화살 비행기에서 운동학 걸음 걸이 분석 운동 실행 하는 방법에 대 한 매우 정확한 정보를 생성 합니다. 우리는 중재 면역 demyelination 대상이 쥐에 대 한 걸음 걸이 적자를 식별 하기 위해 이러한 기술의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 방법은 다른 마우스 모델을 갖춘 장애인된 운동에 대 한 걸음 걸이 적자 하 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
MOG35-55를 받게 하는 C57BL/6 쥐에 화살 평면 운동학 걸음 걸이 분석 실험적인 자기 면역 뇌 유발
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
화살 비행기에서 운동학 걸음 걸이 분석 여러 경화 증 (MS)에서 모터 적자 하 자주 사용 되었습니다. 우리는 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE)로 알려진 MS의 마우스 모델에서 걸음 걸이 적자를 식별 하기 위해 이러한 기술의 응용 프로그램을 설명 합니다. EAE를 받게 하는 쥐에 있는 마비 및 모터 적자는 일반적으로 임상 점수 규모를 사용 하 여 평가 됩니다. 그러나,이 규모는 모터 적자의 정확한 본질에 대 한 약간의 정보를 제공 하 서 수 데이터를 생성 합니다. EAE 질병 심각도 rotarod 성능, 일반 모터 조정의 측정을 제공 하 여 평가 했다. 대조적으로, 화살 비행기에서 뒷 다리의 운동학 걸음 걸이 분석 방법 움직임은 장애인에 대 한 매우 정확한 정보를 생성 합니다. 이 절차를 수행 하려면 반사 마커 마우스는 디딜 방 아에 걷는 동안 공동 움직임을 감지 하는 후방 다리에 배치 됩니다. 동작 분석 소프트웨어는 산책 하는 동안 마커의 움직임을 측정 하는 데 사용 됩니다. 운동학 걸음 걸이 매개 변수는 다음 결과 데이터에서 파생 됩니다. 우리는 어떻게 이러한 걸음 걸이 매개 EAE의 엉덩이, 무릎, 그리고 발목 관절의 장애인된 운동 척도를 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 이러한 기술은 질병 메커니즘을 이해 하 고 MS와 기동성 손상 다른 신경 퇴행 성 질환에 대 한 잠재적인 치료 식별을 사용할 수 있습니다.
서론
걸음 걸이 운동을 달성 하는 데 사용 하는 팔 다리의 반복적인 움직임의 시리즈 이다. 걸음 걸이 두 단계로 분할 되는 단계 사이클 구성: 발 이동 거꾸로 바닥에 시체 전달; 추진 때 자세 단계 그리고 발 지상과 이동 전달 꺼져 스윙 단계. 걸음 걸이의 소요는 척수 상해 (SCI), 다 발성 경화 증 (MS), 루 경화 증 (ALS), 파 킨 슨 병 (PD), 및 뇌졸중; 등 많은 신경 퇴행 성 질환의 특징 기능 이러한 장애의 임상 설치류 모델은 종종 그들의 각각 걸음 걸이 장애1정리. 쥐에 있는 운동의 기본 제어 메커니즘 집중적으로 공부2,3되었습니다. 또한, 많은 인간의 신경 장애4의 마우스 모델 있다. 마우스에 걸음 걸이 분석 따라서 해 부 관계가 알려진 모터 적자의 여러 측면을 측정 하는 매력적인 접근 이다. 마우스 모델에서 걸음 걸이의 연구는 운동 신경 장애, 적자의 neuropathological 기지에 대 한 통찰력을 제공 하 고 잠재적인 치료의 식별을 가능 하 게 수 있습니다.
설치류에서 걸음 걸이 측정 하는 데 사용 된 몇 가지 기술이 포함 (예를 들어, 바소 마우스 규모5 및 오픈 필드 테스트6) 육안 검사 및 복 부 비행기7에서 보 행의 분석. 더 최근에, 화살 평면 운동학 hindlimb 움직임을 측정 하는 방법 때문에 그들은 이동의 실행에 대 한 자세한 정보를 제공 하 고 따라서 걸음 걸이8, 에 있는 미묘한 변화에 더 민감합니다 인기 얻고 있다 9 , 10 , 11. 디딜 방 아9,12 에 걷고 있는 동안 화살 비행기에서 hindlimb 운동 연구 개발 기구학 기술을 광범위 하 게 과학, ALS, 외상 성 대뇌 피 질의 부상, 뇌졸중의 맥락에서 연구 하 고 헌팅턴 병8,9,10,11,13,14,,1516. 반면, 이러한 기술을 다 발성 경화 증17의 마우스 모델에 대 한 운전 적자의 연구에서 제한 된 사용을 보았다.
실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) MS18의 가장 일반적으로 사용 되 마우스 모델 이다. EAE 유도의 두 가지 주요 방법을 통해 활성 또는 수동 접종 이다. 활성 EAE 마우스와 수 초 항, 일으키는 autoreactive T 세포 중재 neuroinflammation demyelination 척수와 소 뇌에 접종 됩니다. 다른 한편으로, 수동 EAE 순진한 마우스19autoreactive T 세포 활성 EAE 가진 쥐에서 전송 하 여 유도 된다. 중앙 신경 조직 (CNS) 항 원에 의해 질병 과정 및 neuropathology 영향을 다른 곳에서 설명 된 대로 및 마우스 스트레인20,,2122,23,24 ,25. EAE 실험, 통제 쥐 수 초 항 원 없이 완전 한 Freund의 보조 (CFA)와 주입 됩니다. EAE 오름차순 마비 꼬리 약점으로 시작 하는 앞 발을 포함 잠재적으로 수 여 증 및 마비20인 특징 이다. 우리는 최근 myelin oligodendrocyte 당단백질 35-55 (MOG35-55)를 받게 하는 C57Bl/6 마우스의 걸음 걸이 변화를 특징-EAE를 유도. 이러한 연구 걸음 걸이 분석을 정상적인 발목 운동에서 편차는 매우 EAE 쥐26의 요 추 척수의 백 질 손실의 정도 연관 때문에 클래식 행동 분석 보다 우수한 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 백색 질 손실 및 2 개의 다른 전통적인 행동 조치 (임상 점수 및 rotarod) 간의 상관 관계의 강도 훨씬 약한26했다.
우리 여기 EAE 마우스는 디딜 방 아에 걷는의 화살 평면에서 운동 적자를 검출 하기 위하여 운동학 걸음 걸이 분석의 사용을 설명 합니다. 5 반사 마커 엉덩이, 무릎, 그리고 고속 비디오 녹화에서 발목 관절의 움직임을 식별 하기 위해 hindlimb에 배치 했다. 동작 분석 소프트웨어 공동 여행에 대 한 운동학 적 데이터 추출에 사용 되었다. 이러한 기술 운동 적자 EAE의 MOG35-55 모델에 대 한 계량에 유틸리티는 설명 합니다. 이 기술은 또한 신경 장애의 다른 마우스 모델에서 걸음 걸이 적자의 연구에 적용 됩니다.
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프로토콜
이 프로토콜은 동물 관리 지침에 캐나다 위원회 및 실험실 동물에 Dalhousie 대학 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 반사 마커 생성:
- 반사 종이의 시트에서 작은 원 원하는 수 펀치 휴대용 구멍 펀치를 사용 하 여. 각 동물 필요 5 마커 단일 기록; 큰 2 및 3 개의 작은 마커.
- 원의 중심에는 경계에서 확장 직선 컷을 만들어 좋은 위를 사용 하 여.
- 공개 접착제 표면 마커의 역행 종이 제거 합니다. 미세 집게를 사용 하 여 마커 단단히를 원뿔 모양에 당신의 손가락을 사용 하 여 자체에 그것을 곱슬 곱슬. 작은 마커를 만들기 위해 콘을 단단히 곱슬 곱슬. 큰 마커 있도록 느슨하게 컬 콘.
- 휴대용 풀 총을 사용 하 여, 내부 원뿔 모양의 마커를 접착제로 집게와 콘의 끝을 창과 동안를 골 판지의 평면 부분에 마커를 준수. 접착제는 축소 하 고 빛의 최적의 반사 되도록 기록 하는 동안 절곡에서 마커를 막을 것 이다. 언제 접착제는 건조 (약 10 분), 메스 ( 그림 1A)와 골 판지에서 마커를 제거.
2. 녹음에 대 한 동물을 준비
- Anesthetize isoflurane 가스 (2.5%, 2 리터/분 O 2)를 유도 챔버에 마우스를 배치 하 여 마우스. 일단 마우스를 의식이 없는 코 콘 반복 물 난방 담요 위에 위치에 놓습니다. Anesthetization의 목적은 마커 배치;에 대 한 마우스를 고정 하 절차는 고통 스러운. 따라서, 마 취 깊이 평가 될 필요 하지 않습니다.
- 양쪽 눈에 국 소 눈 윤 활 유를 적용.
- 전기 면도기를 사용 하 여 원하는 hindlimb를 면도. 발목에서 시작 하 고 척추와 갈비뼈;의 하단까지 이 마커 접착에 악영향을 줄 것 이다 아무 모피 왼쪽은 확인.
참고: 여기, 오른쪽 hindlimb 기록 했다; 그러나, 어느 hindlimb를 사용할 수 있습니다. - 영구 마커를 사용 하 여 장 골도 머리와 엉덩이 관절의 위치를 나타냅니다. 장 골도 머리 바로 아래에 있는 갈비뼈의 하단 이며 쉽게 만져 서 마우스 아래 무릎을 함께 가져다 ' s 몸.
참고: 고관절 flexing과 골반과 대 퇴 골 사이 조음 지점을 찾기 위해 다리를 확장 하 여 찾을 수 있습니다. - 미세 집게를 사용 하 여, 작은 표시기의 뾰족한 끝을 잡고와 빠른 연기 접착제 접착제에 기지 또는 동등한 대안을 찍어. 네 번째 손가락의 끝에 마커를 놓고 접착제를 건조 수 있도록 2-3 s에 대 한 장소에서 개최 합니다. 같은 방식으로 ( 그림 1B)에 metatarsophalangeal 관절과 발목에 다른 두 개의 작은 마커 장소.
- 작은 표식으로 같은 방식으로 장 골도 머리와 엉덩이 관절 ( 그림 1B)에 큰 마커를 배치.
- 원뿔에서 마우스를 제거 하 고 즉시 전송 케이지를 사용 하 여 녹음을 전송. 고정 된 디딜 방 아에 마우스를 놓고 마 취에서 완전히 회복 허용.
3. 걸음 걸이 기록
- 이전 마우스 기록에 ' s 걸음 걸이, 디딜 방 아에 알려진 치수 보정 블록의 사진을 받아.
참고:이 비디오를 실제 측정을 변환할 수 있는 픽셀을 허용할 것 이다. 카메라는 디딜 방 아에서 약 120 cm 배치 되어야 한다. - 디딜 방 아와 같은 높이 수준에서 카메라 위치
- . 다음과 같은 보정 이미지 레코딩 위한 동일한 카메라 위치를 유지.
- 마우스는 완전히 마 취에서 회복 하 고, 일단 돌려 걷기 시작 하는 마우스를 낮은 속도 (cm/s)을 디딜 방 아. 마우스에 표식 카메라 쪽으로 직면 하는 디딜 방 아 벨트 방향 인지 확인 하십시오.
- 디딜 방 아의 증가 속도 점차적으로 최대 20 c m/s;이 가장 건강 한 쥐에 있는 일관 된 걸음 걸이 대 한 이상적인 속도.
참고: 모든 쥐 같은 속도로 걷기를 이상적 이더라도, 일부 수 하지 일관이 속도 도달.- 마우스 20 cm/s, 걸을 수 없는 경우 필요에 따라 속도 감소 하 고 반드시이의 메모. 일관 된 단계 사이클 달성 될 때까지 디딜 방 아의 속도 줄일 수.
참고: 나중에 데이터 분석 속도 차이 대 한 조정할 수 있습니다.
- 마우스 20 cm/s, 걸을 수 없는 경우 필요에 따라 속도 감소 하 고 반드시이의 메모. 일관 된 단계 사이클 달성 될 때까지 디딜 방 아의 속도 줄일 수.
- 시작 마우스 꾸준히 걷고 일단 비디오 기록 (즉, 일관 된 속도로 걷고, 양육 하지 또는 측면 직물). 8 ~ 12 연속 단계 사이클 기록 되었습니다 때까지 기록을 계속 합니다. 모든 동영상에 대 한 기록의 디딜 방 아와 마우스의 속도 기록.
- 녹음 완료 되 면 디딜 방 아를 해제 하 고 그것의 감 금 소를 마우스를 반환 합니다. 청소 철저 하 게 기록 사이 디딜 방 아 다른 마우스에 의해 남겨진 향기 들어오는 마우스의 동작을 변경할 수 있습니다. 스트레스 감소 및 피부 손상, 마커;를 제거 하지 마십시오 허용 그들 자신에 그들을 제거 하 쥐.
4. 분석
- 모션 분석 소프트웨어를 사용 하 여 비디오 처리.
참고: 우리의 실험에서 우리가 사용 이미징 및 통계 소프트웨어를 위한 사용자 지정 스크립트 (재료의 표 참조)을 박사 니콜라 Stifani에 의해 작성 되었습니다. 다음 단계는 선택한 동작 분석 소프트웨어를 사용 하 여 수행 됩니다.- 동영상에서 마커의 픽셀 좌표를 추출 하 고 교정 비디오를 사용 하 여 센티미터 픽셀 값을 변환 하 고 각 프레임에서 공동 각도 계산.
- 시작과 끝 단계 시간 길이 대 한 정보를 취득 함으로써 각 단계 사이클의 식별.
- 정상화 단계 사이클 기간 200 정규화 된 프레임에는 스윙과 자세 각각 100 프레임으로 표시 됩니다.
- 정규화 된 프레임을 사용 하 여 계산 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 데이터 분석에 대 한 운동학 적 매개 변수 (자료의 표 참조).
특정 관절의 평균 각도 설정,로 정규화 된 프레임 내의 모든 각도의 평균 걸릴
- :
참고: x 여기에 각도 값을 대표 한 정규화 주어진 프레임, 그리고 n 정규화 된 프레임 수를 나타냅니다. - 주어진된 마우스에 대 한 특정 관절의 운동 범위를 설정 하려면 다음과 같이 정규화 된 프레임의 집합에서 가장 큰 각도에서 가장 작은 각도 빼기:
운동의 범위 각도 최대-최소 각도 =.
참고: 여기 최대 각도 각도 최소는 최고의 그리고 가장 작은 각도 정규화 단계 주기 내에서 각각 달성. - RMS 차이 설정 하려면 먼저 기준 기록에서 각 실험 시간 포인트의 평균 각도 뺍니다. 다음, 각 차이 광장, 모든 제곱 평균 제곱근의 뜻. 방정식은 다음과 같습니다:
참고: 여기
기록; 기준선에서 평균 각도 나타냅니다 y 각 점에서 실험 시간-; 평균 각도를 나타냅니다. n의 정규화 된 프레임 수를 나타냅니다. 루트 제곱된 (RMS) 차이점은 초기 녹음에서 걸음 걸이에 대 한 편차를 평가 하는 데 사용 되는 측정 뜻.
- :
- 과학 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하 고 데이터 (재료의 표 참조).
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결과
그림 1 은 운동학 걸음 걸이 분석을 위해 사용 하는 프로시저의 도식 적인 표현입니다. 첫째, 반사 마커는 만들었고 5 해 부 지점에서 마우스에 배치. 마우스는 디딜 방 아에 걷는 하는 동안에 다음 걸음 걸이 기록 됩니다. 동작 분석 소프트웨어는 이후 분석에 대 한 운동학 적 데이터를 추출 하는 데 사용 됩니다.
그림 2A -C 떨어져 1 주 간격 3 연속 기록 세션에서 기록 된 엉덩이, 무릎, 그리고 발목 관절 각도 대 한 제어 CFA 마우스의 단계 주기를 나타냅니다. 파형 간의 중복 세션 1-3에서에서 단계 사이클에서 최소한의 편차를 보여줍니다. 그림 2D -F 녹음 세션 1-3에서 큰 도보 가변성을 표시 두 번째 컨트롤 CFA 마우스의 단계 주기를 나타냅니...
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토론
EAE 가진 쥐, 모터 적자를 측정의 두 가지 가장 일반적인 방법 임상 점수 이며 rotarod27,28에서 대기 시간을가. 이 기술은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 하지만 편리 하 고 널리 사용 되, 임상 점수 의미는 임상 점수 차이의 크기는 알려져 있지 않습니다만 서 수 수준 데이터를 생성 하 여 제한 됩니다. 임상 점수 또한 모터 적자의 본질에 대 한 정확한 정보를 제공할 수 있는에서 겪고 있다. Rotarod 테스트 임상 득점의 몇 가지 제한에만 일반 모터 조정 측정 향상과 산책의 특정 측면을 측정 하지 않습니다.
비교 함으로써, 운동학 걸음 걸이 분석 운동, 다양 한 관절에서 모션 및 평균 각도의 범위를 포함 하 여의 특정 측면에 대 한 민감한 측정을 제공 합니다. 집 고 양이35-55 EAE 마우스 엉덩이 무릎 관절의 움직임에 미묘한 적자 DP...
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공개 사항
저자 들은 아무것도 공개 선언 합니다.
감사의 글
우리는 촬영 된 그의 기술 지원에 대 한 Sid Chedrawe를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 MS 학회 캐나다 (EGID 2983)에서 자금을 지원 했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 카메라 | 니콘 | 니콘 D750 | 를 촬영하는 데 사용됩니다 |
| . L Engineering | MKR-Tape-2 | ||
| 미세 가위 | 미세 과학 도구 | 15023-10 | |
| 집게 | 정밀 과학 도구 | 11252-20 | |
| 접착제 총 | Craftsmart | E231647 | |
| 메스 핸들 #4 | Roboz | R5-9884 | |
| 메스 블레이드 No.10 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL/6 마우스 | Charles River Laboratories | ||
| 마취기 | EZ 마취 | EZ-AF9000 자동 흐름 시스템 | |
| 재순환 온수 가열 담요 | Androit | HTP-1500 | |
| 국소 눈 윤활제 | 리프레시 | DIN00210889 | |
| 면도기 | Oster | 78997-010 | |
| 고속 카메라 | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| 고출력 조명 | Smith Victor Corporation | 모델 700 SG (600 와트 석영 조명, 120 볼트) | |
| 라이트 스탠드 | Promaster | LS1 | |
| 러닝 머신 | 쾰른 | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | 버전 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | ImageJ | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | ||
| GraphPad, Prism | GraphPad | 버전 6.00 |
참고문헌
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