방법 논문

후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

DOI:

10.3791/55893

⸱

2017년 6월 5일

 ,  , 
1Laboratory of Chemical Pharmacology, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 2Center for Information and Neural Networks, National Institute of Information and Communications Technology, 3PRESTO, Japan Science and Technology Agency (JST)

이 논문에서

요약

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후각 감각 뉴런은 적절한 신경 회로를 만들기 위해 다양한 축삭 정렬 분자를 발현합니다. 이 프로토콜은 후각 감각 뉴런의 축삭 종말에 축삭 - 정렬 분자의 조합 표현을 시각화하기 위해 면역 조직 화학 염색법을 설명합니다.

초록

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마우스 후각 시스템은 간단한 해부학 구조로 인해 신경 회로 형성 메커니즘을 연구하는 데 자주 사용됩니다. 후각 감각 뉴런 (OSN)은 단일 수상 돌기 및 단일 비 축삭 축색 돌기가있는 양극성 세포입니다. OSN은 하나의 후각 수용체 (OR) 유전자 만 발현하며, 주어진 유형의 OR을 표현하는 OSN은 그들의 축색 돌기를 후각 망막 (OB)의 불변성 사구체에 수렴시킵니다. OSN 예측의 두드러진 특징은 표현 된 OR이 축삭 투영에서 중요한 역할을한다는 점입니다. OR는 다중 axon-sorting 분자의 발현을 조절하고 OSN 축삭 말단에서 axon-sorting 분자의 조합 분자 코드를 생성한다. 따라서, OR- 특정 axon 유도 메커니즘의 분자 메커니즘을 이해하기 위해서는 동일한 사구체 내의 OSN 축삭 말단에서 그들의 발현 프로파일을 특성화하는 것이 중요합니다. 이 기사의 목적은 가능한 많은 사구체를 수집하는 방법을 소개하는 것이 었습니다e를 단일 OB 부위에 투여하고 다중 항체를 사용하여 면역 염색을 수행한다. 이것은 OB 절 사이의 얼룩 변이없이 축색 - 정렬 분자의 발현 양상을 비교 분석 할 수있게한다.

서론

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개발하는 동안, 뉴런은 서로 정확하게 연결되어 정상적인 뇌 기능에 중요한 적절한 신경 회로를 형성합니다. 뇌의 비정상적인 신경 회로는 자폐증 및 정신 분열증과 같은 정신 장애의 원인으로 여겨지므로 신경 회로 형성 메커니즘을 이해하는 것이 신경 과학 분야의 주요 과제 중 하나입니다.

마우스 후각 시스템에서 Olfactory Epithelium (OE)의 각 감각 신경 세포 (OSN)는 오직 하나의 기능적 후각 수용체 (OR) 유전자를 발현하고 동일한 OR을 발현하는 OSNs는 축색 돌기의 고정 된 위치에서 사구체의 특정 쌍에 축삭을 수렴시킵니다. 후각 망막 (OB) 1 , 2 . 마우스 후각 시스템은 신경 회로 형성의 분자 메커니즘을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 연구자는 OR 표현을 활용하여 특정 s를 식별 할 수 있기 때문에OSNs의 ubtype과 명확한 사구체 구조로 OSN axons의 투영 사이트를 시각화. OSN 예측의 주목할만한 특징은 OR이 OSN 축색 돌기를 OB 3 , 4 ,

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프로토콜

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모든 실험 절차는 도쿄 대학의 동물 실험 윤리위원회의 승인과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 도쿄 대학의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 솔루션 준비

  1. 0.01 M 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비합니다 : PBS 정제 (0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M PO 4 3- , pH 7.4)를 증류수 1 L에 넣고 완전히 용해 될 때까지 실온에서 저어줍니다.
  2. PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비합니다 : 100 ML PBS에 4g의 PFA를 추가합니다. 그것이 완전히 녹을 때까지 60 ° C에서 용액을 저어 준다.
    1. PBS에 PFA를 용해시킨 후, 1N 수산화 나트륨 (NaOH)으로 용액의 pH를 7.4로 조절한다. 그런 다음 얼음으로 식힌 다음 여과지를 통해 용액을 여과하여 미립자 물질을 제거합니다. 4 ° C에서 보관하십시오.
      주의 :이 시약을 사용할 때는 적절한주의를 기울이십시오. 핸들장갑, 안전 안경 및 화학 물질 두건 아래 실험실 코트를 조심스럽게 사용하십시오.
      참고 : 2 일 이내에 준비된 신선한 4 % PFA 용액을 사용하십시오.

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결과

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후각 사구체지도는 OSN 축삭 1 , 2 의 초기 전역 표적화 및 사후 사구체 분리에 의해 형성됩니다. 사구체 분리는 ax / sorting 분자에 의해 매개되는 접착 성 / 반발 축삭 상호 작용에 의해 조절됩니다.이 분자의 발현 수준은 발현 된 OR 분자에 의해 결정됩니다. 사구체 분리에 관련된 axon-sorting 분자는 OB 9 에서 위치 독립적 인 모자이크 방식으로 표현됩니다. 본 연구에서는 Kirrel2 , Sema7A , OLPC , BIG-2, PCDH17 유전자를 선정 하였다. 이러한 축삭 정렬 분자 중 일부는 활성 의존적 인 방식으로 표현됩니다 ( 7 ,

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토론

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parasagittal OB 섹션의 4 배 면역 염색은 많은 수의 사구체에서 동시에 4 개의 축삭 정렬 분자의 발현 수준을 시각화하고 정량화 할 수있었습니다. 이러한 다변량 데이터를 PCA로 분석함으로써 이들 분자의 발현 특성을 추측 할 수 있습니다.

성공적인 염색을 위해서는 조직 샘플 준비가 매우 중요합니다. 일부 프로토콜은 조직을 4 % PFA로 후 고정시키고 cryoprotection을 위해 30 % sucrose로 치료해야한다고 제안했다. 그러나이 단계는이 프로토콜에서 생략되었습니다. 이는 대부분의 경우 이러한 단계가 염색 신호 강도를 감소시키고 배경을 증가시키기 때문입니다. 또한 염색 중 높은 배경을 피하기 위해 절편을 어느 단계에서나 말려서는 안됩니다.

최적의 염색 조건은 사용되는 조직과 항체의 종류에 따라 다릅니다. 그러므로, 그것은 필연적이다.y를 사용하여 각 실험의 특정 염색 조건을 결정합니다. 또한 1 차 .......

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공개 사항

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저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작품은 Mitsubishi Foundation, 다케다 과학 재단, JST PRESTO 및 JSPS KAKENHI 부여 번호 16H06144에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인산염 완충 식염수(PBS) 정제, pH7.4TAKARA BIOT9181
탈지 우유nacalai tesque31149-75
염소 항-Sema7A 항체R& D SystemsAF2068
rat anti-OLPC 항체Merck MilliporeMABT20
마우스 anti-VGLUT2 항체Merck MilliporeMAB5504
goat anti-BIG-2 항체R& D SystemsAF2205
구네아 돼지 anti-Kirrel2 항체Operon BiotechnologiesAnti-Kirrel2 항체는 KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa)로 기니피그를 면역시킴으로써 생성되었습니다: CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
당나귀 안티-마우스 Alexa Fluor 405Abcamab175658
당나귀 안티-염소 Alexa Fluor 488 Jackson ImmunoResearch705-545-003
당나귀 안티 기니피그 Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA21432
당나귀 안티 랫 Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch712-605-153
파라 포름 알데히드 (PFA)Wako162-16065
MAS 코팅 슬라이드 안경MATSUNAMIMAS-01
집게Fine Science Tools11253-27
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-00
해부가위Fine Science Tools14090-09
광현미경KEYENCEBZ-X700
DAPI 필터 큐브KEYENCEOP-87762
GFP 필터 큐브KEYENCEOP-87763
TRITC 필터 큐브KEYENCEOP-87764
Cy5 필터 큐브KEYENCEOP-87766
여과지ADVANTEC00011185
O.C.T 컴파운드사쿠라 파인텍M71484
형

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain? Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
  2. Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
    3. ....

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재인쇄 및 허가

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