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방법 논문

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

7.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55871

⸱

2017년 11월 6일

 ,  ,  , 
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

이 논문에서

요약

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하 여

초록

소 뇌과 립 신경 (CGNs)는 소 뇌에 풍부한 균질 인구를 형성 일반적으로 사용 되 신경 모델입니다. 그들의 출생 개발, 풍부, 및 접근에 비추어 CGNs는 신경 프로세스, 신경 개발, 생리 적 신경 활동 자극, 신경 마이그레이션 등을 공부 하는 이상적인 모델입니다. 또한, CGN 문화 excitotoxicity 등 apoptosis는 세포 죽음의 다른 모드를 공부에 대 한 훌륭한 모델을 제공 합니다. 문화에 주, CGNs N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체, 신경 건강 및 질병에 많은 중요 한 기능을 가진 특정 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체를 표현 한다. 함께 설치류 기본 CGN 문화에 막 도발은 NMDA의 낮은 농도의 추가 동안 NMDA의 높은 농도의 추가 모델을 채택 될 수 있다 생리 적 신경 활동 자극을 모델링 하는 데 사용 되었습니다. excitotoxic 신경 부상입니다. 여기, 격리의 방법 및 6 주 오래 된 강아지 adenoviruses와 lentiviruses CGNs의 유전자 조작에서 CGNs의 배양 설명 되어 있습니다. 우리는 또한 NMDA 유도 excitotoxicity, 낮은 칼륨-유도 된 apoptosis, 산화 스트레스와 DNA 손상 이러한 뉴런의 변환에 따라 자극 하는 방법에 현재 최적화 된 프로토콜.

서론

소 뇌과 립 신경 (CGNs) 문화에서 잘 성격을 나타낸다 고 신경 죽음 및 개발 1,2,3,,45, 연구는 효과적인 모델 역임 6. CGN 문화에서 체 외에 있는 N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체의 초기 식 게 NMDA 유도 신호를 공부 하는 매력적인 모델. 함께 막 도발은 NMDA와 함께 이러한 수용 체의 활성화 생리 적 신경 활동 자극, 모델링 하는 데 사용 되 고 시 냅 스가 소성 7,8의 메커니즘으로 연구에 대 한 허용 했다. 그와 반대로, NMDA ligand에 의해 이러한 수용 체의 과잉 자극 excitotoxicity, 급성 뇌 손상 및 신경 퇴행 성 질환 9신경 손실의 주요 메커니즘을 모델링 하는 데 사용할 수 있습니다. 급성 신경 상해 본 excitotoxicity의 유도 대 한 메커니즘 중 하나 감소 산소와 ATP 기아 통해 이다. 그러면 막 도발은 고 조미료의 높은 수준의 시 냅 스에서 출시. 과도 한 Ca2 + 유입이 수용이 체를 통해 여러 경로 포함 하 여 캘리포니아2 +차례 차례로 활성화에 높은 조미료 결과 NMDA 수용 체의 후속 overstimulation-phospholipases, 프로 테아 제 활성화 및 endonucleases, 중요 한 세포 구성 요소와 세포 죽음의 통제 저하 발생 또한, 높은 세포내 캘리포니아2 + 리드 생성 산소 자유 래 디 칼 및 미토 콘 드리 아 손상 10,11.

NMDA 유발 신경 excitotoxicity 다음 신경 손실의 대부분은 칼슘 유입 때문 이며 Bax/박 독립,이 모델에서 세포 죽음의 다른 메커니즘을 제외할 수 없습니다. 회 저 성 둘 다의 외관 그리고 apoptotic 세포 죽음 excitotoxicity 때문 반응성 산소 종 (선생님)와 높은 세포내 캘리포니아2 + 레벨 12로 인 한 DNA 손상의 발생으로 인해 부분적으로 같은. DNA 손상 신경 죽음 apoptotic 세포 죽음, chromatin 대중과 apoptotic 시체의 모습 등의 연관 되는 apoptotic 메커니즘을 통해 결과. Apoptosis의 감 응 작용은 미토 콘 드리 아에서 시 토 크롬 c의 출시를 통해 중재 그리고 Bax/박 oligomerization 13에 종속 되도록 표시 되었습니다. Bax/박 oligomerization 시 토 크롬 c 출시 및 프로 apoptotic 레 귤 레이 터로 가벼운 허 혈 성 부상 14본의 활성화의 결과로 외부 미토 콘 드리 아 막의 기 공 형성을 촉진 합니다.

선생님의 세대 신경 기능 15큰 산소 요구와 결합 하는 항 산화 물질의 낮은 생 수준 때문에 뇌에서 중요 한 문제입니다. 허 혈 성 이벤트에 노출 되 면 산화 질소 synthase upregulated, 질소 산화물을 생성 하 고 반응성 산소 종 14증가입니다. 산소 래 디 칼의 농도 증가 DNA 손상 하 고 간접적으로 에너지 부족을 일으킬 수 있습니다. 높은 수준의 DNA 이중 가닥 나누기의 폴 리 ADP ribose 중 합 효소-1 (PARP-1), 진 핵 chromatin-바인딩 단백질 catalyzing 나드+, 통합 하는 과정에서에서 ADP ribose 단위 전송에 대 한 책임의 활성화에 의해 조치를 취했고합니다 DNA 수리 16. 그러나, 산화 스트레스로 인해 과도 한 손상, PARP 1 활성화 하면 증가 드레인으로 인해 에너지 기아 나드+, 산화 인 산화를 통해 ATP 생산을 위한 필요한 기판에. 궁극적으로, 산화 스트레스는 미토 콘 드리 아 시 토 크롬 c 출시로 이어지는 Bax/박 종속 방식으로 apoptosis를 일으킬 것 이다 그리고 유도 미토 콘 드 리아 CGNs 17개장을 보여줘 왔다.

마지막으로, 염화 칼륨 (KCl) CGN 문화에서의 농도에 변화 낮은 칼륨/도발은 중재 apoptosis 18,,1920를 사용할 수 있습니다. K+의 낮은 수준에 드러낼 때, CGNs 받아야 뚜렷한 생리 적 변화, 미토 콘 드리 아 호흡의 분해, 세포질 수요 감소 21에 감소 레벨의 감소에 있는 결과 핵 요인-κB (NFκB) 염증, 시 냅 스 전송 22등의 활동을 조절. 이 모형은 신경 발달 동안에 세포 죽음의 연구에 대 한 특정 관심의 이다. 낮은 K+ 환경 더 밀접 하 게 유사한 생리 적 조건, 고 신경 개발 23중 세포 죽음의.

요약 하자면, CGNs 신경 죽음 및 변성의 기본 분자 메커니즘을 조사 하는 오랜 모델을 제공 합니다. 다음 프로토콜 고립과 CGNs, 식 또는 바이러스 및 신경 상해 및 변성을 대표 하는 다른 메커니즘을 통해 신경 죽음의 유도 사용 하 여 특정 유전 통로의 억압의 경작을 허용할 것 이다.

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프로토콜

이 프로토콜에 따라 수정 된 절차의 설명 이전 18 , , 24 25 , 26 , 27.이 프로토콜 맥 길 대학에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 됩니다.

1. 실험 준비

참고: 다음 재고 솔루션을 준비 하 고 사용할 때까지 유지 수.

  • 해 부 솔루션
    1. 디졸브 3.62 g 염화 나트륨 (NaCl), 염화 칼륨 (KCl), 0.069 g의 나트륨 인산 염의 0.2 g의
        (NaH 2 포 4 ∙ H 2 O), 1.306 g D-(+)-500 mL의 포도 당 증 류 된 H 2 o. 그런 다음 솔루션에 HEPES 버퍼, 페 놀 레드 솔루션의 450 µ L 및 BSA 분수 V의 20 mL의 12.5 mL를 추가 합니다. PH 7.4 1 N 수산화 나트륨 (NaOH)를 사용 하 여 조정.
      1. Sterilize 0.22 μ m 필터와 4 ° c.에 게 이 솔루션 10 일 최대 1 주일 동안 안정적으로 유지 됩니다.
    2. Trypsin
      1. 0.9% 염화 나트륨에에서 trypsin의 25 g/L의 농도에서 재고 솔루션을 준비. 저장 솔루션-20에 ° c.
    3. 트립 신 억제 물
      1. 닭고기 달걀 흰 트립 신 억제 물 100 ml의 1 m m HCl. 저장소의 1 g을 용 해 하 여-20에이 솔루션 10 mg/mL의 농도와 재고를 준비 ° c.
    4. DNase
      1. 100mg DNase 1의 10 mg/mL 재고를 생성 하기 위해 살 균 물 10 mL에 녹. 저장 솔루션-20에 ° c.
    5. MgSO 4
      1. 50 mL의 증류수 (H 2 O) 1 M 재고 생성 하에 6.02 g 황산 마그네슘 (MgSO 4)의 추가. 저장 솔루션 4 ° c.
    6. CaCl 2
      1. 0.735 g 염화 칼슘의 분해 (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) 50 ml 증류수 H 2 O 100 m m의 재고 농도에. 저장 솔루션 4 ° c.
    7. KCl
      1. 50 mL에 KCl의 분해 3.7275 g H 2 O 4에 1 M. 저장소 솔루션의 재고 농도에 증류수 ° c.
    8. D-(+)-포도 당
      1. 녹 1.802 g D-(+)-50 mL에 포도 증 류 H 2 O 100 m m의 재고 농도에. 저장 솔루션 4 ° c.
    9. 셀 문화 미디어
      1. 세포 배양 기를 다음과 같이 준비: 열의 5 mL 비활성화 소 태아 혈 청을 dialyzed, 200 m m 1.0 M KCL의 L-글루타민, 50 mg/mL Gentamycin 및 1 mL의 100 µ L의 500 µ L 45 mL에 추가 되어야 한다 필터의 소독이 글 ' s 최소한의 필수 미디어 (전자-MEM) 1.125 g/l D 보충-소 뇌과 립 신경 문화 미디어의 50 mL를 생성 하는 포도 당. 저장 미디어 4 ° c.
    10. 시 토 신 베타-D-Arabino Furanoside
      1. 48 mg 10 ml 20 m m의 재고 농도에 성장 매체의 시 토 신 베타-D-arabino furanoside의 분해. 저장 솔루션-20 ° c.
    11. 폴 리-D-리 신
      1. 2 mg/mL 폴 리 D-리 신 주식을 생성, 폴 D-리 리의 20 밀리 그램 살 균 H 2 O의 10 mL을 추가. 소재 폴 리 D-라이 신-80 ° c 100 µ L aliquots에서 저장 해야 합니다.
    12. 참고: 다음 솔루션을 해 부 하기 전에 준비 하 고 사용 때까지 4 ° C에서 유지 해야 합니다.
    13. MgSO 4 Supplemented 해 부 솔루션
      1. 재고 MgSO 4 절 개 솔루션의 250 mL의 추가 300 µ L.
    14. 트립 신 해 부 솔루션
      1. 재고 trypsin 및 재고 MgSO 4 절 개 솔루션의 10 mL의 12 µ L의 추가 100 µ L.
    15. 트립 신 억제제 솔루션 1
      1. 재고 트립 신 억제 물, 재고 DNase 1 250 µ L 해 부 솔루션의 10 mL를 재고 MgSO 4의 12 µ L의 추가 164 µ L.
    16. 트립 신 억제제 솔루션 2
      1. 재고 트립 신 억제 물, 재고 DNase 1 750 µ L 해 부 솔루션의 10 mL을 MgSO4 주식의 12 µ L의 추가 1040 µ L.
    17. CaCl 2 보충 해 부 솔루션
      1. 재고 CaCl 2 및 재고 MgSO 4 절 개 솔루션의 10 mL의 25 µ L의 추가 10 µ L.
    18. 폴 리 D-리 신 코팅 문화 요리
      1. 코트 문화 요리, 살 균 H 2 o.의 40 mL에 재고 폴 리 D-리의 100 µ L를 희석 35 mm Nunc 문화 요리에 대 한 희석된 폴 리 D-리 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 4 잘 플레이트, 300 µ L 희석된 폴 리 D-리의 각 음을 추가할.
      2. 게 발음 하 고 각각을 세척 하기 전에 폴 리 D-리 앉아 1 h 4 mL 또는 600 µ L (대 35 mm 요리 문화 또는 4 잘 플레이트, 각각) 잘 살 균 H 2 o. H 2 O 발음 그리고 요리 공기 1 헤 건조

    2. 추출 및 격리의 소 뇌 뇌

    1. Decapitate 6-7 일 오래 된 마우스 강아지 잘린이 위를 사용 하 여. 메 마른 조직 문화 후드에는 뇌의 해 부를 수행.
    2. 집게의 쌍을 사용 하 여 머리를 잡고 두뇌를 제거 하 고 그림 1에서 같이 서가 위를 사용 하 여 머리의 앞쪽으로 피부를 통해 잘라. 그럼 오염 위험을 최소화 하기 위해가 위의 새로운 쌍을 사용 하 여 두개골 뼈를 통해 서 잘라. 집게를 사용 하 여 두뇌를 포함 하는 두개골을 제거 하 고 집게 또는 주걱을 사용 하 여 두뇌 애타게.
      1. 전체적으로 뇌를 빼내 촉진을 시 신경을 통해 필요에 따라 잘라.
    3. 뇌 해 부 솔루션 MgSO 4 보충 되는 장소. 솔루션 및 얼음에 두뇌
    4. 다음 제거, 해 부 현미경 뇌, MgSO 4 보충 해 부 솔루션에서 뇌에서 뇌를 해 부하 고 meninges 미세 집게를 사용 하 여 제거. 그것의 복 부 측에 소 뇌 및 맥락 막 신경 총의 제거 확실히.
    5. MgSO 4 보충 해 부 솔루션의 ~ 1 mL를 포함 하는 35 mm 접시에는 cerebella 풀.
    6. 조직의 작은 조각으로 잘라 고 MgSO 4 버퍼링 해 부 솔루션의 30 mL를 포함 하는 50 mL 튜브로 전송.

    3. 마우스의 소 뇌과 립 신경은 고립과 Culturing

    1. g x 644 및 4에 5 분에 대 한 다진된 대뇌 조직을 포함 하는 50 mL 튜브 원심 ° c.
    2. 제거는 상쾌한 고 트립 신 해 부 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. 다음 37에서 15 분 동안 고속에 튜브를 흔들어 ° c.
    3. 트립 신 억제제 솔루션 튜브를 2 분에 대 한 부드럽게 바위 1의 추가 10 mL
    4. G x 644 및 4에 5 분 동안 튜브 원심 ° c.
    5. 는 상쾌한을 제거 하 고의 2 개 mL를 추가 트립 신 억제제 솔루션 2, 및 다음 이전 15 mL 튜브.
    6. Triturate 15 mL에 조직 관 솔루션 어두운 될 때까지. 다음 5 분에 대 한 정착 하자
    7. 분명 상쾌한을 제거 하 고 새 튜브 CaCl 2 보충 해 부 솔루션의 1 mL를 포함 하는 상쾌한 전송.
    8. 단계 3.6에서에서 펠 릿을 포함 하는 튜브의 하단에 트립 신 억제제 솔루션 2의 또 다른 mL를 추가 합니다. 다시 triturate 그리고 5 분은 상쾌한을 제거 하 고 상쾌한 단계 3.7 (즉, 반복 단계 3.6-3.7)에서 포함 된 튜브에 추가 대 한 합의. 조직의 대부분 기계적으로 해리 될 때까지이 과정을 반복.
    9. 추가 CaCl 2의 0.3 mL 보충 상쾌한의 모든 mL에 대 한 표면에 뜨는 컬렉션에 해 부 솔루션.
    10. 튜브의 내용을 믹스 하 고 644 x g.에서 5 분 동안 원심
    11. 제거는 상쾌한 10 mL 신선한 매체의 펠 릿을 추가 하 고 혼합.
    12. 셀 다음 계산 하 고 1.5 x 10 6 셀/mL의 농도를 희석 수 있습니다. 일반적으로 10 백만 셀 trypsinization 시간 및 해 부의 효율성에 따라 각 해 부 두뇌에서 예상 된다 note 하시기 바랍니다. 이전 만든된 폴 리 D-리 신 판에 셀 플레이트. 4-잘 접시, 접시 0.5 mL, 잘 당 10 5 셀 x 7.5를 주는. 35 mm 요리 접시 4 mL 접시 당 6 x 10 6 세포 주는.
    13. 후 24 h, glial 오염 줄이기 위해 접시를 시 토 신-β-arabino furanoside (아크)를 추가 합니다. 미디어의 각 mL 20 m m 아크의 0.5 µ L가 필요 합니다. 아크의 추가 미디어의 변화를 필요 하지 않습니다. 셀 하는 경우 7-8 일에 대 한 유지, 3 일에이 치료를 반복.
    14. 37 ° C에서 5% CO 2 배양 기에서 문화를 유지 하 고 100 m m 포도 당 매 2 일 지난 5 일 미디어의 모든 2 mL에 대 한 문화에 추가의 100 µ L를 피드. 완전 한 미디어 변경 필요 하지 않습니다.

    4. Lentivirus 포장, 정화와 적정

    참고: 포장, 농도, 정화 및 lentivirus의 적정에 대 한 프로토콜 이전 키트의 사용 없이 자세히 기술 되었다 28, 교류 cytometry 29 등 적정에 대 한 대체 메서드를 포함 하 여. 여기에 우리가 짧게 제시 신경 부상 빠른 바이러스 정화 솔루션 및 정량 lentiviral 적정 키트를 사용 하 여 공부 하기 lentivirus의 생산에 대 한 우리의 실험실에서 사용 하는 프로토콜.

  • Dulbecco와 10 cm 문화 요리에서 접시 Hek293T 셀
      ' s 수정이 글 ' s 최소 필수 매체 (DMEM) 10% 보충 FBS. 높은 바이러스 titer를 얻기 위해 각 transfection에 대 한 Hek293T 셀의 적어도 5 접시를 성장. Transfection 셀 당일 확인은 70% 합칠. 변경 미디어 transfection 전에 3 시간.
    1. 각 transfection에 대 한 두 개의 튜브를 준비. 튜브에 1 1.5 mL 혈 청 MEM 감소 미디어와 transfection 시 약의 41 µ L 섞어 잘 추가 합니다. 튜브 2, MEM 감소 혈 청 미디어의 1.5 mL 및 전송 플라스 미드의 6 µ g, pCMV-dR8.2 벡터 (포장 플라스 미드)의 6 µ g, 3 µ g pCMV VSV G 벡터 (봉투 플라스 미드), 그리고 p3000 증강 시 약 (lipofectamine 함께 제공 됨)의 35 µ L를 추가 합니다. 잘, 그리고 결합 튜브 1과 2, 소용돌이 혼합 하 고 15 분에 대 한 품 어
    2. 는 Hek293T 격판덮개에서 미디어의 50%를 제거 하 고 세포에 DNA 지질 단지를 추가. 37 ° C, 5% CO 2에서 6 h에 품 어. 미디어를 제거 하 고 신선한 DMEM의 5 mL을 바꿉니다, 밤새 품 어.
    3. 에서 24 h 후 transfection, 각 접시에서 바이러스 상쾌한의 첫 번째 일괄 처리를 수집 합니다. 4 ° C에서 바이러스 성 미디어를 유지 하 고 Hek293T 세포의 각 격판덮개에 신선한 미디어의 5 mL을 추가. 밤새 품 어.
    4. 48 h 후 transfection 바이러스 상쾌한의 두 번째 배치를 수집 하 고 첫 번째 일괄 처리와 결합 하 고, 결합 된 바이러스 상쾌한 600 x g.에서 10 분 원심
    5. 는 상쾌한 45 µ m 기 공 크기와 필터를 통해 필터링.
    6. 빠른 바이러스 정화 솔루션을 사용 하 여 바이러스를 정화. 바이러스 성 상쾌한의 모든 45 ml lentiviral 바인딩 솔루션, 믹스, 그리고 분리기에서 10 분의 5 mL을 추가 > g 및 4 x 5000 ° c.
    7. 상쾌한을 신중 하 게 제거는 펠 렛을 방해를 하지.
    8. 매체의 20-40 µ L을 추가 하 고 다시는 펠 릿을 일시 중단. 약 수와 스토어-80 ° c.
    9. Lentiviral titer, 정량 lentiviral 적정 키트를 얻기 위해 사용 됩니다. PBS의 500 µ L에서 순화 된 바이러스의 2 µ L를 희석. 바이러스 세포의 용 해 버퍼 (키트에 제공 되는)의 18 µ L를 희석된 바이러스의 2 µ L을 추가.
    10. 다른 3을 설정 RT-q-PCR 반응에 triplicates 그리고 그들, 바이러스 lysate, 긍정적인 컨트롤 1 (STD1), 및 긍정적인 컨트롤 2 (STD2). 각 반응에 대 한 추가, 2 x 정량 MasterMix의 2.5 µ L의 12.5 µ L 바이러스 성 lysate 또는 STD1 (키트에 제공) 또는 STD2 (키트에 제공), 그리고 시 약-믹스 (키트에 제공 되는) 0.2 mL PCR 튜브에 10 µ L.
    11. PCR 프로그램을 다음과 같이 설정: 반전 녹음 방송, 효소 활성화, 15의 40 주기를 위한 95 ° C에서 10 분에 대 한 42 ° C에서 20 분 변성 및 어 닐 링/확장을 위한 60 ° C에서 1 분 95 ° C에서 s.
    12. 계산이 수식을 사용 하 여 바이러스 titer:
      Lysate의 바이러스 titer = 5 × 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
      Ctx = 알 수 없는 샘플, Ct1의 평균 Ct 값 = STD1, Ct2의 평균 값 = STD2의 평균 값.
      참고: CGNs는 lentiviruses로 불리고 또는 공부 되 고 상해의 모드 adenoviruses 감염 최고의 될 수 있습니다. 도금 시에 2-3 셀 문화 솔루션의 나는 lentiviruses의 추가 NMDA 유도 신호 문화 제 7 일에 공부 하는 데 사용 됩니다. 80% 이상에서이 결과 변환 ( 그림 2) 이러한 뉴런의 생 화 확 적인 분석을 추구 하 고. (나 50)에서 문화와 NMDA 유도 하루 7-8에서 신호를 공부 하 고 5 일에 adenoviruses의 추가 영상 같은 다른 기술을 사용 됩니다. 10%가 하에이 치료 결과 신경 세포 이미징 및 단백질의 공동 지역화에 이상적의 감염. Adenoviruses 도금 시 DNA 손상 유도 된 세포 죽음을 공부를 과산화 수소의 추가 의해 하루 2-3 또는 산화 긴장에서 camptothecin의 추가 의해 사용할 수 있습니다. 관심사의 유전자에 형광 단백질 (GFP, RFP, CFP 또는 YFP)의 존재는 백분율 변환 및 잠재적인 독성 예측에 사용할 수 있습니다. 권장된 나 우리 볼 최소한의 독성과 최대 변환 ( 그림 3).

    5. 신경 상해 모델링

      NMDA 유도
    1. 유도 신경 excitotoxicity, 체 외에 7 일, 1 헤 없이 병렬 문화에서 바른된 매체 바꿉니다 모든 매체에 대 한 100 μ M NMDA와 10 µ M 글리신 CGNs 치료 치료입니다. 이 농도 24 h 게시물 치료 ( 그림 3C)에서 50% 세포 죽음에서 발생합니다. 미토 콘 드 리아 조각화는 분명 6-8 h 게시물 치료 (참조 Jahani Asl 외. 26 , 27).
    2. 신경 치료 선생님-유도 된 세포 죽음 (산화 스트레스)을 유도 하는 것75-100 µ M 과산화 수소 (H 2 O 2)와 스위치를 ns H 2 O 2에 5 분 노출 다음 병렬 문화에서 미디어 조절. 참고, H 2 O 2의 불안정으로 인해 문화 치료의 24 h 다음에 50-70% 세포 죽음을 유도 하는 수준으로 농도 최적화.
    3. 유도 DNA를 손상 유도 된 세포 죽음, 10 µ M camptothecin와 CGNs를 치료. 이 농도 24 h. 미토 콘 드 리아 조각화의 50% 세포 죽음 보다 더 유도 및이 농도 (참조 Jahani Asl 외에 camptothecin의 추가 후 2-3 h 발생 초기 apoptotic 신호 18)
    4. 낮은 K + 유도 신경 apoptosis CGNs에서 유도, 25 m m K + + 5 m K m 낮은 칼륨 미디어 7 일에서 체 외에 다음을 포함 하는 미디어 변경.

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    결과

    그림 1A-B에서 보듯이 조심 해 부와 그대로 뇌 최소한의 손상으로 제거 한다. 노력 제거 하는 동안 두뇌에 손상을 최소화, 특히 소 뇌 손상에 취해야 한다. 더 어려운 식별 하 고 meninges의 완전 한 제거에 대 한 소 뇌 손상 그리고 신경 문화의 오염의 가능성을 증가. Meninges 제거 되었습니다 일단 소 뇌 그림 1C 에서 보듯이 나머지 조직에서 해 부 고 분리에 대 한 준비.

    도금, 이전 CGNs lentivirus로 불리고 하거나 그림 2에 설명 된 대로 아 데 노 바이러스에 감염 될 수 있습니다. 우리 lentivirus (

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    토론

    여기 우리는 기본 마우스 소 뇌과 립 신경 (CGNs), 손실 및 기능 연구의 이득의 경작 그리고 세포 죽음의 다른 메커니즘을 모델링에 대 한 간단한 방법을 제공 합니다. 여러 가지 요인을 가까운 모니터링을 요구 하는이 절차를 사용 하 여 결과의 재현성을 영향을 줍니다. 문화 문화, 문화의 합류에에서 glial 세포의 제거를 포함 하 고 건강 한 세포를 유지의 순도 포함 됩니다. 이러한 요인에 변화를 도입 결과 바이어스 하 고 재현성을 도전 수 있습니다. 아래는 부정적인 결과 영향을 주는 요소를 최소화 하는 방법에 설명 합니다.

    CGNs 문화에서 glial 세포를 제거 하 고 순수한 신경 모집단 확립, 시 토 신-β-arabino furanoside (아크), DNA 합성을 억제 함으로써 증식 세포를 죽이고 pyrimidine antimetabolite의 10 µ M을 사용 합니다. 여전히 인구 glial 세포 존재의 경우에, 아크의 농도 15 µ M를 늘릴 수 있습니다. 이것은...

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    공개 사항

    저자는 공개 없다.

    감사의 글

    이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 캐나다 지원 및 건강 연구의 캐나다 학회가 A로 부여

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    qPCR 렌티비트랄 적정 키트 ABM#LV900
    신속한 바이러스 정제 솔루션 ABM#LV999
    pCMV-dR8.2Addgene#8455
    pCMV-VS.VGAddgene#8454
    증류수 Gibco#15230162
    200 mM L-글루타민 Gibco#25030081
    35mm Nunc 배양 접시Gibco#174913
    PowerUP SYBR 그린 마스터 믹스라이프 테크놀로지#A25742
    BSA V 솔루션Sigma Aldrich#A-8412
    CaCl2 • 2H2OSigma Aldrich#C-7902 
    CamptothecinSigma Aldrich#C-9911
    닭 달걀 흰자 트립신 억제제 시그마 알드리치#10109878001
    사이토신 베타-D-아라비노 후라노사이드시그마 알드리치#C-1768
    D-(+)-글루코스 시그마 알드리치#G-7528
    DNase1 Sigma Aldrich#11284932001
    Eagle-minimal essential mediumSigma Aldrich#M-2279
    GlycineSigma Aldrich#G-5417
    열 비활성화 투석 Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich#F-0392
    헤페스 버퍼 Sigma Aldrich#H-0887
    과산화수소Sigma Aldrich#216763
    50 mg/mL Gentamycin 시그마 알드리치#G-1397
    MgSO4 Sigma Aldrich#M-2643
    N-메틸-D-아스파르트산Sigma Aldrich#M-3262
    페놀 레드 솔루션 시그마 알드리치#P-0290
    트립신 Sigma Aldrich#T-4549
    Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000-008
    p3000 강화제 시약Thermo Fisher ScientificL3000-008
    Opti-MEM I 감소 혈청 매체Thermo Fisher Scientific31985070
    KCl VWR#CABDH9258
    NaCl VWR#CABDH9286
    NaH2PO4H2O VWR#CABDH9298
    폴리 D-라이신 VWR#89134-858
    DMEMWisent#319-005-CL
    FBSWisent#080-450

    참고문헌

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