바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

요약

선물이 바이오 폴딩 및 바인딩 차동 스캐닝 열 량 측정을 사용 하 여 thermolabile ligands와의 상호 작용의 신속한 특성화에 대 한 프로토콜.

초록

차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC) 바이오 폴딩 및 바인딩 상호 작용을 경 세 하는 열역학 매개 변수 측정을 위한 강력한 기술입니다. 이 정보는 새로운 약 제 화합물의 설계에 중요 합니다. 그러나, 많은 약물 관련 ligands 않습니다 화학적으로 안정 된 DSC 분석에 사용 된 높은 온도에. 따라서, 바인딩 상호 작용을 측정 ligands 및 열 변환 제품의 농도 열 셀 내에서 끊임없이 변화 하기 때문에 도전 이다. 여기, 우리 thermolabile ligands 및 DSC를 사용 하 여 빠르게 변환 프로세스 접는, 바인딩 및 리간드에 열역학 및 운동 정보를 얻기 위해 프로토콜을 제시. 우리는 DNA aptamer MN4 thermolabile ligand 코카인을를 우리의 메서드를 적용 했습니다. 계정에 thermolabile ligand 변환에 대 한 새로운 글로벌 피팅 분석을 사용 하 여 매개 변수 바인딩 및 접는의 완전 한 세트 DSC 실험의 쌍에서 가져옵니다. 또한, 우리는 하나의 보조 DSC 데이터 집합으로 thermolabile ligand 변환에 대 한 속도 상수를 얻을 수 있습니다 보여줍니다. 식별 하 고 몇 가지 더 복잡 한 시나리오에서 데이터 분석에 대 한 지침, biomolecule, 천천히 접는, 느린 바인딩 및 thermolabile ligand의 급속 한 소모의 돌이킬 수 없는 집계를 포함 하 여 제공 됩니다.

서론

차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC) quantitating 바이오 바인딩 및 접는 상호 작용^1,2,3에 대 한 강력한 방법입니다. DSC의 강점 바인딩 및 접는 메커니즘, 명료 하 고 해당 열역학 매개 변수^2,3를 생성 하는 능력을 포함 합니다. 또한, DSC 솔루션 근처 생리 적 조건 하에서 수행할 수 있습니다 그리고는 biomolecule 또는 ligand, 예를 들어, fluorophores, 스핀-레이블 또는 핵 동위⁴의 라벨 필요 하지 않습니다. 악기는 존재에 ligand의 부재는 biomolecule 변성 하는 데 필요한 열의 양을 측정 온도 검색 합니다. 결과 thermograms ligand 바인딩 및 프로세스를 접는 통치 열역학 매개 변수를 추출 하는 데 사용 됩니다. DSC 또는 다른 열역학 기술을 제공 하는 정보가 쓰이므로^1,5,

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 원하는 biomolecule¹³정화.
   참고:이 프로토콜 사용 하 여 구입 코카인 바인딩 DNA aptamer MN4 세 번 뒤 3 kDa 분자량 차단 막으로 원심 필터를 사용 하 여 이온된 수의 3 라운드 2 M NaCl에 대 한 교환 후.
2. 합성 및 정화, 또는 원하는 thermolabile ligand¹³를 구입.
   참고: MN4 thermolabile ligand 코카인을 바인딩합니다. MN4 또한 이러한 실험 온도에서 ligand thermolability에 대 한 부정적인 제어로 사용 되는 말라리아를 바인딩합니다.
3. 순화 biomolecule의 투 석 및 ligands (20 m m 인산 나트륨 및 140 m m NaCl 버퍼, pH 7.4, MN4와 여기에 사용 되는 ligands)의 해산에 대 한 버퍼를 준비 합니다.
4. 투 석 튜브를 사용 하 여 버퍼의 적어도 2 L에 대하여 biomolecule dialyze-0.5와 1.0 kDa 잘라.
5. 0.2 µ m 필터를 철저 하 게 버퍼 equilibrated 되었습니다 통해 최종 버퍼 (작업 버퍼 라고도 함)를 필터링 합니다.

결과

Thermolabile ligand 기무사에 대 한 대표적인 데이터는 그림 1에 나와 있습니다. 위치 및 thermolabile ligand 바인딩 피크의 높이 연속적으로 이동 언바운드 biomolecule 그쪽으로 thermolabile ligand 각 스캔 (그림 1a)와 고갈로 합니다. 무료 변성 프로필 thermolabile ligand 변환 (그림 1b)의 끝점에 대 한 참조로 사용 됩니다. MN4 말라리아에 바인딩된에 대 한 데이터는 thermolabile ligand 변환 (그림 1b)에 대 한 부정적인 컨트롤로 표시 됩니다. 마지막 thermolabile ligand 검사 약간 높은 전환 중간점 및 thermolabile ligand 변환 제품 .......

토론

수정 및 문제 해결

그림 1 그림 2 에 사용 되는 글로벌 피팅 분석의 세부 되었습니다⁴위에서 설명한. 여기, 우리가 수행 하 고 thermolabile ligands와 DSC 바인딩 실험 분석의 실용적인 측면을 설명 합니다. DSC 기준선에 혼자 thermolabile ligand는 ligand에서 뺍니다 얻은 주의 + biomolecule dataset, 효과적으로 또는 열 변환에 의해 흡수 열을 밖으로 취소 자체 처리. (그림 1 및 그림 2) 표준 thermolabile ligand 글로벌 피팅 분석 가정 시스템 온도 스캔을 통해 열역학 평형에 있으며 the.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화나트륨	Chem Impex	#00829
인산나트륨 일염기성 이수화물	시그마 알드리치	71502
인산나트륨 이염기성	시그마 알드리치	S9763
분자생물학용 탈이온수	Millipore	H20MB1001
0.2 미크론 멸균 주사기 필터	VWR	CA28145-477
3 kDa 원심 필터	Millipore	UFC900324
투석 튜빙 0.5-1.0 kDa 컷오프	Spectrum Laboratories	131048
실리콘 튜빙	VWR	89068-474
플라스틱 DSC 플랜지 캡	TA Instruments	6111
DNA aptamer MN4	Integrated DNA Technologies	https://www.idtdna.com/site/order/menu
코카인	시그마 알드리치	C008
퀴닌	시그마 알드리치	22620
나노DSC-III 마이크로 열량계	TA 기기	http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun 소프트웨어	TA 기기	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze 소프트웨어	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
Contrad-70	VWR	89233-152