골격 근육 섬유 타입의 최신의 판별자로 떠오르고 있다 Immunohistochemical myosin 무거운 체인 isoforms의 얼룩 (즉, 유형 I, 유형 IIA, IIX 입력, IIB를 입력). 여기, 우리는 섬유 유형 및 섬유 형태학의 급속 한 평가 용이 하 게 하는 소설 반 자동화 알고리즘 함께 얼룩 프로토콜을 제시.
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이 논문에서
요약
초록
수년간, 골격 근육 섬유 유형 사이 구분 했다 myosin ATPase 얼룩에 의해 최고의 시각 됩니다. 더 최근에, myosin 무거운 체인 (MyHC) isoforms의 immunohistochemical 얼룩이 섬유 타입의 미세한 판별자로 떠오르고 있다. 유형 I, IIA, IIX 입력 입력 하 고 유형 IIB 섬유는 정밀 프로필 기반으로 MyHC; 지금 확인 될 수 있다 그러나, 이러한 데이터의 수동 분석 느리고 다운 오른쪽 수 지루한. 이와 관련, 섬유 형 구성과 형태학의 신속, 정확한 평가 매우 바람직한 도구입니다. 여기, 우리는 최신의 immunohistochemical 마우스 hindlimb 근육 섬유 유형 및 섬유 형태 분석 가속 소설 반자동된 알고리즘으로 콘서트에서에서 얻은 냉동된 섹션에 MyHCs의 얼룩에 대 한 프로토콜을 제시. 표시 soleus 근육 유형 I에 얼룩이 지 고 입력 IIA 섬유, 예상 대로, 하지만 형식 IIX 또는 유형 IIB 섬유. 다른 한편으로, 앞쪽에 tibialis 근육 유형 IIX 및 유형 IIB 섬유, 유형 IIA 섬유의 작은 일부분의 주로 구성 되었고 거의 또는 전혀 유형 I 섬유. 여러 이미지 변환 섬유 형태 (즉, 횡단면 지역 (CSA), 최대 및 최소 Feret 직경)의 다양 한 측면을 측정 하기 위해 확률 지도 생성 하기 위해 사용 되었다. 이러한 매개 변수 값이 수동으로 얻은 다음 비교 했다에 대 한 얻은 값입니다. 체코, 최대 또는 최소 Feret 직경에 관하여 분석의 두 모드 사이의 중요 한 차이가 관찰 되었다 (모든 p > 0.05), 우리의 방법의 정확도 나타내는. 따라서, 우리의 immunostaining 분석 프로토콜 노화와 myopathy의 많은 모델에서 근육 구성에 대 한 효과의 조사에 적용할 수 있습니다.
서론
그것은 골격 근육 많은 종류1의 단일 섬유의 구성 된 시간에 대 한 알려져 있다. 처음, 섬유의 2 개 그룹 그들의 수축 성의 속성에 따라 특징 이었다 하 고, 적절 하 게, 느린-트 위치 (유형 I) 및 빠른 트 위치 (유형 II). 이러한 범주 추가 섬유 물질 대사에 바탕으로 구별 했다. 이후 유형 I 섬유는 미토 콘 드리 아에서 풍부 하 고 산화 물질 대사에 의존, 그들은 견고 하 게 긍정적인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드-tetrazolium 환 원 효소 (NADH-TR) diaphorase2 또는 호박 효소 (SDH)3 에 의해 해명 되었다 얼룩. 대조적으로, 유형 II 섬유 전시 덜 NADH TR diaphorase 또는 SDH의 가변도 얼룩이 지 고 두 빠른 트 위치 하위 그룹으로 분할 되었다 (유형 IIA 및 IIB 입력) 그들의 상대적인 산화 용량에 따라 다소 조잡. 섬유 사이의 이러한 구분 myosin ATPase 얼룩에 의해 보다 효과적으로 시각화 되어 있다 어디 유형 I 섬유는 pH 4.0에서 사전 부 화 후 어두운 얼룩 및 유형 IIB 섬유 흡수 유형 IIA 섬유와 pH 10.0에서 촉진 다음 사전 부 화 4얼룩 판매인.
더 최근에, myosin 무거운 체인 (MyHC) isoforms의 immunohistochemical 얼룩이 섬유 유형5의 미세한 판별자로 떠오르고 있다. 유형 I, IIA를 입력 하 고 유형 IIB 섬유 확인 될 수 있다 모두 그들의 MyHC 프로 파일에 따라 정밀. 또한, 또 다른 빠른 트 위치-중급 metabolically 섬유 종류, IIX, 입력 되었습니다 확인된6. 하나 이상의 MyHC을 표현 하는 하이브리드 섬유도 확인된5,,78있다. 고양이 개 코 원숭이 등 일부 종 표현 유형 IIB MyHCs6하지 알려져 있습니다. MyHC immunostaining는 현재 근육 구성의-의 상태--예술 평가,이 기술을 통해 얻은 데이터의 분석은 복잡 하 고 자동화 된 도움 없이 소모. 이 위해 이러한 데이터를 분석 하는 반자동된 방법의 개발된5,,910되었습니다. 여기, 우리 소설 반자동된 함께 근육 섬유 타입5,,78,10, 의 immunohistochemical 식별에 대 한 상대적으로 표준 프로토콜 제시 섬유 유형 및 섬유 형태학의 분석 정확도와 가속 알고리즘입니다.
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프로토콜
쥐와 관련 된 모든 절차는 콜로라도의 대학-Anschutz 의료 캠퍼스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 (91813(05)1D).
1. 주 1: 기본 (1 °)와 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 차단 Immunostaining
마우스 hindlimb 근육 (예를 들어, 앞쪽에 tibialis, soleus)의- Air-dry 냉동된 섹션에 대 한 청구 슬라이드에 장착 ~ 30 분 11. 소수 성 장벽을 PAP 펜을 사용 하 여 섹션 주위에 테두리를 그립니다.
- 장소 ~ 5 %BSA / 인산 염 버퍼 식 염 수 (BSA/PBS) 일반적인 항 체 바인딩 차단 하 각 슬라이드의 250 µ L. 1 헤에 대 한 실 온에서 슬라이드를 품 어
- 차단, 하는 동안 준비 1시 50분의 5%에서 표면에 뜨는 1 ° 항 체 희석 BSA/PBS (모든 마우스 단일 클론 항 체는; 표 1 6 , 12 참조); 250 µ L의 준비 슬라이드 당 솔루션입니다. 얼음에 1 ° 항 체 주식 및 희석 유지
표 1: MyHCs를 구별 하는 데 사용 하는 기본 항 체.
- 5 %BSA / PBS 차단 솔루션의 열망에 따라 적절 한 슬라이드에 1 ° 항 체 희석의 250 µ L을 추가. 추가 250 µ L 5 %BSA / PBS 보조 (2 °) 항 체 전용 부정적인 제어 슬라이드.
- 품 습 한 환경에서 24-48 h 4 ° C에서.
참고: 페 트리 접시 약화 필터 종이와 알루미늄 호 일에 커버 수 있습니다 역할을 적합 한 보육 실.
2. 주 2: 2 ° 형광 항 체와 Immunostaining
- 1 ° 항 체 솔루션을 발음 하거나 5 %BSA / PBS 솔루션 제어. 워시 모든 슬라이드 3 번, 5 %BSA 10 분.
- 세척, 동안 준비 1: 200의 5%에서 정화, fluorophore 활용 2 ° 항 체 희석 BSA/PBS (표 2 참조 하십시오 모두 염소 반대로 마우스). 슬라이드 당 솔루션의 250 µ L를 준비 합니다. 얼음에 어둠 속에서 2 ° fluorophore 활용 된 항 체를 유지
표 2: Fluorophore 활용 된 이차 항 체 MyHCs 하는의 시각화 기본 항 체 인식 하는 데 사용.
- 5 %BSA / PBS 차단 솔루션의 세 번째 응용 프로그램의 포부, 다음 모든 슬라이드에 2 ° 항 체 희석의 250 µ L을 추가. 어두운, 습 한 환경에서 실 온에서 90 분 동안 품 어.
- Aspirate 2 ° 항 체 솔루션입니다. 세척 모든 슬라이드 3 번, 10 분 5 %BSA / PBS.
- 린스 PBS입니다. 10 분 동안 건조
- 비 영구, 저 점도 수성 장착 매체 coverglass 탑재.
- 건조 하면, 매니큐어와 슬라이드 가장자리 물개. 건조 하 고 어두운 slidebox에 저장.
3. Epifluorescence 현미경 검사 법으로 슬라이드 이미징
- 는 작은, 70% 에탄올 배어 연구소-삭제 기능으로 슬라이드를 청소.
- 사진 장치 (재료의 표 참조)를 갖춘 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 immunostained 근육 섹션의 디지털 이미지를 얻기.
- 약 1 m m 2 (10 X 목표, 1.4 나)의 영역을 선택 합니다.
- 보기는 505 통해 2 ° 알 렉 사 488 활용 된 항 체 형광 nm 긴 통과 필터. 595 nm 긴-패스 필터를 통해 2 ° 알 렉 사 594 활용 된 항 체의 흥분에 의해 생성 된 형광 볼. 호환 하는 이미징 소프트웨어를 갖춘 PC 컴퓨터와 이미지를 디지털화 합니다. 나중에 분석 소프트웨어 이미징에서 눈금 막대 포함.
4. 피지와 이미지의 분석
참고: 분석을 계속 하기 전에 https://imagej.net/Fiji/Downloads를 통해 피지 (는 건강의 국가 학회, 베 데스 다, 메릴랜드에서 자유롭게 사용 가능)를 설치 해야 합니다. 또한,이 과정에서 사용 하는 매크로 추가 파일에 제공 됩니다. 매크로 파일을 쉽게 액세스할 수 있는 디렉터리에 배치.
피지에서 선택한 섹션의- 부하는 명시 이미지. 플러그인으로 이동 → 세분화 → Trainable Weka 세분화.
- 섹션의 세포질 영역을 규정 하기 위해 라인에는 섬유, 그리고 클릭 " 클래스 1에 추가 ". 그런 다음, 섬유, 사이 공간에 선을 그릴을 클릭 " 클래스 2에 추가 " 세포 외 도메인을 표시. 각 클래스에 있는 5-10 레이블이 될 때까지 반복 합니다.
- 클릭 기차 분류자입니다. 결과 빨간색과 초록색 오버레이에 추가 더 많은 레이블을 수동으로 (단계 4.2 참조) 이미지, 필요한 경우의 잘못 된 조각. 섬유 (레드) 섬유 (녹색) 사이의 공간에서 적절 하 게 분리 될 때까지 반복.
- 클릭 " 얻을 확률 " 새로 레이블이 지정 된 폴더에 이미지를 저장 하 고.
- 같은 필드에서 가져온 형광 이미지 (4.2-4.3 단계) 위의 절차를 반복 합니다. 으로 immunostained 섬유 라벨 " 클래스 1 "로 모든 비 형광 지역 " 클래스 2 ". 결과 확률 지도 처리 명시 이미지 저장 된 동일한 폴더에 저장.
- 피지에서 이전에 저장 된 확률 지도 중 하나를 엽니다. 이미징 소프트웨어에 의해 제공 눈금 막대에 직선을 그립니다. 이동 분석 → 규모 설정. 눈금 막대에 의해 주어진 그들의 적절 한 값을 매개 변수 (즉, 알려진된 거리, 길이 단위)를 변경 후 확인은 " 글로벌 " 표준화 각 이미지에 대 한 규모를 상자.
- 탐색 플러그인을 → 매크로 → 실행 → Tyagi 외. 섬유 부 량 macro.ijm (보조 파일 참조). 즉시, 탐색 창에 표시 됩니다. 이미지를 열고 ' s 호스트 폴더; 대화 상자가 표시 됩니다. 각 대화 상자에 대 한 변경 된 " 배경 " 드롭다운 값을 " 빛. "
참고: 폴더 이제 채워집니다 섬유 윤곽선의 이미지와 스프레드시트 소프트웨어 파일 (체코와 Feret 직경은 가장 관련 된 결과의 측정 섬유 형태; 측정 된 매개 변수를 조정할 수 있습니다 설정 측정 분석). 스프레드시트 소프트웨어 파일에 대 한 두 형광 및 밝은 분야 이미지 피지의 기 공 분석 기능에 의해 생성 하는 섬유 형태 데이터를 자동으로 옮겨질 것 이다. - 계산 하는 필드에 지정 된 MyHC 필드에 해당 필드 밝은 이미지에 총 섬유의 수에 의해 형광 섬유의 수를 분할 하 여 표현 하는 섬유의 분수.
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결과
알 수 없는 나이의 남성 C57BL/6 마우스 해 부 Hindlimb 근육 (즉, 앞쪽에 tibialis, soleus) 액체 질소 냉각 isopentane 화합물 10 월에는 근육을 포함 하는 플라스틱 금형을 침 몰 하 여 냉동 플래시 했다. 그런 다음는 cryotome를 사용 하 여, 8-10 µ m 직렬 섹션-20 ° C에서 잘라 되었고 다른 긍정적으로 위탁 유리 슬라이드12전송.
이 근육은 주로 빠른-및 느린-섬유 트 위치, 각각13,14로 구성 하기 때문에 우리는 앞쪽에 tibialis와 soleus 선택. 개별 유형 I, IIA, IIX 및 IIB MyHCs, 얼룩 immunohistoche...
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토론
여기, 우리 골격 근육 섬유 종류의 식별에 유용한 방향 제공. 이렇게, 우리는 데이터의 분석을 위한 새로운 알고리즘을 설명 합니다.
때문에 우리의 결과 크게 이전 보고서5,,810 의 확인 하 고 우리 자신의 수동 측정을 반영, 알고리즘은 정확 하 게 나타납니다. 아직도, 우리는 유물 단면에서 결과 불분명 섬유 테두리를 포함 하 여 몇 가지 드문 실험 함정이 발생. 주의 단면화 및 분석 이전에 처리 된 부분의 경계 검사를 통해이 이미지 들의 영향을 최소화할 수 있습니다. 특히, 선명한 대비를 달성 하기 위해 같은 이미지에 재분류의 여러 라운드를 통해 보다 최적의 이미지 세분화를 피할 수 있습니다.
우리의 프로토콜에서 가장 중요 한 단계는 우리 규정 섹션의 세포와 e...
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공개 사항
저자는 공개를 전혀 상반 되는 관심사를 있다.
감사의 글
우리는이 연구의 그들의 지원을 위해 Boettcher 재단과 루 경화 증 협회 (#17-II-344)에 감사.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 소 혈청 알부민 | 시그마 Aldrich | A9418-100G | 5% PBS |
| 소수성 장벽 Pap 펜 | 과학 장치 실험실 | 9804-02 | |
| 현미경 슬라이드 | 글로브 사이언티픽 | 1358W | |
| 커버글래스 | 피셔 사이언티픽 | 12-544-E | |
| 면역마운트 | Thermo Scientific | 9990402 | |
| 매니큐어 | L'Oreal | ||
| , Nikon Eclipse, TE-200 반전 형광 및 명시야 현미경 | 단종 | ||
| SPOT, RT/KE | SPOT 이미징 솔루션 | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8, 1차 항체 | 발달 연구, 아이오와 대학의 하이브리도마 은행, | 단클론 마우스 IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 일차 항체 | 발달 연구 아이오와 | 은행 단클론 마우스 IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 1차 항체 | 발달 연구 아이오와 | 단클론 마우스 IgGM; 1:50 | |
| 6H1 일차 항체 | 발달 연구 아이오와 | 은행 단클론 마우스 IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | 염소 안티 마우스;1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | 염소 안티 마우스; 1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | 염소 안티 마우스; 1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| 이소펜탄 | Fisher Scientific | O3551-4 | 냉각 liguid 질소 |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, 1x |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
참고문헌
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