체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.
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방법 논문
포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성
이 논문에서
요약
초록
CRISPR / Cas9 게놈 공학 시스템은 적은 노력으로 정확한 게놈 편집을 가능하게함으로써 생물학에 혁명을 일으켰습니다. 특이성을 부여하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)에 의해 유도 된 Cas9 단백질은 표적 유전자좌에서 DNA 가닥 둘 모두를 절단합니다. DNA가 끊어지면 NHEJ (homologous end joining) 또는 homology directed repair (HDR)가 유발 될 수 있습니다. NHEJ는 프레임 변이 돌연변이를 유도하는 작은 결실 또는 삽입을 도입 할 수있는 반면, HDR은 더 크고 더 정확한 섭동을 허용한다. 여기, 우리는 다운 스트림 선택 / 스크리닝을위한 두 가지 옵션으로 설립 CRISPR / Cas9 방법을 결합하여 녹아웃 세포 라인을 생성하기위한 프로토콜을 제시합니다. NHEJ 접근법은 하나의 sgRNA 절단 사이트와 선택에 의존하지 않는 스크리닝을 사용하며, 단백질 생산은 도트 면역 블롯 (dot immunoblot)으로 높은 처리량 방식으로 평가됩니다. HDR 접근법은 관심있는 유전자를 스팬하는 2 개의 sgRNA 절단 부위를 사용합니다. 제공된 HDR 템플릿과 함께이 메소드는 삭제를 수행 할 수 있습니다.삽입 된 선택 저항 마커의 도움을 받아 수십 kb의 적절한 방법과 각 방법의 장점에 대해 설명합니다.
서론
안정한 유전 적 변형은 일시적인 세포 섭동 (perturbation)의 방법보다 이점을 제공하는데, 이는 효율성과 지속 기간이 가변적 일 수 있습니다. 게놈 편집은 징크 핑거 핵산 분해 효소 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 전사 활성제 유사 이펙터 핵산 효소 (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 와 같은 표적 특이 적 뉴 클레아 제의 개발로 인해 최근에 점점 더 보편화되고있다. (CRISPR) 시스템 10 에서 유래 된 RNA 유도 뉴 클레아 제를 포함한다.
CRISPR / Cas9 편집 기계는 박테리아와 고세균이 바이러스 감염을 막기 위해 사용하는 면역계로부터 변....
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프로토콜
1. 바람직한 제거 주위의 상 동성 영역의 동정
참고 : 선택 기반 편집을 사용하는 경우에만 필요합니다.
- HDR 템플릿 ( 그림 1A )에서 상 동성 암 역할을 원하는 원하는 deletecus의 양쪽에 두 개의 영역, 처음 1.5-2 킬로바이트를 선택합니다. 복제를 용이하게하기 위해 두 가닥 (BsGI)에서 BsaI 인식 부위가 부족한 부위를 확인하십시오 (GGTCTC). BsaI 사이트가 불가피한 경우, 다른 유형 IIs 제한 효소 (BsmBI, SapI, BbsI)를 사용하여 수용자 플라스미드 (pUC19-BsaI), 저항 마커 기증자 플라스미드 (pGolden-Neo 또는 pGolden-Hygro) 상 동성 암 PCR 제품 오버행.
2. Cas9-sgRNA 발현 플라스미드의 생성
- 돌연변이 유발을위한 표적 사이트를 정의하십시오. 단일 절단, 선택없는 방법의 경우, 비 - 후 (non-fu)의 확률을 증가시키기 위해 5 '근위 코딩 엑손을 표적으로한다nctional 돌연변이. 두 컷 방법의 경우, 필요에 따라 많은 유전자를 포함하는 두 개의 사이트를 선택하십시오.
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결과
ELAVL1 knockout line을 생성하기 위해 강력한 항체를 사용할 수 있었으므로 단일 sgRNA ( 그림 1A , 왼쪽)를 사용하여 편집 한 다음 도트 면역 블롯을 수행했습니다. 3 개의 sgRNA를 독립적으로 트랜 스펙 션하여 효율을 비교하고 결과 클론에서 표적 효과를 배제했습니다. clonal population으로부터 2 개의 nitrocellulose membrane으로 세포 용 해물을 채취하고 blotting 한 후, ELAVL1과 PUM2 (정상화 대조군으로서)에 대해 조사 하였다 ( 도 2A ). 정량화 된 ELAVL1 대 PUM2 신호의 비율은 격리 된 선들 사이에서 매우 넓은 (> 10 4 배의) 범위를 보였다 ( 그림 2B ). 이 비율을 선택 기준으로 사용하.......
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토론
CRISPR / Cas9 시스템은 다른 일시적인 조작 방법에 대한보다 일관된 대안을 제공하는 안정한 게놈 변형의 효율적인 생성을 가능하게했다. 여기, 우리는 포유 동물 세포 라인에서 CRISPR / Cas9 유전자 녹아웃의 신속한 식별을위한 두 가지 방법을 제시했습니다. 두 가지 방법 모두 세포질이 거의 필요하지 않으므로 클론 배양의 초기 단계에서 시험을 수행하여 시간과 시약을 절약 할 수 있습니다. 두 가지 방법의 효율을 높이려면 시퀀스와 게놈 위치에 따라 효율이 달라 지므로 여러 개의 sgRNA를 테스트하는 것이 좋습니다. 또한 여러 sgRNA를 사용하면 비 표적 유전자의 돌연변이 결과로 아웃 라이어 표현형을 검출하여 표적 외피 효과를 확인하는 데 유용합니다. 효과적인 transfection과 Cas9 분열은 knockouts 생성의 가능성을 크게 증가시킵니다. 또는 상업적으로 공급 된 sgRNA / Cas9 리보 핵산 복합체 32 로 직접 세포를 형질 감염시키고 ,
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공개 사항
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 Gissell Sanchez, Megan Lee 및 Jason Estep을 실험 지원을 위해, Weifeng Gu와 Xuemei Chen은 시약 공유에 대해 인정하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 유능한 E. coli 세포 | |||
| 플라스미드 준비 키트 | |||
| pSpCas9(BB) 플라스미드 | Addgene | 42230 | Ran et al. 2013, sgRNA |
| BbsI 효소 | 클로닝 ThermoFisher | FD1014 | Ran et al. 2013, 클로닝 sgRNA |
| T7 DNA 리가제 | NEB | M0318L | Ran et al. 2013, cloning sgRNA |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al. 2013, cloning sgRNA |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA 증폭 |
| pUC19-BsaI | 변형된 pUC19 플라스미드, 기존 BsaI 부위를 돌연변이시키고 BamHI/EcoRI 분해 후 두 개의 바깥쪽을 향한 BsaI 부위 삽입 | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe 엑소뉴클레아제 | 진원지 | E3105K | |
| 이쑤시개 | 세균성 PCR | ||
| Taq 중합효소 | 세균 콜로니 PCR | ||
| HEK293 인간 세포 | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| 페니실린-스트렙 (옵션) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 웰 플레이트 | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI 트랜스펙션 시약 | Mirus | MIR2300 | 리포펙션 전용 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | 리포펙션 전용 |
| G418(네오마이신) | 시그마 알드리치 | A1720-5G | |
| 하이그로마이신 | 시그마 알드리치 | H3274-250MG | |
| 96 웰 플레이트 | ThermoFisher | 12556008 | |
| 수동 용해 버퍼, | |||
| 프로토콜 | |||
| 로셀룰로오스 멤브레인 | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | 레시피 | ||
| Dehydrated milk | |||
| HRP-conjugated secondary antibodys를 위한 | SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 |
| Quantabio | 95091-025 | ||
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
참고문헌
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).<....
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재인쇄 및 허가
