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방법 논문

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

7.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55959

⸱

2017년 11월 21일

 ,  , 
1Department of Chemistry, McGill University, 2Department of Chemistry, York University

이 논문에서

요약

선물이 바이오 폴딩 및 바인딩 차동 스캐닝 열 량 측정을 사용 하 여 thermolabile ligands와의 상호 작용의 신속한 특성화에 대 한 프로토콜.

초록

차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC) 바이오 폴딩 및 바인딩 상호 작용을 경 세 하는 열역학 매개 변수 측정을 위한 강력한 기술입니다. 이 정보는 새로운 약 제 화합물의 설계에 중요 합니다. 그러나, 많은 약물 관련 ligands 않습니다 화학적으로 안정 된 DSC 분석에 사용 된 높은 온도에. 따라서, 바인딩 상호 작용을 측정 ligands 및 열 변환 제품의 농도 열 셀 내에서 끊임없이 변화 하기 때문에 도전 이다. 여기, 우리 thermolabile ligands 및 DSC를 사용 하 여 빠르게 변환 프로세스 접는, 바인딩 및 리간드에 열역학 및 운동 정보를 얻기 위해 프로토콜을 제시. 우리는 DNA aptamer MN4 thermolabile ligand 코카인을를 우리의 메서드를 적용 했습니다. 계정에 thermolabile ligand 변환에 대 한 새로운 글로벌 피팅 분석을 사용 하 여 매개 변수 바인딩 및 접는의 완전 한 세트 DSC 실험의 쌍에서 가져옵니다. 또한, 우리는 하나의 보조 DSC 데이터 집합으로 thermolabile ligand 변환에 대 한 속도 상수를 얻을 수 있습니다 보여줍니다. 식별 하 고 몇 가지 더 복잡 한 시나리오에서 데이터 분석에 대 한 지침, biomolecule, 천천히 접는, 느린 바인딩 및 thermolabile ligand의 급속 한 소모의 돌이킬 수 없는 집계를 포함 하 여 제공 됩니다.

서론

차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC) quantitating 바이오 바인딩 및 접는 상호 작용1,2,3에 대 한 강력한 방법입니다. DSC의 강점 바인딩 및 접는 메커니즘, 명료 하 고 해당 열역학 매개 변수2,3를 생성 하는 능력을 포함 합니다. 또한, DSC 솔루션 근처 생리 적 조건 하에서 수행할 수 있습니다 그리고는 biomolecule 또는 ligand, 예를 들어, fluorophores, 스핀-레이블 또는 핵 동위4의 라벨 필요 하지 않습니다. 악기는 존재에 ligand의 부재는 biomolecule 변성 하는 데 필요한 열의 양을 측정 온도 검색 합니다. 결과 thermograms ligand 바인딩 및 프로세스를 접는 통치 열역학 매개 변수를 추출 하는 데 사용 됩니다. DSC 또는 다른 열역학 기술을 제공 하는 정보가 쓰이므로1,5,6,,78을 대상으로 약물의 디자인 지도 중요 합니다. 그러나, 높은 온도에 반복 검사 (~ 60-100 ° C) 문제가 될 수 있습니다. 예를 들어 많은 약물 중요 한 화합물 받아야 재배치 또는 높은 온도9,,1011, 즉지속적인된 노출 시 분해, 그들은 thermolabile. DSC에 의해 상호 작용을 일반적으로 바인딩 시험 열역학 분석12열상의 재현성을 확인 하려면 여러 개의 앞으로 역 검사를 필요 합니다. 초기 ligand의 농도 감소 하면서 각 검색 이후 변경 된 바인딩 특성을 가진 보조 형태로 초기 ligand의 열 변환 형태와 연속 thermograms의 위치에서 발음된 차이에 리드는 열 변환 제품 축적. 이러한 데이터 세트는 전통적인 분석 의무가 없습니다.

우리는 최근 열역학 매개 변수 바이오 접는 통치 및 바인딩 참조는 단일 ligand 바인딩 실험에서 상호 작용의 완전 한 집합을 생성 하는 thermolabile ligand DSC 데이터 집합에 대 한 글로벌 피팅 방법 개발에 무료 biomolecule4에 대 한 필요한 열상. 분석에 필요한 샘플 및 실험 시간 감소 ~ 표준 DSC 접근 방식에 비해 10 배. 우리가 차지 하 고 이것을 가정 하 여 열 변환은 열상 ligand 농도에 의존 하지 않는 각 스캔의 고온 부분 중 발생 하는 리간드에 대 한. 따라서, ligand 농도 열상 열역학 매개 변수를 추출 하는 데 사용 되는의 부분 내에서 상수 이다. 우리는 또한 어떻게 ligand 열 변환에 대 한 속도 상수 장기간 높은 온도 평형 한 보충 실험을 수행 하 여 얻어질 수 있다 설명 했다. Ligand 열 변환 덜 온도 따른 시스템에 대 한 (즉, 모든 온도에서 분명 발생), 분석 변수 ligand 농도 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 여기 우리 DNA aptamer MN4 benzoylecgonine 높은 온도에서 빠르게 변환 thermolabile ligand 코카인의 존재에 대 한이 절차 설명 (> 60 ° C). 말라리아 이후 이러한 실험적인 온도에서 변환 받아야 하지 않습니다 또한 MN4 바인딩 ligand thermolability에 대 한 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 우리는 thermolabile ligand DSC 데이터 집합 및 그들의 분석 저조한 접는, 바인딩 및 리간드의 열역학 및 운동 매개 변수 변환 프로세스의 인수를 설명 합니다.

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프로토콜

1. 샘플 준비

  1. 원하는 biomolecule13정화.
    참고:이 프로토콜 사용 하 여 구입 코카인 바인딩 DNA aptamer MN4 세 번 뒤 3 kDa 분자량 차단 막으로 원심 필터를 사용 하 여 이온된 수의 3 라운드 2 M NaCl에 대 한 교환 후.
  2. 합성 및 정화, 또는 원하는 thermolabile ligand13를 구입.
    참고: MN4 thermolabile ligand 코카인을 바인딩합니다. MN4 또한 이러한 실험 온도에서 ligand thermolability에 대 한 부정적인 제어로 사용 되는 말라리아를 바인딩합니다.
  3. 순화 biomolecule의 투 석 및 ligands (20 m m 인산 나트륨 및 140 m m NaCl 버퍼, pH 7.4, MN4와 여기에 사용 되는 ligands)의 해산에 대 한 버퍼를 준비 합니다.
  4. 투 석 튜브를 사용 하 여 버퍼의 적어도 2 L에 대하여 biomolecule dialyze-0.5와 1.0 kDa 잘라.
  5. 0.2 µ m 필터를 철저 하 게 버퍼 equilibrated 되었습니다 통해 최종 버퍼 (작업 버퍼 라고도 함)를 필터링 합니다.
  6. 그리고 무게는 ligands의 원하는 대 중에 밖으로 필터링된 작업 버퍼에 그들을 해산. 원하는 ligand 농도 대 중 정확 하 게 무게를 너무 작은 경우, 집중된 ligand 재고 솔루션 (예: 10 배)를 확인 합니다.
    참고: 그것은 중요 한 모든 DSC 실험 활용 샘플에 대 한 동일한 작업 버퍼와 리간드, 즉, 적이 버퍼를 일으킬 것입니다로 ligand는 biomolecule 보다 작업 버퍼의 다른 배치에 녹아은 실험 수행 데이터에서 불일치 유물입니다.
  7. 0.2 µ m 필터를 철저 하 게 작업 버퍼 equilibrated 되었습니다 통해 biomolecule 재고 솔루션을 필터링 합니다.
  8. 흡 광도 측정에 의해 biomolecule 농도 결정 (260 nm MN4 280 같은 핵 산에 대 한 단백질에 대 한 nm).
  9. 4 ° C 냉장고 (MN4와 여기에 사용 되는 ligands에 적합), 또는-20 준비 biomolecule 및 리간드를 저장 또는-80 ° C 경우 biomolecule 및 ligands 고정 및 장기 저장이 필요. 드가 테이블 상단에 버퍼, biomolecule, ligand 솔루션 degasser ( 재료의 표참조) DSC에 로드 하기 전에.
    참고: Degassing 더 높은 온도에서 DSC에 거품 형성을 방지 도움이 됩니다. 거품 발생 신호 아티팩트 DSC 피크 모양 및 베이스 라인 애매.

2. DSC 준비

  1. DSC에서 압력 손잡이 나사 ( 재료의 표참조).
  2. 작업 버퍼에서 실리콘 튜브를 실행 하 고 참조 모 세관의 전면 플랜지 (금속 오프닝)에 연결 합니다.
  3. 앞 예제 플랜지에 후방 참조 플랜지를 연결 하 여 참조 및 샘플 모세 혈관 사이 다리를 만듭니다.
  4. 폐기물 플라스 크에 연결 된 진공 라인으로 실행 되는 후면 샘플 플랜지 실리콘 튜브의 조각을 연결 합니다.
  5. 작업 버퍼의 200 mL와 함께 DSC를 진공 라인을 켭니다.
  6. 작업 버퍼와 DSC의 참조 모 세관을 로드 합니다. 약 참조 모 세관 플랜지에 실리콘 튜브의 3-5 cm 섹션을 연결 합니다.
  7. 후면 플랜지의 실리콘 튜브에 1 mL 피 펫 팁을 삽입 합니다. 작업 버퍼는 피 펫의 0.8 mL 그리고 전면 참조 플랜지의 실리콘 튜브에 버퍼 피 펫 팁을 삽입.
  8. 부드럽게 통과 전면 실리콘 튜브를 통해 작업 버퍼 참조 모 세관으로 아래로 피 펫 플런저를 누르고 후면 플랜지로 최대 피 펫 팁 첨부. 작업 버퍼 레벨에 바로 앞 실리콘 튜브 위에 도달할 때까지 피 펫 플런저를 누르십시오 다음 작업 버퍼 수준 바로 위에 후면 실리콘 튜브에 도달할 때까지 피 펫 플런저를 놓습니다.
    1. 반복 앞뒤로 거품의 참조 모 세관에서 볼륨을 제거 하는 작업 버퍼를 전달 합니다.
      참고: 일반적으로, 앞뒤로 솔루션의 10 단계는 모든 거품을 취소 하기에 충분 한 있습니다.
  9. 엄지손가락으로 뒤쪽 피 펫 팁을 뚜껑을 부드럽게 후면 피 펫 팁에서에서 그들을 제거 참조 플랜지 연결 된 실리콘 튜브와 전면 피 펫에 잡아당깁니다.
  10. 로드 단계 2.6 2.9에서 작업 버퍼 샘플 모 세관. 후면 참조에 검은 플라스틱 캡을 놓고 떠나 발견 전면 플랜지 플랜지를 샘플 합니다.
  11. 압력 핸들을 첨부 합니다.
  12. DSC 소프트웨어를 열고 ( 재료의 표참조) 파워 독서는 안정; 되 면 빨강 위쪽 인터페이스의 상단에 화살표를 클릭 하 여 악기를 기 압 및 DSC 전원 상단에 있는 상자에 표시 됩니다 악기 온도 및 압력 읽기 인터페이스의 오른쪽.
    참고: 모니터 전원 DSC로 읽는 속도가 힘에 변화 보다 더 ~ 10 µW 데이터에서 아티팩트를 일으킬 수 있는 모 세관에 거품 형성을 나타냅니다. 솔루션 제거 되어야 하며 degassed 계속 하기 전에 추가.
  13. 정방향 및 역방향 검색을 수행 하 여 작업 버퍼와 DSC를 equilibrate. 화면 왼쪽에 "실험적인 방법" 탭에서 "검색" 옵션을 DSC 온도 스캐닝 모드에서 실행 되도록 선택 확인 합니다.
    참고: 실험적인 매개 변수는 검색 범위, 스캔 속도, 낮은 및 높은 온도 평형 시간, 및 검사의 수 온도.
    1. "온도 매개 변수" 삽입 "실험적인 방법" 탭 아래에서 "난방"에 대 한 버튼을 클릭 합니다. 하위 및 상위 실험 온도, 1 ° C/min 스캔 속도와 60에 대 한 1 및 100 ° C를 입력 평형 기간에 대 한 s.
    2. 재래식 기간에 대 한 입력된 필드 아래의 "추가 시리즈" 단추를 클릭 합니다. (대 한 한 난방 및 냉각 한 스캔) 팝업 창에서 "추가 하는 단계" 필드에 2를 입력 하 고 "대체 난방/냉각" 확인란을. "클릭"; 추가 스캔 인터페이스의 아래 부분에 나타납니다. 각 검색에 대 한 매개 변수를 확인 원하는.
    3. 인터페이스의 상단에 녹색 "재생" 버튼을 클릭 하 여 실험을 시작 합니다. 원하는 폴더에 이동한 실험 팝업 창에서 저장할 파일 이름을 입력 합니다. "실험 방법" 탭의 오른쪽에 "데이터" 탭을 클릭 하 여 실험 진행 상황 보기

3. Thermolabile Ligand DSC 데이터 집합 수집

참고: 최소한의 절차 5 실험의 구성: 버퍼와 ligand 없이 참조 실험 (기준선 빼기 사용 내용참조), 샘플 무료 biomolecule ligand 바인딩 biomolecule 실험 그리고 ligand 바인딩 biomolecule 장기간 높은 온도 평형으로.

  1. 샘플 데이터의 초기 빼기에 대 한 참조 실험을 실행 합니다. 작업 버퍼 모두 모세 혈관에서 DSC를 다시 로드 하 고 1 ° C min-1 위 (높은 온도)에 적당 한 온도 범위에 걸쳐 여러 개의 앞으로 역 검사를 수집 120 평형 시간 s.
    1. 개별적으로 각을 강조 하 고 인터페이스의 오른쪽 중간에 빨간색 X를 클릭 하 여 인터페이스의 아래 부분에서 이전 버퍼 평형 검사를 삭제 합니다. "시리즈 추가" 버튼을 클릭 "추가 하는 단계", 필드에 20을 입력 하 고 "대체 난방/냉각" 상자를 검사 하 여 새로운 검사를 추가 합니다. 확인을 클릭 하 고 위와 같이 녹색 재생 버튼을 클릭 하 여 실험을 실행.
    2. 반복 단계 3.1-3.1.1 작업 버퍼 참조를 모두 모세 혈관에 ligand의 원하는 농도 포함 하는 리간드에 대 한 실험 (120을 사용 하 여 두 개의 별도 실험을 수집 s 및 600 s 높은 온도 평형 시간 각각, thermolabile 리간드 변환에 대 한 속도 상수 인수에 사용할 수).
      참고: 여기에 사용 되는 스캔 속도 통해 후속 실험에서 biomolecule 정방향 및 역방향 검색 ( 내용참조)에서 열 평형에. 스캔 속도 < 0.1-0.2 ° C min-1 시끄러운 thermograms 이어질 DSC 실험에 적용 되지 않습니다. 온도 무료 biomolecule ligand 포화 biomolecule의 녹는 온도 이상 잘의 녹는 온도 아래 우물에서 연장 해야 합니다 (~ MN4 20-80 ° C). (예, 앞으로 10 및 20 총 10 역 검사는 충분 한)에 대 한 검사의 재현성을 확인 합니다.
    3. (코카인, 말라리아) 등 여러 개의 ligands를 사용 하는 경우는 모세 혈관에서 리간드를 제거 하 고 교차 오염을 방지 하기 위해 실행 사이의 작업 버퍼 (반복 단계 2.5에서에서)의 200 mL와 함께 DSC를 플러시.
      참고: 이전 ligand 모 세관 벽에 강하게 adsorbs 버퍼 플러시를 적절 하 게 제거 되지 않습니다 있는지 확인 하려면 ligand 바인딩 실행 후 무료 biomolecule에 복제 실험을 수행 하기 위해 도움이 됩니다. 무료 biomolecule 위한 thermograms ligand 바인딩 실험 후 더 큰 규모와 높은 변성 온도에 이동 될 경우, 그것은 이전 ligand는 여전히 홍 조 후 열 량 계에 존재. 20%를 가진 모 세관을 배양 하 여 흡착된 ligand를 제거 플라스틱 모자와 압력 핸들에서 60 ° C에서 1 시간에 대 한 Contrad-70. DSC 소프트웨어에서 실험 모드를 "등온선" 기간 및 등온선 온도 대 한 60 ° C에 대 한 실험 방법 탭 선택 3600 s 아래 0 평형 시간에 대 한 입력으로 변경. "실험적인 방법에 추가"를 클릭 합니다. 등온 실험 화면 아래 부분에 나타납니다. 완료 후, 2 L 이온된 물으로 악기를 플러시 하 고 단계 2.5에서에서 반복 합니다.
  2. 샘플 실험 같은 로드 절차 및 실험적인 매개 변수는 참조를 검색 하는 DSC를 사용 하 여 실행 합니다. 무료 biomolecule 데이터 집합에 대 한 샘플 모 세관 작업 버퍼에 원하는 농도에서 무료 biomolecule 포함 하는 동안 참조 모 세관 작업 버퍼를 포함 되어 있는지 확인 합니다.
    1. Ligand 바인딩 실험에 대 한 확인 참조 모 세관에 작업 버퍼에는 ligand biomolecule 플러스 ligand 샘플 모 세관에서 작업 버퍼에는. 2.5 단계 에서처럼 다른 ligands의 추가 사이 시스템을 플러시.
  3. 수행 추가 실험은 biomolecule와 높은 온도 평형 기간 600 증가 thermolabile ligand에 바인딩된 s 및 다른 실험적인 매개 변수는 단계 3.2.1 동일.
    참고: 두 번째 ligand 바인딩 실험에 대 한 높은 온도 평형 기간의 기간 단순히는 ligand 짧은 평형 시간 실험 보다 더 빠르게 고갈 되도록 선택 됩니다. 첫 번째에서 ligand 바인딩 봉우리 검색 번호의 기능으로 천천히 부패 실험 하는 경우 (예를 들어, 연속 피크 맥시 마의 차이 인 ≤ 0.5 ° C)에 높은 온도 평형에 10-을 20 배 증가 예상 두 번째 실험 동안에 ligand를 고갈 적절 하 게 합니다. Ligand 변환 속도 상수의 정확한 계산 하려면 두 번째 실험 첫 번째 기준으로 리간드의 신속한 고갈에 합니다. 두 실험의 글로벌 분석에서 추출 된 ligand 농도 유사 하 고 따라서 ligand 고갈 두 번째 실험에서 충분히 가속 되지 경우 사용할 수 없게 될 것입니다.

4입니다. 데이터 처리

  1. 오픈 DSC 실험 DSC 데이터 분석 소프트웨어에서 파일 ( 재료의 표참조) 및 스프레드시트도 원시 전원 데이터 내보내기.
  2. 피팅 하는 데이터에 대 한 소프트웨어에 원시 전원 데이터를 포함 하는 스프레드시트를 가져옵니다.
  3. 초기 자유에서 버퍼 전원 데이터 그리고 ligand 바인딩 biomolecule 실험을 빼서 샘플 데이터를 뺍니다.
    참고: thermolabile ligand 실험에 대 한 초기 ligand의 농도 각 스캔 감소 됩니다. 따라서, 샘플 검사 1에서 버퍼 스캔 1 빼기 위해 이상적 이다. 우리는 ligand 변환 진행 하 고 따라서 단일 thermolabile ligand 버퍼 스캔의 모든 thermolabile ligand 바인딩 데이터를 사용할 수 있는 버퍼 스캔 코카인을 분명 변경 되지 않습니다 나타났습니다.
  4. 열 용량 기준 뺀 샘플 전원 데이터를 변환 합니다.
    참고: 변환 예상된14,,1516수 biomolecule의 부분 특정 볼륨을 필요 합니다. 열 용량 전력 변환에 대 한 방정식 되었습니다17위에서 설명한.

5. 데이터 분석

  1. 세계적으로 초기 계획, ligand 농도, 폴딩, 및4에서 설명한 대로 매개 변수를 바인딩 ligand의 단일 세트와 함께 짧은 평형 시간 thermolabile ligand 바인딩 열 용량 데이터 집합에 맞게.
  2. 앞에서 설명한4thermolabile ligand 변환에 대 한 속도 상수를 계산 하려면 긴 평형 시간 데이터 집합에 대 한 글로벌 맞는 반복 합니다.

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결과

Thermolabile ligand 기무사에 대 한 대표적인 데이터는 그림 1에 나와 있습니다. 위치 및 thermolabile ligand 바인딩 피크의 높이 연속적으로 이동 언바운드 biomolecule 그쪽으로 thermolabile ligand 각 스캔 (그림 1a)와 고갈로 합니다. 무료 변성 프로필 thermolabile ligand 변환 (그림 1b)의 끝점에 대 한 참조로 사용 됩니다. MN4 말라리아에 바인딩된에 대 한 데이터는 thermolabile ligand 변환 (그림 1b)에 대 한 부정적인 컨트롤로 표시 됩니다. 마지막 thermolabile ligand 검사 약간 높은 전환 중간점 및 thermolabile ligand 변환 제품 ...

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토론

수정 및 문제 해결

그림 1 그림 2 에 사용 되는 글로벌 피팅 분석의 세부 되었습니다4위에서 설명한. 여기, 우리가 수행 하 고 thermolabile ligands와 DSC 바인딩 실험 분석의 실용적인 측면을 설명 합니다. DSC 기준선에 혼자 thermolabile ligand는 ligand에서 뺍니다 얻은 주의 + biomolecule dataset, 효과적으로 또는 열 변환에 의해 흡수 열을 밖으로 취소 자체 처리. (그림 1 및 그림 2) 표준 thermolabile ligand 글로벌 피팅 분석 가정 시스템 온도 스캔을 통해 열역학 평형에 있으며 the...

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공개 사항

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

감사의 글

R. W. H. V 맥 길 자연 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC) 교육 프로그램 Bionanomachines에 의해 지원 되었다. A. K. M. 및 P. E. J. NSERC 보조금 327028-09 (A. K. M) 및 238562 (P. E. J.)에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
염화나트륨Chem Impex#00829
인산나트륨 일염기성 이수화물시그마 알드리치71502
인산나트륨 이염기성시그마 알드리치S9763
분자생물학용 탈이온수MilliporeH20MB1001
0.2 미크론 멸균 주사기 필터VWRCA28145-477
3 kDa 원심 필터MilliporeUFC900324
투석 튜빙 0.5-1.0 kDa 컷오프Spectrum Laboratories131048
실리콘 튜빙VWR89068-474
플라스틱 DSC 플랜지 캡TA Instruments6111
DNA aptamer MN4Integrated DNA Technologieshttps://www.idtdna.com/site/order/menu
코카인시그마 알드리치C008
퀴닌시그마 알드리치22620
나노DSC-III 마이크로 열량계TA 기기http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun 소프트웨어TA 기기http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze 소프트웨어TA Instrumentshttp://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
Contrad-70VWR89233-152

참고문헌

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