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방법 논문

저항 동맥의 세포 문화 모델

7.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55992

⸱

2017년 9월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

이 논문에서

요약

저항 동맥의 세포 문화 모델, 신호 경로 내 피, 평활 근, 또는 피와 부드러운 근육 (myoendothelial 교차점) 사이 해 부에 대 한 수 있도록 설명 되어 있습니다. 이 셀 문화 모델을 사용 하 여 면역 형광 검사, 전자 현미경, 또는 단백질 격리, 촉진제의 선택적 응용 프로그램을 활용할 수 있습니다.

초록

Myoendothelial 접합 (MEJ), 작은 직경 저항 동맥에 독특한 신호 microdomain 특정 단백질과 혈관 음색 및 혈압을 제어할 수 있는 신호 프로세스의 지역화를 전시 한다. 그것에서 프로젝션 내 피 또는 부드러운 근육 세포와 그것의 작은 때문에 MEJ (평균에, ~ 1 µ m2의 영역), 크기 격리에서 공부 하기 어렵습니다. 그러나, 우리는 MEJ 대형 생체 외에서 내 피 세포의 양극 화, 그리고 신호 단백질 및 프로세스의 저항 혈관 벽에의 해 부에 대 한 있도록 혈관 세포 공동 문화 (VCCC) 라는 세포 문화 모델 개발 동맥입니다. VCCC 다양 한 응용 프로그램 있으며 서로 다른 세포 유형에 맞게 적용할 수 있습니다. 0.4 µ m 모 공에는 생체 외에서 MEJs를 형성할 수 있습니다와 필터의 반대 측에 2 개의 세포 유형 모델에 의하여 이루어져 있다. 여기 우리가 설명 셀의 도금 및 절연의 내 피, 통해 VCCC 만드는 방법을 MEJ, 및 단백질 격리 또는 활동에 사용할 수 있습니다 부드러운 근육 분수 분석 실험. 포함 된, 그리고 immunofluorescent 분석 sectioned에 그대로 셀 레이어 필터를 해결할 수 있습니다. 중요 한 것은,이 모델에서 발견의 많은 생리 적인 관련성을 강조 하는 그대로 저항 동맥을 사용 하 여 확인 되었습니다.

서론

작은 직경 저항 동맥, 얇은 내부 탄력 있는 lamina (IEL) 내 피 (EC)와 평활 근 세포 (SMC)를 분리합니다. 셀이 탄성 매트릭스에 구멍을 통해 프로젝트 하 고 갭 정션 채널1,2를 통해 직접 세포질 연결을 만들 수 있습니다. 이 독특한 구조는 myoendothelial 접합 (MEJ) 이라고 불린다. MEJ 작은 (약 0.5 µ m 혈관 침대에 따라 0.5 µ m x), 셀룰러 투영 하지만 내 피 세포의 주로 구성3,4뿐만 아니라 부드러운 근육에서 발생 한 수 있습니다. 수 사관의 수 신호 그것은 피와 부드러운 근육5 사이의 양방향 신호 촉진을 위한 특히 중요 한 위치를 렌더링 MEJ에 선택적으로 발생 하는 네트워크의 엄청난 복잡성을 증명 하고있다 ,6,,78,,910.

그러나,는 MEJ에 신호 통로의 기계 해 부 그대로 동맥에서 어렵습니다. MEJ 셀룰러 프로젝션 때문에 그것 불가능 현재는 비보에 MEJ 혈관 벽에서 분리 합니다. 이러한 이유로 VCCC 모델1 개발 되었다. VCCC 생리 내 피 형태11 와 양극 화는 꼭대기 사이 신호를 복제 하는 중요 한 것은, 셀12MEJ 부분. 그것을 발견 알파 헤모글로빈에에서 있는 내 피 세포는 MEJ에 편광이 독특한 모델 이었습니다. 이것은 알파 헤모글로빈13를 표현 하지 않는 전통적으로 교양된 내 피 세포와 달리 이다. Microvascular 내 피에 관심이 연구원에 대 한 더 작은 직경 저항 동맥에서 발생 하는 신호 경로 해 부 하는 것입니다 의도 하는 경우에 특히 VCCC에서 경작 된 내 피 세포를 사용 하 여 적절 한 수 있습니다.

공동 문화 2 가지 종류를 튼튼한 플라스틱 삽입을 포함 하는 직경이 작은 숨 구멍 (직경에서 0.4 µ m)와 필터를 사용 하 여 계층 간의 마이그레이션에서 세포를 방지 합니다. 그것은 크게 비보, 보다 긴 하지만 여전히 많은 MEJs, 단백질 지 방화, 두 번째 메신저1 신호 등의 비보에 특성의 복제 세포 사이의 10 µ m 거리에서 결과 , 14. 또한는 VCCC 셀 주 작동 근 또는 특정 세포 구획에 적의 추가 통해 신호 유형 특정의 대상에 대 한 수. 예를 들어 BAPTA-킬레이트 칼슘, 오전으로 EC를 로드 하 고 phenylephrine14SMC를 자극. 이 제공 하는 공동 문화 모델15,,1617,18,19,20,21의 다른 설명, 달리 지침에 mRNA와 단백질, 필터 모 공 내의 별개 MEJ 분수를 포함 하 여 독특한 분수를 분리. VCCC에이 기술 추가 mRNA 현지화 또는 전사22,23, 단백질의 인 산화12,및 단백질 활동12변화의 특정 조사 수 있습니다. 이 기사 다른 conformations11,,1824두 세포 유형 문화 수도 있지만 아래에 필터와 SMC EC의 도금 설명 합니다.

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프로토콜

1. 도금 셀은 VCCC

  1. 문화 큰 225 cm 2 플라스 크 EC 및 SMC의 70-90% 합칠 때까지 37 ° C에서 살 균 조건 하에서. SMC 보다 더 많은 EC는 사용; 기본 인간 EC 및 SMC, SMC의 1 큰 플라스 크를 EC의 일반적으로 3 큰 플라스 크를 사용 하 여 경우.
    1. 낮은 구절에서 1 차 셀을 사용 하 고 통로 10 과거 사용 하지 마십시오. 문화 미디어 기반 공동 경작 될 셀을 선택 하십시오. 기본 인간 관상 동맥 EC, EGM2 MV 성장 요인으로 EBM-2 EC 기저 미디어를 사용 합니다. 기본 인간 관상 SMC, SmGM-2 성장 요소와 SmBM SMC 기저 미디어를 사용 합니다. 배양된 세포와 함께 사용, 이전을 미디어 성장 요인 추가.
  2. VCCC 주 1의 건설: 살 균 제 (예, Cavicide)와 큰 (150 m m) 접시와 뚜껑을 스프레이 종이 타월 또는 보풀 물티슈로 닦아. 그런 다음 70% 에탄올 (EtOH) 페 트리 접시를 살포 하 고 건조 공기를 후드에 배치.
  3. 무 균 조건 하에서 필터 삽입 (재료의 표 참조)의 접시 열고 코트 fibronectin 솔루션 삽입의 SMC 측면 (필터의 밑바닥 측). 확인 하단의 필터의 절반은 (더 이상 1 mL)을 적용 하 고, 접시의 바닥에 슬릿 피펫으로 측면을 통해 fibronectin 솔루션 제공된 6 잘 플레이트에 삽입을 유지,.
  4. 실내 온도 셀 문화 후드에 fibronectin 솔루션 치료 후 30 분 접시에서 삽입, 진공 모든 초과 솔루션 및 반전, 깨끗 한 페 트리 접시의 절반을 하단에 배치. 따로 설정 합니다. 초과 솔루션; suctioning 때 필터 삽입 멤브레인을 방해 하지 않도록 주의 하십시오 이 부드럽게 접시, 기울이기 및 삽입의 가장자리에서 솔루션을 진공 청소기로 청소 하 여 방지할 수 있습니다.
  5. Trypsinize 225 cm 2 플라스 크의 SMC 미리 데워 2 X 트립 신-EDTA 솔루션, 그리고 일단 세포가 접시를 낸 3 mL와 함께 9 mL SMC 미디어 트립 신 (3:1, 미디어: trypsin) 중화를 추가 합니다. 원뿔 튜브에 전송, 잘, 그리고 핸드폰 번호를 확인 하려면 hemocytometer에 피펫으로 10 µ L.
    1. 수 5 x 5 셀의 수 상자 (즉, 18), 1 ml (180000) 셀의 수를 10, 000을 곱하면이 됩니다. 다음 12 mL (총 볼륨 세포 현 탁 액, 2.16 백만 SMC의)를 곱하십시오. 충분 한 SMC 접시 우물의 원하는 번호를 확인 하십시오.
      참고: 예를 들어 1 잘 75000 SMC 있고 따라서 18 우물 1.35 백만 총 SMC 했. 1.35 백만 세포 1 mL 당 180000 셀에 필요한 분할 하 고 도금 하는 데 필요한 세포 현 탁 액의 7.5 mL에이 결과. 다음 계산 필요 마지막 볼륨 (18 우물 x 750 µ L = 13.5 mL). 따라서, 세포 현 탁 액의 7.5 mL, 볼륨을가지고 미리 따뜻하게 SMC 미디어와 잘 혼합 최대 13.5 mL.
  6. 약 75000 SMC 각 필터의 아래쪽 면에 미디어와 셀 솔루션의 유출 하지 않도록 주의 되 고 포함 된 셀 서 스 펜 션의 플레이트 750 µ L. 뚜껑 위에 놓고 신중 하 게 삽입 된 페 트리 접시에 전송 37 ° C에서 인큐베이터 하룻밤.
    참고: 다른 셀 형식에 대 한 최적의 셀 밀도 경험적으로 결정 해야 합니다.
  7. 하루에 2, 채워 깨끗 한 6 잘 요리 신선한, 미리 데워 진 SMC 미디어의 2 mL. 인큐베이터에서 플레이트를 제거 합니다. 삽입 한 번에 하나를와 미디어 흡입, 다음 SMC 미디어 6-잘 접시에 놓습니다.
  8. 37에서 적어도 30 분 동안 0.5% 소 젤라틴 해결책의 1 mL로 필터 (EC 측)의 반대편 코트 ° c.
  9. 미리 데워 2의 3 mL와 EC의 225 cm 2 flask(s) trypsinize X 트립 신-EDTA (10 x 메 마른 Dulbecco에 희석 ' s PBS) 솔루션, 접시에서 셀 리프트 위해 플라스 크의 부드러운 도청.
    참고: 그것은 다시 1-3 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 플라스 크를 필요할 수 있습니다.
      한 번
    1. 셀 접시를 낸는 9 mL EC 미디어 트립 신 (3:1) 중화를 추가 합니다. 원뿔 튜브, 수영장을 함께 전송, 잘, 그리고 핸드폰 번호를 확인 하려면 hemocytometer에 피펫으로 10 µ L를 혼합.
      1. 수 5 x 5 셀의 수 상자 (즉, 60), 1 ml (600000) 셀의 수를 10, 000을 곱하면이 됩니다. 다음 12 mL (총 볼륨 세포 현 탁 액, 7.2 백만 EC의)를 곱하십시오. 충분 한 EC 격판덮개 우물의 원하는 번호를 확인 하십시오.
        참고: 약 360000 EC는 잘 당 필요. 예를 들어 18 우물 6.48 백만 적 필요 1 mL 당 600000 EC에 필요한 6.48 백만 셀 분할 하 고 도금 하는 데 필요한 세포 현 탁 액의 10.8 mL에이 결과. 다음 계산 필요 마지막 볼륨 (18 우물 1 mL = 18 mL x). 따라서, 세포 현 탁 액의 10.8 mL, 최대 볼륨을가지고 18 mL와 함께 미리 EC 미디어를 예 열 하 고 부드럽게 resuspend.
  10. 각 삽입 필터의 상단 측면에 360000 EC의 1 mL 접시. 셀 4 일에 24 h. 대체 매체에 대 한 37 ° C에서 그대로 품 어 보자. 5 당일 수확.

2. 분수는 VCCC에서 수확

  1. 4 ° C 방에 격리를 수행 하 고 얼음에 모든 악기를 유지
  2. 마음에 고립 되 고 개별 삽입의 수를 유지 하 고 (격리 된 필터)에 대 한 MEJ 분류 50 mL 튜브에 세포의 용 해 버퍼를 추가. 다음 레이블 두 10mm 요리; EC 및 SMC.
  3. 조정 어떻게 집중은 lysate 해야; 15에 대 한 삽입에 따라 세포의 용 해 버퍼의 볼륨, MEJ 튜브에 대 한 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L 및 페 트리 접시 당 250 µ L 좋습니다.
  4. 작업 삽입 한 번에의 한 6 잘 플레이트. 셀 문화 후드 그리고 얼음에 차가운 방에 전송 매체에서 흡입
    참고: 다음 지침은 1 삽입 격리에 대 한 것입니다.
  5. 삽입의 SMC 측에 1 x PBS의 피펫으로 10 µ L.
  6. 셀 삽입의 한쪽 끝을 아래로 밀고 셀 기중 장치를 사용 하 고 그것에 세포의 용 해 버퍼는 SMC 페 트리 접시에 기중에서 셀 전송
  7. 일단 셀 기중 기는 접시에 세포의 용 해 버퍼만 진 되었습니다 때까지 그것은 완전히 닦아 종이 타 올에 건조 삽입 필터를 터치를 허용 하지 않습니다. 반복 하는 근 근이 SMC 필터의 적어도 1을 2 번 나머지 SMC 세포 파편을 완전히 제거 하.
  8. 삽입 필터의 위/EC 쪽에 삽입 하 고 피펫으로 10 µ L 1 x PBS의 켜십시오. 셀 스 크레이 퍼와 EC 페 트리 접시 2.6 및 2.7 단계를 반복 합니다.
  9. 세포의 용 해 버퍼와 EC 페 트리 접시에 피 펫 및 전송 필터의 EC 측에서 나머지 셀 및 PBS 슬러리를 수집합니다. MEJ 분수에 두고 최소한의 EC/SMC 오염으로 필터의 양쪽 모두에서 세포를 근 근이 살아가고에 아주 철저 하 게.
  10. 에서는 신중 하 게 메스를 사용 하 여 플라스틱 삽입에서 필터를 잘라. 플라스틱에서 그것의 절단 70-80%에 의해이 작업을 수행 하 고 집게 플라스틱 삽입 구조에서 완전히 필터를 사용 하 여. 세포의 용 해 버퍼, MEJ 표시 50 mL 원뿔 튜브에 필터를 넣고 세포의 용 해 버퍼에 앉아서 젖은 남아 보장.
  11. 삽입의 모든 처리 될 때까지 6, 그룹의 격리 단계 반복.
  12. 다른 치료 그룹 별도 튜브와 요리에 보관 됩니다 확인 하십시오.
  13. 소용돌이 15 전체 강도에 50 mL MEJ 원뿔 튜브 s 또는 잘 혼합 때까지. 집게, 튜브에서 단백질 및 액체의 최대 금액을 떠나로 튜브의 측면 벽을 따라 끌어와 원뿔 MEJ에서 필터를 제거 합니다. 이 시점 후 필터 삭제.
  14. 모든 필터 MEJ 원뿔 튜브에서 제거 되었습니다 일단 할 한 튜브의 하단에 모든 액체와 단백질을 뽑아 원심 분리기에 빠른 스핀 (최대 속도 ~ 16000 x g에서 10-15 s). 별도, 더 작은 원심 분리기 튜브로 MEJ 튜브와 EC 및 SMC 페 트리 접시의 내용을 전송.
  15. 옵션: MEJ/SMC/EC 튜브의 내용을 Sonicate에 얼음에 4 세 10의 펄스에 대 한 설정 또는 손으로 부드럽게 균질.
  16. 4 시 15 분 최대 속도 (~ 16000 x g)에서 원심 ° C. 피펫으로 상쾌한 고 시험의 bicinchoninic 분석 결과 메서드를 사용 하 여 단백질 함량에 대 한 lysate.

3. En 얼굴 면역 형광에 있는 VCCC 수확

  1. 에 하루 5의 VCCC 인큐베이션, 인큐베이터에서 삽입을 제거. 각 삽입 필터와 린스 1 x PBS와 두 번의 낮은 우물의 SMC 미디어에서 흡입 세포 문화 후드에서 working. EC 측을 가진 반복.
  2. 부드러운 통에 있는 도보 4 ° C 룸에 10-20 분 동안 4 %paraformaldehyde (PFA) 추가 및 접시에 그대로 삽입을 유지. 5 분에 대 한 1 x PBS와 삽입 필터의 양쪽 모두를 세척 하 고 두 번 반복.
    주의: PFA 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다.
  3. 접시는 항 체에는 필터의 양쪽 모두를 유지 + 차단 솔루션 차단, 1 차 및 이차 항 체 외피를 수행 (9 mL PBS, 25 µ L 트리톤 X100, 50 mg 소 혈 청 알 부 민, 500 µ L 정상 혈 청)
  4. 메스와 플라스틱 삽입에서 필터를 잘라 슬라이드에 필터를 탑재 하는 핸들에 장착 매체와 현미경 슬라이드에 탑재.

4. VCCC 가로 면역 형광 검사에 대 한 수확

  1. 에 하루 5의 VCCC 인큐베이션, 인큐베이터에서 삽입을 제거. 셀 문화 후드에 삽입 필터의 양쪽에서 미디어에서 흡입 하 고 두 번 1 x PBS와 필터의 각 측면을 린스.
  2. 그대로 삽입 유지 6 잘 플레이트에 추가 4 %PFA 부드러운 통에 있는 도보 4 ° C 룸에서 밤새 품 어.
    주의: PFA 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다.

5. VCCC 가로 면역 형광 검사에 대 한 포함

  1. 필터 후 삽입 약 4%에 24 h에 대 한 해결 되었습니다 PFA, 전송 70 %EtOH 적어도 24 시간, 하지만 몇 주까지.
  2. 긴 자동된 조직 프로세서에서 실행 (하룻밤)에 필터를 처리 합니다. 다음과 같이 프로그램을 사용 하 여: 70% EtOH 30 분, 85% EtOH 30 분, 95% EtOH 30 분, 100% EtOH 30 분, 100% EtOH 45 분, 100% EtOH 45 분, 크 실 렌 30 분, 크 실 렌 30 분, 크 실 렌 45 분, 60 ° C 파라핀 30 분, 60 ° C 파라핀 30 분 60 ° C 파라핀 45 분
  3. 액체 파라핀, 카세트에는 필터를 유지로 전송 수확된 필터 포함 역으로 처리 후.
  4. 는 가장자리에 그냥 잡고 집게를 사용 하 여 신중 하 게 카세트에서 필터를 제거 합니다. 가 위, 반, 필터를 잘라 반쪽 모양의 두 세미 원형 형성. 그냥 오래 포함 채우기 위해 충분히 액체 파라핀과 금형 포함 역의 차가운 접시 부분에 2 반쪽의 각 위치.
  5. 한번 액체 파라핀으로 가득 찬 격판덮개를 포함 형 터치 매우 간략하게 다음 필터의 각 반 형 (측면 줄이려고)를 포함에 포함; 그러면는, 단면 중 하나 절단 됩니다 가장자리 쪽으로 필터의 중심에서 .
  6. 포함, 하는 동안를 사용 하 여 집게는 파라핀 혼자 서 서 그들을 위해 충분히 차갑게 될 때까지 서로 떨어지는 반쪽을 방지 하기 위해에서 필터를 잡아. 완전히 경화 될 때까지 차가운 접시 포함 형 이동.
    참고: 얼음 쟁반에 블록을 냉각 주름된 섹션을 방지 하는 데 도움이 됩니다.

6. 단면화 및 가로 면역 형광 검사에 대 한는 VCCC 얼룩

  1. 파라핀 블록에 대 한 단면 및 장착 슬라이드: 5 µ m 섹션 잘라내기, 42 ° C 물 욕조에 섹션을 배치 및 충전 된를 사용 하 여 섹션을 선택 슬라이드입니다. 다음 슬라이드를 건조 42 ° C 오븐에 하룻밤 유지.
  2. 재 단계를 시작 하기 전에 빵을 60 ° C에 파라핀을 녹기에서 슬라이드와 슬라이드에 VCCC 섹션을 준수 하는 데 도움이. 짧게, 냉각 후 크 실 렌, 100%의 두 가지 변화를 통해 슬라이드를 rehydrate EtOH, 95 %EtOH, 70%의 한 변화 EtOH, 2의 그리고 변화 증류수.
  3. Microwaving 또는 난방 섹션 수 있습니다 슬라이드에서가로 포함 하는 항 원 검색 방법을 방지.
  4. 수행 세척 단계 및 이차 항 체 1 시간 실 온에서 다음 4 ° C에서 1 차적인 항 체를 가진 다음 하룻밤 외피, 실내 온도에 1 시간에 대 한 표준 차단. 설치 미디어와 coverslip 탑재.

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결과

필터 삽입 사용 VCCC는 있다 작은, 0.4 µ m 구멍. 그림 1A, VCCC 필터 삽입의 en 얼굴 보기는 MEJ 생체 외에서형성할 수 있다 숨 구멍을 보여줍니다. 회로도 1 일 내 피 세포는 반대 측 (그림 1B)에 도금 하기 전에 필터의 더 낮은 측에 도금 하는 평활 근 세포를 묘사 한다. 일단 세포는 도금 EC, MEJ, 및 SMC 분수 3 일 후에 격리 될 수 있습니다. 이 예제는 그림 2A, 플라스 미노 겐 활성 제 억제 물 1 (파이-1) 또한 MEJs25 vivo에서 에서 볼 수 있는 EC의 나머지 부분에 상대적으로 MEJ 분수 표현 매우에 표시 됩니다. 이러한 데이터에 그대로 arteriolar 혈관 벽...

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토론

VCCC는 다양 한 MEJs에서 생체 외에서업과 측면에서 이점 하지만 토론의 경우는 VCCC 특정 응용 프로그램에 대 한 이용 될 수 있다 결정할 때. 예를 들어 다른 세포 유형이이 모델 사용할 수 있다면, 그것은 최적화가 필요 합니다. 우리는 기본 인간 세포 사용 하지만 소 aortas24또는 wildtype 또는 녹아웃 쥐에서 세포를 분리 하 여 사용 VCCC1,5,14에서.

VCCC MEJ 격리를 사용 하는 경우 마스터에 가장 중요 한 기술은 MEJ 분수의 순도 초과 내 피 또는 부드러운 근육 세포에 의해 변경 되지 않도록 하는 필터의 철저 한 스크 이다. 우리 나타났습니다 부 럽을 통해 알파 헤모글로빈은 "순수한" MEJ 격리

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 국가 심 혼에 의해 지원 되었다, 폐 및 혈액 학회 R01088554, T32HL007284 및 미국 심 혼 협회 predoctoral 친목 14PRE20420024 부여 합니다. 우리는 특히 세인트 주드 세포 이미징 공유 연구 핵심, 랜달 웨이크필드와 전자 현미경 이미지에 대 한 린다 Horner, 아담 스트로브를 통해 대표적인 면역 형광 이미지, 및 그녀에 대 한 Pooneh Bagher를 포함 하 여 감사 합니다. 원고 프로토콜에 귀중 한 피드백입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
24mm 직경, 0.4 &마이크로; m Transwell 폴리에스테 막 여과기 삽입Corning3450
구멍 판덮개 (여과기 삽입 없이)입니다Corning3506
1 차적인 인간적인 관상 동맥 내피 세포LonzaCC-2585
1 차적인 인간적인 관상 동맥 평활근 세포LonzaCC-2583
EBM-2 EC 기초 배지LonzaCC-3156
EC 성장 인자 (EGM2 MV 단일 인용)LonzaCC-4147사용 전 기초 배지에 추가
SmBM SMC 기초 배지LonzaCC-3181
SMC 성장 인자 (SmGM-2 SingleQuot)LonzaCC-4149사용 전 기초 배지에 추가
0.5% Trypsin-EDTA 10XGibco15400-054멸균 dPBS 혈구계로 2X로 희석
VWR15170-208
SMC 도금용 대형 페트리 접시(150mm)Corning353025
소 젤라틴SigmaG-9382
인간 피브로넥틴Corning3560085µ 피브로넥틴 g/ml 및 -20에 보관
10x Hanks' Buffered Salt solution (HBSS)Gibco14065-056멸균수로 1x로 희석
10x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(dPBS)Gibco14200-075멸균수로 1x로 희석
손잡이가 있는 일회용 곡선형 메스(30mm 절삭날)AmazonMDS15210
ForcepsFisher17-467-201
셀 리프터코닝3008
셀 스크레이퍼BD 팔콘353085
50 mL 원뿔형 튜브코닝352070
10 mm 페트리 접시팔콘35-1008
Rneasy 미니 키트Qiagen74104
RNA 용해 시약Qiagen79306
파라포름알데히드Sigma158127로 4% 용액 만들기
Fisher04-355-305
Cavicide 소독제Fisher131000
RIPA 단백질 용해 완충액SigmaR0278
Sonic dismembranatorFisherModel 50
EC/SMC 및 수확용 1x PBS 면역세포화학Gibco10010023멸균
Name>Company<strong>카탈로그 번호Comments
Embedding/Sectioning/Staining
ParaffinFisherP31-500
자동 조직 처리기ExcelsiorES
임베딩 스테이션 + 냉각판LeicaHistoCore Arcadia
Tissue Tek Accu-Edge Microtome bladeVWR25608-961 또는 25608-964
현미경 슬라이드Thermo Fisher22-230-900
CoverslipsThermo Fisher12-548-5E
Prolong Gold mounting mediumThermo FisherP36931
NameCompany카탈로그 번호Comments
Other Solutions**live cells
멸균 dPBS멸균 할 수있는 오토 클레이브 물. 멸균수를 사용하여 DPBS (450mL 멸균수: 50mL 10X DPBS)를 만들고, 혼합 및 여과하여 살균합니다 (0.2µ m filter).
최종 농도: 살균할 1X
멸균 HBSS오토클레이브 물. 멸균수를 사용하여 HBSS (450mL 멸균수 : 50mL 10X HBSS)를 만들고 혼합 및 여과 살균 (0.2 µ m filter).
최종 농도: 1X
피브로넥틴 원료 용액50mL의 멸균수를 피브로넥틴에 사용하여 1mL 분취액을 만든 다음 필요할 때까지 동결
최종 농도: 100µ g/mL
피브로넥틴을 사용하여 VCCC분취액 1개를 해동하고 1mL의 피브로넥틴(100µ g/mL)를 1X HBSS의 19mL로 변환하여 5µ의 최종 농도에 도달합니다. g/mL.
최종 농도: 5µ g/mL
2x 트립신 EDTA 용액10X 0.5% 트립신-EDTA를 1X dPBS(40mL DPBS: 10mL 10X 트립신)로 2X로 희석합니다.
최종 농도: 2X
차단/항체 용액(9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg 소 혈청 알부민, 500mL 일반 혈청
EC VCCC를 코팅하는 소 젤라틴소 젤라틴 0.5g을 증류수 100mL에 섞습니다. 처음 사용하기 전에 오토클레이브하고 실온에서 보관하십시오. 멸균 상태로 유지하십시오.
최종 농도:
1x PBS는 멸균될 필요가 없습니다.
이것은 삽입 225 cm 플라스크 Corning 431082 6개의 구멍 판의 1개의 6개의 dPBS 70% 에탄올: 는 의 SMC 측을 코팅하고 )세포 수확을 위한 0.50%

참고문헌

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