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방법 논문

2 층 미세 플랫폼에서 애기 모종의 루트 머리 형태를 이미징

8.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55971

⸱

2017년 8월 15일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bredesen Center for Interdisciplinary Research and Graduate Education, University of Tennessee, 2Bioscience Division and Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge national Laboratory, 3Department of Biochemistry and Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, 4Department of Microbiology, University of Tennessee

이 논문에서

요약

이 문서에서는 기본 루트 및 루트 머리카락 하나의 광학 평면을 제한 하는 2 층 미세 플랫폼에서 애기 thaliana 묘 문화 하는 방법을 보여줍니다. 이 플랫폼은 다른 방법으로 고해상도 영상 뿐만 아니라 좋은 루트 형태학의 실시간 광학 영상에 대 한 사용할 수 있습니다.

초록

루트 머리카락 더 나은 물 통풍 관 및 식물에 의해 영양소 흡수에 대 한 루트 표면 영역을 증가. 왜냐하면 그들은 작은 크기와 그들의 자연 환경에 의해 종종 가려진, 루트 머리 형태 및 기능 있으며 공부 하기 어려운 식물 연구에서 종종 제외. 최근 몇 년 동안, 미세 플랫폼 이미징 시스템에 전송 하는 동안 뿌리를 방해 하지 않고 높은 해상도에서 루트 시스템을 시각화 하는 방법을 제안 했다. 미세 플랫폼 제시 여기 빌드 이전 공장 온 칩 연구에 루트 머리와 같은 광학 평면을 애기 thaliana 주요 루트를 제한 하려면 2 계층 장치를 통합 하 여. 이 디자인 수는 휴대에 루트 머리카락의 정량화 및 세포 기관이 수준 및 또한 방지 실험적 치료의 추가 동안 표류 하는 z 축. 우리는 경종에 대 한 gnotobiotic 환경을 유지 하면서 유체 펌프에 대 한 필요 없이 포함 된 및 수 화 환경에서 장치를 저장 하는 방법을 설명 합니다. 광학 이미징 실험 후 장치는 분해 고 원자 힘 또는 좋은 루트 구조를 그대로 유지 하면서 전자 현미경을 스캐닝 기판으로 사용 될 수 있습니다.

서론

좋은 루트 기능 증가 물, 식물, 새로운 토양 공간을 탐험 하 고 증가 하는 전체 루트 영역에 대 한 영양소 수집. 이러한 좋은 루트 기능 회전율 지 먹이 사슬1 자극에 중요 한 역할 그리고 특정 식물 종에 잘 뿌리 수는 높은 대기 이산화탄소에서 두 배로 예상된2. 잘 뿌리는 일반적으로로 정의 그 직경, 2mm 보다 작은 비록 그들의 기능3잘 뿌리를 특성화에 대 한 새로운 정의 옹호. 많은 정밀한 뿌리 처럼 루트 머리카락 글귀와 흡수의 기능을 제공 하지만 미크론 순서 직경을 가진 많은 더 작은 공간을 차지. 그들의 소형 때문에 루트 머리 이미지에 제자리에서 하기 어려운 고 필드 규모 실험 및 모델에 전체 루트 아키텍처의 한 부분으로 수시로 간과 된다.

루트 머리 테라 전 연구, 한 천 배지에서 자란 묘 목부터 등, 세포 성장 및 전송4,5에 대 한 귀중 한 정보 과학 커뮤니티 제공. 한 천 배지는 비소와 실시간으로 이미지를 루트 시스템을 허용, 그들은 영양소, 식물 호르몬, 또는 박테리아 같은 실험적 치료의 추가 대 한 높은 환경 제어를 제공 하지 않습니다. 고해상도 이미징 동안 동적 환경 제어 affording 식물 연구를 위한 미세 플랫폼의 출현을 촉진 하는 새로운 솔루션입니다. 이러한 플랫폼 비 파괴적인 성장 및 높은 처리량 형질6,7,,89, 고립 된 화학 치료에 대 한 몇 가지 식물 종의 시각화 사용 하는 10, 힘 측정11,12, 그리고 미생물13의 추가. 미세 플랫폼 디자인 단일 오픈 스페이스 유체 레이어는 뿌리 수 전파, 허용 루트 머리카락 성장 또는 치료 하는 동안 광학 초점 밖 드리프트의 사용에 집중 했다.

여기 우리은 이전 공장에 칩 디자인 주요 루트와 같은 영상 평면에 경종 루트 머리카락을 수감 하 여 구축 하는 2 층 미세 플랫폼 사진 및 소프트-리소 그래피 방법을 사용 하 여 개발을 위한 절차를 제시. 실시간으로, 높은 해상도, 그리고 실험적인 치료 과정 전반에 걸쳐 루트 머리 개발을 추적할 수 있습니다. 우리의 자란 메서드 애기 thaliana 묘 씨 플랫폼 및 주사기 펌프 장비의 사용을 필요로 하지 않는 수산화 하 고 메 마른 환경에서 주일에 대 한 교양에서 출 아 했다 수를 수 있습니다. 시간 경과 영상 실험 결론은, 일단 여기에 제시 된 플랫폼 미세한 루트 기능 들의 위치를 방해 하지 않고 열 수 있습니다. 다른 고해상도 이미징 방법의 사용 수 있습니다. 여기 우리 제공 대표 결과 정량화와이 플랫폼에서 루트 머리 형태학의 시각화에 대 한 광학, 스캐닝 전자 현미경 (SEM), 및 원자 힘 현미경 검사 법 기술 (AFM).

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프로토콜

1. 2 층 플랫폼 제작

  1. 다층 마스터의 제조
    1. 스핀 코트 에폭시 기반 부정적인 감광 제 (~63.45% 고체, 1250 중부 표준시) 제조업체의 사양에 따라 (2000 rpm 45 s) 첫 번째 디자인 계층에 대 한 20 µ m의 원하는 높이를 4 인치 직경 실리콘 웨이퍼에.
    2. 소프트-빵 4 분 95 ° c.에 대 한 저항 입히는 웨이퍼 냉각 5 분 노출 UV 15 빛을 웨이퍼에 웨이퍼를 허용 s (150 ~ mJ/cm2 365 nm)는 UV에 포토 마스크를 통해 문의 aligner 아래 계층의 형상을 정의 하.
    3. 사후 노출 구워 95 ° c.에 5 분 동안 웨이퍼 부정적인 감광 에폭시 기반의 두 번째 계층에 반환 웨이퍼 spin coater를 스핀으로 개발, 없이 (~76.75% 고체, 80000 cSt) 150-200 µ m의 두 번째 레이어 높이 달성 하기 위해 3000 rpm에서.
    4. 45 분 동안 95 ° C 열판을 전송 하기 전에 5 분 동안 휴식을 웨이퍼를 허용 합니다. 열판에 베이킹 후 웨이퍼를 제거 하 고 냉각 하 고 편평한 평면에 또 다른 5 분 동안 실내 온도에 강하게 저항을 허용 합니다. 정렬 및 30에 대 한 두 번째 레이어 포토 마스크를 웨이퍼를 노출 UV 연락처 aligner (약 300 mJ/cm2의 복용량)에 s.
    5. 사후 노출 빵 95 ° C에서 15 분 열판에 웨이퍼를 배치 하 여 수행 하 고 웨이퍼를 개발 하기 전에 5 분 동안 편평한 평면에 냉각을 허용.
    6. 플라스틱 그릇에 웨이퍼를 배치 하 고 적절 한 개발자에 웨이퍼를 잠수 하 여 저항 레이어 모두를 동시에 개발 하는 방법 ( 자료 표참조). 부드럽게 바위는 웨이퍼 위에 신선한 개발자를 때때로 요리.
    7. 17 분 후 소 프로 파 놀 (IPA)와 웨이퍼 린스. 흰색 필름 나타나면 영화 사라질 때까지 개발자와 IPA는 웨이퍼를 rinsing 사이 반복을 계속 합니다. 건조 질소로 꽃무늬 실리콘 웨이퍼.
  2. 입니다 소프트-리소 그래피
    1. 30에 대 한 공기 플라즈마 실리콘 웨이퍼를 노출 높이 설정 플라즈마 클리너에 s (자료 테이블 참조) 청소. Silanize trichloro (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 시간-퍼플-n-octyl) silane silane (85 ° C) 2 h의 인화점 아래 열판에 화학 후드에서와 웨이퍼.
    2. 마스터 실리콘 웨이퍼에 경화제를 10:1 비율입니다 (PDMS)을 붓는 다. 진공 챔버에 혼합된 PDMS 드 고 1 시간 또는 PDMS 완전히 치료 될 때까지 70 ° C 오븐에 폴리머를 치료.
    3. 메스를 사용 하 여, PDMS 장치 잘라내어 실리콘 마스터 웨이퍼에서 껍질. 1.5 m m 생 검 펀치를 사용 하 여 시드 및 치료 후미, 메인 채널에 루트 성장을 촉진 하는 45 ° 각도로 씨앗 입구 펀치를 만들.
    4. 지우기 접착 테이프를 사용 하 여 PDMS 장치에서 파편을 제거 하 고 유리 coverslip에 아래로 장치 디자인 측면을 놓습니다. 오토 클레이 브 조립된 장치.

2. 장치 설치

  1. 애기 thaliana 씨앗 준비
    1. 표면 30% 시중 표 백제 살 균 물으로 4 시간 7 분 세척 씨앗에 대 한 드 이온된 물과 0.1% 트리톤 X 세제에 희석의 솔루션 microfuge 관에서 A. thaliana 씨앗 소독.
    2. 하룻밤 또는 4 ° c.에 주일 microfuge 관을 냉동 하 여 씨앗을 충
  2. 장치 준비
    1. Degassing 챔버 가스에서 공기를 제거 하는 진공 상태에서 멸 균된 장치를 배치 침투성 PDMS 및 유체 채널 작성의 용이성을 개선 하기 위해.
    2. 진공 약 실에서 장치를 제거 하 고 즉시 pH 5.7에서 액체 ¼ 강도 식물 기반의 미디어 가득 페 트리 접시에 장치를 잠수함.
    3. 피 펫을 사용 하 여 장치를 채우기 위해 후미를 통해 액체를 당겨. 없음 기포 육안 검사 하 여 채널 내에 남아 있는지 확인 합니다.
    4. 새로운 건조 접시 개별 장치 전송. 부 또는 피 펫 뜨거운 agar agar 수준까지 장치 주위는 거의 PDMS 장치 상단으로 플러시입니다. 공고히 agar를 허용 합니다.
      참고: 장치 또는 씨앗을 심기 위해 지금 준비가 필요할 때까지 4 ° C에서 저장 될 수 있다.
  3. 장치에 씨앗 심기
    1. 메 마른 환경에서 작은 피 펫을 사용 하 여 각 장치의 입구에 소독된 한 종자를 전송.
    2. 왁 스로 페 트리 접시 ( 자료 표참조) 영화와 명암 자전거 성장 챔버 또는 실내 온도에 창턱에 커버. 동양 페 트리 접시를 장치 수직 중력 채널을 통해 성장 하는 뿌리를 격려 할 것 이다.

3입니다. 치료

  1. 실험적 치료
    1. 종묘의 개발에서 원하는 시간에 피 펫을 통해 8 측면 포트의 각 치료의 소정의 금액을 추가 하 여 실험 치료는 경종을 추가 합니다.
    2. 페 트리 접시를 다시 봉인 하 고 성장 챔버 또는 창턱을 반환 합니다.
    3. 개별 시간 포인트 캡처 또는 시간 경과 영상 시작을 원하는 시간에 샘플을 이미지와 함께 진행 합니다.

4. 광학 이미징

  1. 낮은 해상도 (4-20 X) 이미징
    1. 장치 및 더 낮은 해상도 (4-20 X) 밝은 분야 또는 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미징 거꾸로 밝은 분야 현미경 종묘를 포함 하는 전체 페 트리 접시를 놓습니다. 노출 시간, 램프 밝기, 조리개, 그리고 빛의 극성을 조정 하 여 관심의 형태학 상 특징을 명료 하 게 조명 조건 최적화. 루트 또는 관심의 root hair(s)에는 루트와의 원하는 영역에 무대를 드라이브.
    2. 한 번 포인트 또는 시간 일련의 이미지를 취득. 루트 머리카락의 성장을 시각화, 분 당 한 번 성장 루트 머리카락을 이미지. 주요 루트의 성장을 시각화, 취득 한 이미지 마다 30 분 반환 페 트리 접시와 성장 챔버에 수직 위치에 창턱 묘 이미징 완료 되.
  2. 높은 해상도 (20-63 X) 이미징
    1. 일단 원하는 시간에 대 한 묘 종 성장, 집게를 사용 하 여는 agar에서 coverslip 및 장치를 제거 하. 사용 하는 에탄올 젖는 실험실 조직 coverslip의 바닥 떨어져 청소.
    2. 현미경 렌즈 제조 업체에 의해 제안 목표를 권장된 침수 미디어를 적용. coverslip 아래로 현미경 스테이지에 놓고 목표에 집중 미디어를 연결할 무대를 마련 합니다. 노출 시간, 램프 밝기, 조리개, 그리고 빛의 극성을 조정 하 여 조명 조건을 최적화 합니다. 관심의 root hair(s)에는 원하는 지역와 무대를 드라이브.
      참고: DIC는 세포질 스트리밍, 시각화 하 고 형광 마커 세포 기관이 움직임을 시각화 하는 데 필요한.
    3. 계량 시간이 지남에 루트 머리 성장, 당 분 한 이미지를 취득 합니다. 세포 기관이 움직임을 시각화 하는 세포에서 식별 형광 신호를 유지 하면서 형광 노출 시간을 최소화 합니다. 빨리 노출 시간 수는 세포의 이미지를 취득 합니다. 더 이상 시간 경과 영상에 대 한 라이브 셀 이미징 단계 인큐베이터를 사용 하 여 주위 온도 습기를 유지 하기 위해.
      참고: 63 X 오일 목표는 이미징 루트 머리 세포에 대 한 것이 좋습니다.

5. 비-광학 영상

  1. 장치 준비
    1. 일단 원하는 시간, 묘 종 성장
페 트리 접시에서 장치와 coverslip를 제거 합니다.
  • 거꾸로 장치를 설정 하 고 부드럽게 벗 겨는 coverslip 루트 PDMS 채널 범위 내에서 유지 되도록.
  • 기판으로 PDMS 장치를 사용 하 여 높은 분해능 원자 힘 또는 스캐닝 전자 현미경 검사 법에서 루트를 진행 합니다.
  • 스캐닝 전자 현미경 검사 법
    1. 얇은 예금 (~ 20 nm) 루트 및 PDMS 듀얼 총 전자 빔 증발 챔버를 사용 하 여 주변에 크롬의 계층.
    2. 스캐닝 전자 현미경 챔버 루트 및 PDMS 장치 전송.
      참고: 특정된 응용 프로그램에 대 한 원하는 해상도 달성 하기 위해 최적화 해야 합니다 이미징 조건, 즉, 전압, 현재 및 작업 거리.
  • 원자 힘 현미경 (AFM)
    1. AFM 견본 홀더에 PDMS 장치 루트 쪽을 탑재 합니다. 카메라에 대비 증가 하 더 쉽게는 PDMS에서 루트를 구분 (예: 운 모 금에서 코팅) 평면 반사 기판 위에 PDMS 장치를 AFM 견본 홀더에 장치를 장착 하기 전에 놓습니다.
    2. PDMS 장치 위에 액체 잘 첨부 파일 보안 및 뿌리 이미징 동안 수산화 유지에 물을 채우십시오.
    3. AFM에 견본 홀더를 로드 합니다. PDMS 장치의 두께 대 한 z 제어를 조정 하 고 지도 대 한 카메라를 사용 하 여 루트에 관심 영역을 캔틸레버를 드라이브.
    4. 캔틸레버의 팁과 레이저를 맞춥니다. 최상의 결과 얻으려면 연락처 모드 영상과, 0.01 0.03 N/m의 스프링 상수와 캔틸레버를 사용 하 여 검색 하는 동안 루트에 최소한의 힘을 발휘 하.
    5. 검색 메커니즘을 천천히 낮은 캔틸레버까지 그냥 접촉 하 게 샘플. 원하는 지역에 대 한 스캔 크기를 조정 하 고 줄 당 256 전압 점 1 선/s의 스캔 속도 선택 합니다. 스캔을 취득.

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    결과

    여기에 설명 된 2 층 PDMS 미세 장치는 주 애기 루트와 옆으로 성장 루트 머리카락 (그림 1A)를 제한 하려면 20 µ m 높은 상공 200 µ m 높은 채널. 이 디자인 비슷한 루트 직경을 가진 종의 식물 애기 thaliana 로 사용 될 수 있습니다. 및 다른 크기. 의 종에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 디자인 통합 공장 입구 뿐만 아니라 원하는 화학 또는 생물 학적 치료에 대 한 8 쪽 후미. 미디어 장치를 prefilling 및 장치 주위 agar 쏟아져 루트 환경 외부 유체 장비에 대 한 필요 없이 실험 하는 동안 수 화 된 유지 합니다. (그림 1B) 천 또한 주요 채널 아래로 루트 성장을 촉진 하 수직으로 자란 묘 수 페 트리 접시 내 장치를 안정화. 페 트리 접시 gnotobiotic 환경에 포...

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    토론

    식물-칩 플랫폼을 만들기 위한이 문서에서 설명 하는 메서드는 독특한 2 층 디자인 경계 단일 영상 평면과 플랫폼 루트 머리카락 deconstructed 수 있으며 높은 해상도 비 광학 이미징 기판으로 사용 . 고해상도 비 광학 이미징 사용 하 여 광학 이미징 혼자에서 얻어질 수 있는 식물 조직에 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, AFM 이미지 힘 측정 개발 중 이나 특정 화학 또는 생물 학적 치료 후 루트 조직의 탄력성 계산을 제공할 수 있습니다. 마찬가지로, SEM 이미지 루트 조직의 표면 지형의 고해상도 정보를 제공할 수 있습니다 그리고, 화학 영상과 결합 조직의 원소 구성에 정보를 제공할 수 있습니다. 19 이 미세 플랫폼의 미래 세대는 호환성 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분광학 (MALDI MS) 등 일관 된 반 스톡 스 라만 다른 화학 이미징 시스템을 위한 최적화를 포함 됩니다. 분광학 (자동차)입니다.

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    공개 사항

    저자는 공개 없다.

    감사의 글

    이 원고 UT-Battelle, 계약 번호 아래 LLC에 의해 작성 되었습니다. 드-AC05-00OR22725 미국 에너지 부와 함께. 미국 정부를 유지 하 고 게시자, 게시를 위해 문서를 수락 하 여 인정 미국 정부는 비-, 유료-, 돌이킬 수 없는 세계적인 라이센스를 게시 또는 게시 된 형태의 재현 유지 이 원고 또는 다른 미국 정부 목적을 위해, 이렇게. 에너지의 DOE 공용 액세스 계획 (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan)에 따라 연방 후원된 연구의 이러한 결과에 대 한 공개 액세스를 제공 합니다.

    이 작품은 게놈 과학 프로그램, 미국 에너지 부, 과학, 생물학 및 환경 연구, 식물 미생물 인터페이스 과학적인 초점 영역 (http://pmi.ornl.gov)의 일환으로 일부 지원 했다. 미세 플랫폼의 제조 실행 되었다 센터 Nanofabrication 연구소에 대 한 Nanophase 물자는 과학, 과학 사용자 시설의 암컷 사무실. JAA는 NSF 대학원 연구 친교 당선-1452154에 의해 지원 됩니다.

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    실리콘 웨이퍼WRS 재료100mm 직경, 500-550um 두께, 프라임, 10-20 저항률, N/Phos< 100>
    Quintel Contact AlignerNeutronix Quintel CorpNXQ 7500 마스크 Aligner
    형광 현미경NikonEclipse Ti-U
    실험실 조직Kimberly ClarkKimwipe KIMTECH SCIENCE 브랜드, 34155
    네거티브 포토레지스트 에폭시MicrochemSU-8 2000s 시리즈
    포토레지스트 현상액MicrochemSu-8 개발자
    트리클로로 (1H, 1H, 2H, 2H- 퍼 플루오로 옥틸) 실란시그마 알드리치화학 후드에 사용
    공기 플라즈마 클리너해릭 플라즈마
    PDMS다우 코닝실가드 184 실리콘 엘라스토머 기반
    PDMS 경화제다우 코닝실가드 184 실리콘 엘라스토머 경화제
    DessicatorBel-ArtF42010-000
    메스X-acto 나이프
    생검 펀치Ted Pella15110-15
    접착 테이프스테이플보이지 않는 테이프
    마이크로 퓨지 튜브Eppendorf
    Triton XJ.T.Baker XI98-07
    표백제클로록스농축
    식물 기반 매체Phyto Technology LaboratoriesM524
    AgarTeknovaA7777
    왁스 필름파라 필름
    현미경OlympusIX51
    원자력 현미경Keysight Technologies5500 PicoPlus AFM
    페트리 접시VWR
    주사 전자 현미경JEOL7400
    이중 총 전자빔 증발기Thermionics맞춤형 이중 전자총 증발 시스템

    참고문헌

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    19. Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40(2013).

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