHCO 3 및 5 mM HEPES 결합 하 여 5 M NaOH로 pH 7.3에 조정. 보통 2 %B27, 0.5 m m L-글루타민 및 1% 페니실린 스 neurobasal를 혼합 하 여 문화 매체를 확인 합니다. 또한, HB 버퍼 20%의 혼합물 준비 소 태아 혈 청 (HB/20% FBS).
참고:이 자란 프로토콜 기반 Sankaranarayanan, 외. 29 고 우 외. 24 - 출생 후 0 하루에 하루 2....
- 준비 해 마 버퍼 (HB) 4mm NaHCO 3 및 5 mM HEPES 결합 하 여 5 M NaOH로 pH 7.3에 조정. 보통 2 %B27, 0.5 m m L-글루타민 및 1% 페니실린 스 neurobasal를 혼합 하 여 문화 매체를 확인 합니다. 또한, HB 버퍼 20%의 혼합물 준비 소 태아 혈 청 (HB/20% FBS).
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결과
지질 캐리어 메서드를 사용 하 여, SpH 표현 hippocampal 신경에 있는 boutons (그림 1a)의 식별에 대 한 허용. 셀의 전기 자극 형광 강도 exocytosis, 그리고 증가 유도 한다. 형광 (δ)의 증가 자극 (그림 1b)를 종료 하 여 중단 됐다. 증가 형광 endocytosis 인해 느린 감소에 선행 되었다. VAMP2-pHluorin, 경우 VAMP2 자극4후는 bouton에서 축 삭을 따라 확산. 원시 데이터는 임의 단위를 사용 하 고 부패와 τ (그림 2a-c)의 속도를 기준으로 정규화 되었는지. 이후 측정 정규화 된 추적에서 만들어진, 감퇴의 속도 (δ/s) 당 피크 δ의 백분.......
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토론
여기 우리는 시 냅 스 소포 endocytosis를 모니터링 하기 위한 두 가지 방법을 보여 줍니다. 첫 번째 방법에서 우리 pHluorin transfected 신경에 시 냅 스 소포 단백질 융합 하 고 그 후 전기 자극을 모니터링. KCl에 의해 유도 된 둘째, 우리 EM 이미징 HRP 통풍 관의 사용. 우리는 두 가지 이유로 다른 자극을 사용. 첫째, 높은 칼륨 응용 문화에 모든 뉴런의 도발은 유도. 이 우리의 EM 방법론은 비 자극과 자극 뉴런을 구분 하지 수 EM 검사 용이. 반면 활동 전위 또는 심지어 단일 작업의 짧은 기차 후 pHluorin 형광 변화를 관찰할 수 있다 두 번째, 초 구조 형태학 변화 보다 안정적으로 높은 칼륨 자극 등 강렬한 자극 후 관찰 되었다 가능성이 있습니다.
가벼운 현미경 pHluorin를 사용 하 여 이미징 살아있는 세포에 시 냅 스 소포 단백질 융합 및 통풍 관 높은 시간 해상도 보여줍니다. 그것은 공부 endocytosis 시간 코스와.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리 감사 박사 용 링 Zhu synaptophysin pHluorin2x 구조, 및 박사 제임스 E. 로스 VAMP2 phluorin를 제공 하기 위한 제공. 우리가 그들의 기술 지원 및 도움말에 대 한 박사 수잔 쳉과 버지니아 크 로커 NINDS 전자 현미경 시설의 감사합니다. 이 작품은 신경 성 질환의 국가 학회 및 미국 및 생명 공학 연구소 연구 이니셔티브 프로그램 (한국 생명 과학자 친목 프로그램), 한국 연구 학회에서에서 부여에 선 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 생명 과학, 생명 공학, 한국
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Thermo Fisher | 15338-100 | 사용한 Lipofectamine LTX | synaptophysin 또는 VAMP2-pHluorin neurobasal medium을 포함한 플라스미드 DNA의 트랜스펙션 |
| Thermo Fisher | 21103-049 | 뉴런 성장 배지, 최대 37°C까지 워밍; C 사용 전 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | 신경 세포 분화를 위한 그래디언 |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | 뉴런 배양을 위한 그래디언 |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | pHluorin Trypsin XI의 뉴런 성장 및 이미징을 위한 기질 |
| Sigma | T1005 | Neuronal 배양 분해 해마 조직 | |
| 소 췌장에서 Deoxyribonuclease I | Sigma | D5025 | 신경 세포 배양 억제 점성 세포 현탁 |
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| 필드 자극이 있는 슬롯 배스 | Warner Instruments | RC-21BRFS | 전기 자극 자극 |
| 절연 장치 | 적용Warner Instruments | SIU102 | 커버 |
| 윤활제 | Dow corning | 111 | pHluorin 이미징 씰을 적용하고 챔버 AP5 |
| Tocris | 3693 | 일반 식염수에 대한 구배, 선택적 NMDA 수용체 길항제, 재발 활성 가능성이 있는 시냅스 후 활성 억제 | |
| CNQX | Tocris | 190 | 생리식염수, 경쟁력있는 AMPA / kainate 수용체 길항제에 대한 구배, 재발 가능성이있는 시냅스 후 활동을 억제 |
| 루미네이터 | Nikon | C-HGFI | 금속 할로겐화물 광원 pHluorin |
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| CCD 디지털 카메라 | AMT | XR-100 | 전자 현미경, 이미지 캡처 |
| 구연산 | 납 Leica 마이크로시스템 | 16707235 | 전자 현미경, 그리드 염색 |
참고문헌
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calc....
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