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방법 논문

고성능 액체 크로마토그래피 분석 및 Synaptosomal 도파민 통풍 관의 사용에 의해 쥐에서 Dopaminergic 항상성의 평가

11.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56093

⸱

2017년 9월 21일

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Neuropharmacology and Genetics Laboratory, Lundbeck Foundation Center for Biomembranes in Nanomedicine, Department of Neuroscience and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Laboratory of Neuropsychiatry, Psychiatric Center Copenhagen and Department of Neuroscience and Pharmacology, University of Copenhagen

이 논문에서

요약

Synaptosomal 도파민 통풍 관 및 고성능 액체 크로마토그래피 분석 대표 실험 도구 마우스에서 도파민 항상성 도파민 운송업 자의 기능과 striatal 조직에서 도파민의 수준을 평가 하 여 조사를 각각. 여기 선물이 도파민 조직 콘텐츠를 측정 하 고 도파민 운송업 자의 기능을 평가 하는 프로토콜.

초록

도파민 (DA) 모터 활동, 보상 프로세스 및 인지 기능 modulatory 신경 전달 물질 이다. (DAergic) dopaminergic neurotransmission의 장애는 파 킨 슨 병, 주의 결핍 과잉 행동 장애, 약물 중독1,2 등 여러 중앙 신경 관련 질병에 강하게 연관 ,,34. 다 불균형과 관련 된 질병 메커니즘을 묘사 동물 모델 모방은 질병의 측면을 비판적으로 의존 이며 따라서 다 항상성의 특정 부분을 평가 하는 프로토콜 소설 통찰력 및 가능한 치료를 제공 하는 것이 중요 이 질병의 대상

여기, 선물이 두 유용한 실험 프로토콜을 결합 하는 때 쥐에 DAergic 시스템의 기능 읽기 제공. 생 화 학적 및 기능 매개 변수 다 항상성에 다 수준 및 도파민 운송업 자 (DAT) 기능5의 평가 통해 얻을 수 있습니다. 다 시스템을 조사할 때 안정적으로 성인 두뇌에서 다의 내 생 레벨을 측정 하는 능력은 필수적입니다. 따라서,에 우리가 현재 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 수행 하는 방법을 뇌 조직 검사의 수준을 결정 하는 마우스에서 우리 지가 (dStr) 및 핵 accumbens (NAc), 조직에는 실험을 수행 하지만 방법은 다른 다 innervated 뇌 영역에 대 한 적합도.

출시 검사의 시간적 및 공간적 활동 제어할 DAT 연 접 맨끝에 다의 재흡수를 위해 근본적 이다 레벨과가에서 DAT의 기능을 알면 다 항상성 평가할 때 주요 중요성의 이다. 여기, 우리는 동시에 표면 수준 및 synaptosomal6 다 이해 분석 결과 사용 하 여 함수에 대 한 정보를 추론할 수 있는 프로토콜을 제공 합니다.

표준 immunoblotting 프로토콜와 결합 하는 현재 메서드 DAergic 시스템 특성 관련 도구와 연구원을 제공 합니다.

서론

도파민 (DA) modulatory 모터 행동, 보상 및 인지 기능1,7,,89에 대 한 중요 한 신경 이다. 다 항상성 불균형 주의-결핍 과잉 행동 장애, 약물 중독, 우울증과 파 킨 슨 병1등 여러 가지 정신병 질병에 연루 된다. 다 연 접 신경에서 시 냅 스 갈라진 틈, 어디 그것에 바인딩하고 사전 및 postsynaptic 막에 수용 체를 활성화에 신호를 전달 하는 그로 인하여 더 발표입니다. 출시 후 시 냅 스에 다의 수준은 공간적으로 일시적으로 제어 DAT3,10. 전송 sequesters 세포 외 공간에서 다 하 고 따라서 생리 다 레벨3,11을 격려. 쥐에 있는 DAT의 유전 제거는 hyperdopaminergic 형 수준에 의해 상승 된 시 냅 스 다, 특징 고갈의 세포내 다 풀 심오한 postsynaptic DAergic10,12신호 발생 합니다.

여기, 두 개의 별도 프로토콜 제시, 측정 다 조직 콘텐츠 및 가브리엘 외.13 에 의해 설명 된 표면 biotinylation 분석 결과 함께 결합 된 DAT.의 기능을 평가 하기 위해 또 다른 한 가지 방법은이 두 가지 방법 다에 정보를 제공 콘텐츠 및 기능 수준 DAT의 다 항상성의 철저 한 평가 대 한. 이러한 방법으로 다양 한 유전자 변형 쥐 또는 질병 모델의 다 항상성 특징 고 설명 될 수 있습니다. 이러한 도구 구현 및 최적화 된 우리의 실험실에서 표준 사용. 현재 분석 실험의 DAT14 의 C-터미널 변경 또는 티로신 hydroxylase (TH) 발기인 5아래 Cre recombinase 표현 다 항상성에 결과 조사 하 봉사 했다.

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프로토콜

덴마크 동물 실험 검사자의 지침 (허가 번호: 2017-15-0201-01160) 그 뒤를 이었다는 로컬 동물 복지의 감독 하에 완전히 AAALAC 공인 시설에서 실험 수행 위원회.

1. synaptosomal 도파민 글귀 (방법 1)

참고:이 프로토콜 두 두뇌의 병렬 평가 하지만에서 4 개의 두뇌를 가진 synaptosomal 다 이해 실험 수행을 성공적으로 사용 될 수 있습니다 병렬.

    • 준비
      1. 라벨 48 1.5 mL 마이크로 원심 튜브 표 1 (각 두뇌에 대 한 24) 당 합니다. 각 두뇌에 속하는 튜브에 대 한 서로 다른 색상을 사용 하 여 샘플 사이 혼란을 방지 하기 위해
      2. 레이블 51 섬광 관 #1-51.
      3. 장소 인산 염 (PBS) 얼음에 버퍼링합니다. 이 두뇌 냉장을 유지 하는 데 사용할 것입니다.
      4. 미리 4 쿨을 원심 분리기에 돌려 ° c.
      5. 미리 해야 정확한 조직 무게 (단원 2.6) synaptosomal 준비 하는 동안 두 개의 마이크로 원심 튜브 무게.
      6. 준비 균질 버퍼 4 mM HEPES 0.32 M 자당을 혼합 하 여. PH 7.4에 조정 하 고 얼음에 계속
        참고: 균질 버퍼-20 ° C에서 aliquots에 보관 하 고 수 해 동 실험의 날.
      7. 준비 글귀 버퍼 다음 결합 하 여: 25mm HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1.2 m m CaCl 2, 1.2 m m MgSO 4, 5mm 1mm 의약품 (0.194 g/L), 5mm D-포도 당 (0.991 g/L). NaOH (약 130 m m의 나트륨 농도에 지도)와 7.4에 pH를 조정 하 고 얼음에 계속
        2 두뇌에 대 한 참고: 1500 mL 글귀 버퍼를 준비 합니다. 의약품 및 포도 당 4 보관 없이 재고 솔루션 x 10으로 통풍 관 버퍼를 준비 의약품 및 포도 당 보충 일에 갓 ° C. 확인 작업 솔루션 x 1. 7.4에 NaOH로 pH를 조정.
      8. 준비 글귀 버퍼 + 다음 결합 하 여 리간드: 25mm HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 5mm 1.2 m m CaC l2, 1.2 m m MgSO 4, 1 mM ascorbic 산 (0.194 g/L), 5 m D-포도 당 (0.991 g/L) m, 1 μ M pargyline, 100 nM 데 10 nM Catechol-오-메 틸-전이 효소 (COMT) 억제제. NaOH로 pH 7.4에 조정 하 고 얼음에 계속
        참고: 50 mL 글귀 버퍼를 사용 하 고 리간드를 추가 합니다. Pargyline 산화 산화 효소 monoamine (마오)를 통해 다의 저하를 방지 하려면 추가 됩니다. COMT 억제제 (RO-41-0960) COMT 통해 다 (일반에서 catecholamines)의 저하를 방지 하기 위해 추가 됩니다. 데 norepinephrine과 세로토닌 운송업 자를 통해 통풍 관을 억제 하 고 그로 인하여 이해 결과 특정 DAT.에 대 한 추가 됩니다
      9. 준비 글귀 버퍼 + ligand 다음 결합 하 여 코카인: 25mm HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1.2 m m CaCl 2, 1.2 m m MgSO 4, 1 mM ascorbic 산 (0.194 g/L), 5mm D-포도 당 (0.991 g/L), 5mm 1 μ M pargyline, 100 nM 데 10 nM COMT 억제제, 500 μ M 코카인. NaOH와 7.4에 pH를 조정 하 고 얼음에 계속
        참고: 7 mL 글귀 버퍼 + 리간드를 사용 하 고 코카인을 추가. 코카인 (이후 SERT 및 NET 위에서 설명한 데로 저해는) DAT 관련 글귀만을 떠나 데이터에서를 일반적인 다 이해의 배경 측정을 얻을에 추가 됩니다. 또는, 매우 강력 하 고 구체적인 DAT 억제제 GBR 12935 대신 사용할 수 있습니다.
        중요: 계속 얼음 이제 .에 있는 모든
    1. Synaptosomal 준비
      1. 경부 전위와 잘린 여 한 번에 하나의 마우스를 희생.
      2. 는 두개골을 공개 하 고 잘린에서 두개골 왼쪽의 어떤 과잉 조직 후부를 잘라가 위를 사용 하 여 피부를 잘라. 두개골 sutura sagittalis 가능한 anteriorly 결말을 따라 작은 직선가 위로 잘라.
      3. 는 마우스의 각 눈에 두가 위 팁 놓고 그대로 뇌와 두개골의 나머지를 제거 하는 두개골을 극복 합니다. 빠르게 두뇌를 제거 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS에. 이 차가운 유지 됩니다, 두 번째 동안 뇌 해 부.
      4. 3mm 코로나 슬라이스는가의 해 부 두뇌 매트릭스를 사용 하 여 (앞쪽 후부: 1.5 m m-1.5 m m)를 주먹으로 미세한 절 개를 이어서. 그림 1 펀치 영역을 참조 하십시오.
      5. 항상 전진에서 얼음에 조직 유지.
      6. 전송 조직 무게에 대 한 1.5 mL 마이크로 원심 튜브.
        참고:이 체중 1.2.14 단계에서 사용 됩니다.
      7. 두 번째 뇌에 대 한 반복 단계 1.2.1-1.2.6.
      8. 모두 두뇌에 대 한 무게를 받은 일단 균질 유리 얼음 균질 버퍼의 1 mL를 포함 하는 조직 전송.
      9. 800 rpm, 10도 타 모터 구동된 방 앗 공이 사용 하 여 조직 균질.
        참고: 1 개의 치기와 액션 위아래로 하나, 첫 번째 스트로크 약 5 해야 s, 다음 isotonic 매체에 3-4 미 균질 synaptosomes 6의 파열을 방지 하는 것이 중요 하다. 적절 한 힘과 isotonic 매체를 사용 하 여 연 접 터미널 reseal 바깥쪽 세포질, 시 냅 스 소포, 미토 콘 드리 아와 골격을 허용할 것 이다 15.
      10. 1.5 mL 마이크로 원심 관에는 homogenate를 전송 하 고 0.5 mL 추가 균질 버퍼와 rinsing 하 여 균질 유리에서 나머지 homogenate를 수집.
      11. 다른 뇌에서 조직 무 균 중 얼음에 샘플을 유지 합니다. 단계 1.2.12-1.2.13에서 병렬로 실행 하는 두 개의 두뇌.
      12. 작은 핵과 원심 (1000 x g, 10 분, 4 ° C)에 의해 파편 세포.
      13. 새 1.5 mL microcentrifuge 관에 상쾌한 (S1) (세포 막과 세포질 포함)을 전송 하 고 4 시 20 분 16000 x g에서 원심 ° c.
      14. 상쾌한 (세포질 포함)을 삭제 하 고 40 μ 균질 버퍼에 펠 릿 (P2) (원유 synaptosomes 포함) resuspend / mg 조직 (단계 1.2.6에서에서 얻은 무게에 따라). 너무 많은 힘은 synaptosomes 휴식 것 이다 p1000 피펫은 원유 synaptosomal 부분을 부드럽게 resuspend.
        참고: 적어도 280 μ와 끝까지 중요 하다. 그렇지 않은 경우에 mg 당 40 μ와 희석 해야 합니다. 단계 1.2.1-1.2.13를 최대한 빨리 수행 해야 하 고 모든 얼음에 보관 하는. 그들은 얼음 6 , , 15 16에 지켜진다로 그들은 상당히 안정적인 원유 synaptosomes 균질 버퍼에 resuspended 되는 대로.

    2. 통풍 관 실험

    1. 추가 440 μ 글귀 버퍼 + ligand, 코카인 지정된 12 1.5 mL microcentrifuge 튜브 및 440 μ 글귀 버퍼 + 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (레이아웃 표 1 참조) 남은 36 ligand.
      참고: 얼음 실험을 시작 하기 전에 15 분에서에서 그들을 제거합니다 실내 온도에 그들을 있지만 때까지 억제제를 보존 하기 위해 얼음에 계속.
    2. 준비 포화 곡선 (도파민 (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H 도파민) (91.1 Ci/mmol) 다양 한 최종 농도 (0.031, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 및 1.0 μ M)에서).
      1. 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62, 0.31로 6 2 mL microcentrifuge 튜브 라벨.
      2. 추가 750 μ 글귀 버퍼 + 낮은 번호 5 microcentrifuge 관에 ligand.
      3. 추가 1,455.4 μ 글귀 버퍼 + ligand, 14.6 μ 도파민 (1 m m), 30 μ 3 H 도파민 (11 μ M) 관에 표시 10.
      4. 전송 750 μ 튜브에서 튜브 5 개에 10 이라는. 잘 혼합 하 고이 튜브에서 2.5 관 750 μ를 전송. 이 희석 나머지 튜브와 함께 반복.
    3. 미리 4 mL 글귀 버퍼와 유리 마이크로 화이버 필터 12 잘 필터 양동이에 그들을 배치 후 린스.
    4. 첫 24 synaptosomal 막 서 스 펜 션의 추가 10 μ 1.5 mL 마이크로 원심 튜브 (레이아웃 표 1을 참조) 포함 440 μ 버퍼 합니다. 소용돌이 주의 synaptosomes 버퍼에 잠긴 되도록 곧 아래로 회전. 37 o C에 대해 10 분에 두고
      참고: 두뇌 사이 공정한 비교에 대 한 이해 실험 기간 동안 시간에 정확 하 게 중요 하다. 스톱 워치를 사용 하 여 정밀도 대 한.
      5. 농도 10, 5 μ M (섹션 2.2) 첫 번째 두 개의 열과 37 o C 떨고와 5 분 동안에 두고 하의
    5. 추가 50 μ 도파민 정확 하 게 5 분 후 1 mL 차가운 글귀 버퍼를 추가 하 여 반응을 중지 합니다. 같은 농도 2.5 및 1.25 μ M (섹션 2.2)와 함께 다음 농도 0.62 및 0.31 μ M.
    6. 미리 씻어 서 마이크로 화이버 필터에 샘플을 추가 하 고 5 x 4 mL 차가운 글귀 버퍼와 세척. 처음 12 샘플 필터에 추가 되었습니다 때 섬광 관에 필터를 이동 합니다. 다음 12 샘플 반복이.
    7. 반복 단계 다음 뇌에 대 한 2.4-2.6.
    8. 섬광 관 49-51의 하단에 마이크로 화이버 필터를 배치 하 고 (10 μ M) 위에 최대 도파민 농도의 25 µ L을 추가 하 여 튜브 준비 3 최대 세.
    9. 1 헤에 대 한 증기 두건에 모든 51 섬광 관 두고
    10. 각 섬광 관을 흔들어 1 헤 대 한 통에 활발 한 추가 3 mL 섬광 액체
    11. 개수 [3 H]-1 분에 대 한 베타 카운터에 다
      1. 프로그램 열고 선택: 레이블: H-3, 접시/필터: 4 mL 유리병, 4, 6, 분석 결과 유형: 정상 및 시간 계산: 1 분
        참고:이 단계 수행할 수 있습니다 다음 날 경우 더 편리. 샘플 밤 깡통 호 일을 덮어 두고.
    12. 단백질 결정
      1. fmol/분/μ g을 수 분 (cpm) 당에서 조정 및 통풍 관의 적절 한 비교를 위해 synaptosomes의 단백질 농도 결정 하는 표준 BCA 단백질 분석 실험 키트를 사용 하 여 샘플 사이.

    3. 데이터 분석

    곡선과 각 그룹에 대 한 반응 (V 최대)와 Michaelis Menten 상수 (K M)의 속도 계산 포화 수 있도록
    1. 글귀에서 데이터를 사용 하 여 실험.
      참고: K M 값 V 최대의 절반에 도달 하는 데 필요한 기질 농도 반영 합니다. 따라서, V 최대 직접 반영 표면에 고 posttranslational 수정 또는 상호 작용 단백질에 의해 뿐만 아니라 그것의 활동을 조절 수 있습니다 어떻게에 DAT의 수에 따라 달라 집니다 DAT (최대 통풍 관 용량)의 기능 이온 기온 변화도에 변경입니다. K M 값은 기판 전송에 대 한 선호도 간접적으로 측정 하는, 중요 한 것은 또한 수 posttranslational 수정 또는 상호 작용 단백질으로 변조. 완전히 기능 변화를 평가 하기 위해 그것은 따라서 직접 예를 들어 표면 biotinylation 분석 결과 의해 표면 식 수준을 결정 하는 것이 중요입니다. 슈 미 츠 외. 17에 의해 검토 되어 도파민 재흡수와 K M V 최대 값의 의미에는 정교의 설명.

    4. 고성능 액체 착 색 인쇄기 (방법 2)

    1. 뇌 해 부
      1. 레이블과 무게 microcentrifuge 튜브; 마우스 당 지역 당 하나.
      2. 경부 전위와 잘린 여 한 번에 하나의 마우스를 희생 합니다. 1.2 항에 설명 된 대로 급속 하 게 두뇌를 제거 합니다. 더 수행 하는 해 부 즉시.
      3. NAc와는 주먹으로 dStr 세밀 하 게 양측 절 개 뒤가 3mm 코로나 조각 해 부 두뇌 매트릭스를 사용 하 여. 펀치 영역에 대 한 그림 3을 참조 하십시오.
      4. 조직 1.5 mL microcentrifuge 관에 전송 하 고 신속 하 게 드라이 아이스에 놓습니다. 무게를 조직 하 고 다시 제자리에 드라이 아이스 즉시.
        참고: 조직 무게 나중에 농도 계산을 위해 중요 하다.
        5. 다음 마우스로
      5. 반복 단계 4.1.1-4.1.4.
        참고: 조직 80 o C에서 처리까지 또는 즉시 조직 처리 진행.

    5. 조직 준비

    1. 사전 4 ° C에 냉각 수 있도록 원심 분리기에
    2. 균질 솔루션 (0.1 N과 염소 산 (HClO 4))을 준비 하 고 얼음에 계속
    3. 사용 균질 솔루션 준비 1 m m 재고 솔루션 (10000 x 희석)에서 신선한 0.1 pmol/μ 도파민 표준.
      참고: 재고 솔루션 균질 버퍼 재고 1 m m, 약 한 달 동안 20 ° C에서 지켜질 수 있는 농도에서 도파민을 용 해 하 여 준비가 되어 있습니다. 두뇌의 다른 지역 관심의 경우, 표준의 농도 prefrontral 피 질을 포함 한 다른 뇌 영역부터 수정 해야 할 것 이다, 해 마, substantia nigra 및 복 부 tegmental 지역 보유가에 비해 최대 100 배 더 적은 다.
    4. 각 샘플 (즉 NAc와 dStr 조직, 섹션 4.1)을 500 μ 균질 솔루션을 추가 하 고 균질 화 하는 동안 약 30 s. 유지에 대 한 최대 속도에 매우 균질 화기를 사용 하 여 샘플 아이스 물에서 샘플을 균질. 각 샘플 사이의 깨끗 한 물으로 울트라 균질 화기 (30 전속력 s).
    5. 14000 x g. 4 ° C에서 30 분에 대 한 샘플을 원심
    6. 이전 약 200 μ 샘플 1 mL 플라스틱 주사기를 사용 하 여 유리 0.22 μ m 필터 (직경 1 ㎝).
      참고: 유리 필터를 사용 하 여 아니다 중요 한, 선택 하는 필터는 높은 분자량 물질을 제거 하는 0.22 μ m으로.
    7. 전기 화학 탐지 (EC)에 의해 샘플을 분석-HPLC 방법 18 섹션 6에에서 설명 된 대로.

    6. 고성능 액체 크로마토그래피 분석

    모바일 단계에 대 한
    1. 준비는 다음과 같은 솔루션: 나트륨 아세테이트 55 m m, octanesulfonic 산 1 m m, Na 2 EDTA 0.1 m m, 이기 8%, 초 산 0.1 m M, pH = 3.2.
      참고: 0.1 m M 초 산으로 pH를 조정 합니다. PH와 정확 하 게 중요 하다. 솔루션 degasse 해야 합니다.d 온라인 degasser (HPLC 시스템의 통합된 부분)에 의해. 모바일 위상의 2 패를 확인 하 고 한 달에 한 번에 대 한 변경 (소음이 눈에 띄게 되 면 변경). 변동으로 인해 모바일 단계를 변경한 후 조정에 약 24 시간 소요.
    2. 검출기의 설치:
      1. 세트 볼트 출력 700 mV와 검출기 오븐에 32 ° c 온도에, 이것은 매우 중요 하다. 온라인 설명서를 사용 하 여 범위 프로그램을 확인 합니다. 더 세부 사항에 대 한 설명서 참조). 표 2에 의하여 시간 프로그램 추가.
        참고:이 연구에 프로그램 자동으로 설정된 보존 시간, 최적의 전류에는 HPLC를 유지 하 고 가능한, 하지만 보기에서 확대는 크로마의 봉우리를 유지 하는 전류를 변경 하려면 설정 됩니다. 이 맞게 최적화 된 쥐에서 striatal 두뇌 lysates.
    3. 프로그램 검출기에 추가 되었습니다 때 3 포인트 보정 곡선, 표준 주입 하 여 3 시간 (5, 10 및 15 μ).
      참고: 표준 (10 μ (0.1 pmol/μ x 10 μ = 1 pmol 다)) 모든 10 샘플, 및 가까운 표준 보정 샘플 주입 한다. 미세 조정 3-포인트 표준은 크로마 예상된 범위 내에서 밖으로 나오는 경우를 확인 하 여 시스템 하루 사전 조정. 상당한 잡음을 관찰 하는 경우 모바일 단계를 변경 합니다. 만약 피크 990 mV 다음 다시 낮은 볼륨에서 샘플을 주사 보다 높은 만들거나 새로운 범위 프로그램 및 새로운 표준 곡선. 검출 한계는 3 번 각 표준에 대 한 주입 낮은 피크 값 mV에 소음 값으로 측정 (나, DOPAC, 다, 5-HIAA HVA, 3-몬태나 및 5-HT).
    4. LC 솔루션을 열고 온라인 모드에서 분석 1;이 시작을 활성화 하 여 설정 시스템
        . 사용자 ID와 암호를 입력 하 고 확인을 클릭 합니다. LC 솔루션 악기에 연결을 기다립니다. 일괄 처리 테이블에 이동 및 데이터 정보를 입력 (예를 들어, 샘플 유형: 표준, 분석 유형에 대 한 샘플 및 성병에 대 한 알 수 없는: 그것은 QT, inj 볼륨: 10, ISTD amt: 수준 1 콘). 파일 저장 (파일-에 서 >로-배치 파일 저장 > 저장).
      1. 확인 눌러 첫 번째 샘플을 주입 하는 시스템 ' 시작 배치 '. 이 용 매 전달 모듈 autosampler에 의해 10 μ 샘플의 주입 귀 착될 것 이다.
        참고: 반전 단계 0.15 mL/min과 C18 열 펌프 유량을 사용 합니다. 여기 전기 화학적 검출에 대 한 amperometric 발견자 사용 되었다. 유리 탄소 전극 Ag/AgCl 기준 전극으로 0.8 V로 설정 한다. 분석 결과 도파민을 크로마토그래피 3 μ를 사용 하 여 ODS (3) C18 (다 2 mm x 100 mm, 입자 크기 3 µ m) 컬럼에 분리를 달성 하기 위해.
      2. 기록 하 고 계산 된 피크 영역을 추출합니다.
      3. 샘플 모두는 크로마를 따라 데이터 수집가
          . Lc 게시물 분석-실행에 서 > (는 크로마 열립니다) 파일 이름-선택 > 보기를 클릭 합니다. 수동 통합 모음에 추가 될 통합-모든 봉우리 > 데이터 보고서로 이동 하 고 밖으로 읽기를 인쇄.
          참고: 여기 LC 솔루션 소프트웨어 데이터 분석 및 시스템 제어를 위한 사용 되었다.
    5. 피크 지역에서 계산 샘플, 도파민의 농도 다음과 같이 표준의 알려진된 농도 사용 하 여:
      1. (= 1 pmol) 표준의 최대 영역을 사용 하 여 요소 대답을 얻으려고
        figure-protocol-1
      2. 요소 A를 사용 하 여 샘플의 농도 얻을 수.
        (10 μ 당 pmol)에서 샘플의 농도 = 샘플의 계수 A × 피크 지역
      3. ng에 샘플 농도 얻으려면이 수식을 사용 합니다.
        샘플 농도 pmol / 10 µ L x 500 µ L 도파민의 MW x ng에 샘플 농도 =
        농도 (ng)에서 샘플 샘플 농도 (10 μ 당 pmol) 500 μ x = MW 도파민의 x
      4. ng에서 샘플 농도 사용 하 여 t를 얻을 그는 샘플 pg/g 조직에 농도 (pg에서 농도 샘플 / 조직 g pg/g 조직 =).

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    결과

    현재 다 글귀 프로토콜 (그림 1) DAT의 쥐에서 synaptosomes의 기능을 평가 하는 데 필요한 모든 단계를 포함 합니다. 다 이해 방법 (그림 2)의 대표적인 데이터 조정 되지 않은 데이터 (그림 2B)와 함께 포화 곡선을 묘사 하 고 데이터 (그림 2A)을 조정. 채도 커브는 야생 타입 마우스에서 통풍 관을 보여줍니다. 일반적으로 하나의 돌연변이 마우스, 각 유전자 형5에 대 한 포화 곡선으로 이어질 것 이라고 비교를 위해 다 이해를 할 수 있습니다. 이 경우, 2A 및 2B에 야생 유형 및 돌연변이 쥐 차이 여러 요인에 의해 설명 수 있습니다. 더 철저 한 프로토콜, 원시 (2B)와 단백질 조정 (2A)...

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    토론

    이 원고는 선택의 어떤 마우스 모델에서 다 항상성 윤곽을 그리 다 유용한 실험 프로토콜을 설명 합니다. DAT. 통해 다 전송 기능을 평가 하기 위해 HPLC 및 synaptosomal 다 이해를 사용 하 여 쥐에서 뇌 조직에서 다의 측정 수준에 대 한 자세한 프로토콜 제공 절차, 프로토콜 및 HPLC 실험 synaptosomal 다 이해 분석 결과 대 한 제한 아래 정교 합니다.

    Synaptosomal 통풍 관 프로토콜 표면 biotinylation 실험13DAT. 결합의 기능에 유용한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 그리고 총 금액, 표면 수준 및 DAT의 기능에 대 한 지식을 얻을 수 있습니다. DAT와 다 전송에 미치는 영향 및 다양 한 질병에의 참여의 중요 한 역할을 감안할 때, 그것은 DAT 기능 모델 수 분석 실험을 설정 하는 주요 목표 되었습니다. Synaptosomal 다 이해 실험의 장점 중 하나는 그것이 수행된 게시물 ...

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    공개 사항

    저자는 공개 없다.

    감사의 글

    이 작품은 UCPH 2016 프로그램의 우수성 (U.G., 아칸소, 대리)에 의해 지원 되었다, Lundbeck 재단 (M.R.) Lundbeck 재단 센터 Biomembranes에서 Nanomedicine (U.G.), 국립 연구소의 건강 보조금 P01 DA 12408 (U.G.), 덴마크 독립적인 연구-의료 과학 (U.G.)를 위한 위원회.

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    COMT 억제제Sigma Aldrich, GermanyRO-41-0960synaptosomal DA 흡수 프로토콜[
    3H]-DopaminePerkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USANET67-3001MCsynaptosomal DA 흡수 프로토콜용
    유리 극세사 필터GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire1822-024synaptosomal DA 흡수 프로토콜
    HiSafe 섬광 유체Perkin Elmer1200-437synaptosomal DA 흡수 프로토콜
    MicroBeta2Perkin Elmersynaptosomal DA 흡수 프로토콜
    BCA 단백질 분석 키트Thermo Scientific Pierce23225synaptosomal DA 흡수 프로토콜
    HEPESSigma Life ScienceH3375synaptosomal DA 흡수 프로토콜
    SucroseSigma Life ScienceS7903시냅토솜 DA 흡수 프로토콜용
    NaClSigma Life ScienceS3014시냅토솜 DA 흡수 프로토콜
    KClSigma Life ScienceP9541시냅토솜 DA 흡수 프로토콜
    CaCl2Merck KGaA10043-52-4시냅토솜 DA 흡수 프로토콜
    MgSO4Sigma Life Science63065시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우
    Ascorbic AcidSigma Life ScienceA0278시냅토솜 DA 흡수 프로토콜
    D-GlucoseSigma Life ScienceG7021시냅토솜 DA 흡수 프로토콜
    PargylineSigma AldrichP-8013시냅토솜 DA 흡수 프로토콜
    DesipramineSigma AldrichD3900시냅토솜 DA 흡수 프로토콜 프로토콜
    도파민시그마 생명 과학H8502synaptosomal DA 흡수 프로토콜
    코카인시그마 생명 과학C5776synaptosomal DA 흡수 프로토콜
    뇌 매트릭스ASI 기기RBM2000Csynaptosomal DA 흡수 프로토콜
    Cafano 기계식 테플론 교란기Buch & Holm단종시냅토솜 DA 흡수 프로토콜 (균질화)
    Antec Decade (암페로메트릭 검출기)Antec, Leiden, The Netherlands단종: 새로운 모델 DECADE Elite / Lite™ 전기 화학 검출기 유형 175 및 176HPLC 프로토콜
    용 Avantec 0.22 μ m 유리 필터Frisenette ApS, 덴마크13CP020ASHPLC 프로토콜
    칼럼 : Prodigy 3 μ ODS-3 C18Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany부품 번호 : 00A-3300-E0HPLC 프로토콜
    용 LC 솔루션 소프트웨어ShimadzuLabSolutions 시리즈 워크 스테이션HPLC 프로토콜
    용 과염소산 0.1MFluka Analytical35418-500mlHPLC 프로토콜 (조직 준비)
    EDTASigmaE5134-50gHPLC 프로토콜 용
    NatriumdihydrogenphospharBie& Berntsen1.06346 1000gHPLC 프로토콜 용
    나트륨 1- 옥탄 설포 네이트 일 수화물Aldrich74885 -10gHPLC 프로토콜
    용 Acetonitrile, 등용매 HPLC 등급ScharlauAC03402500HPLC 프로토콜
    용 Filtre 0.22umFrisenette ApS, 덴마크Avantec 13CP020ASHPLC 프로토콜 (조직 준비)
    ortho-Phosphoric acid 85 %머크1.00563. 1000mlHPLC 프로토콜
    전극Antec, Leiden, 네덜란드AN1161300HPLC 프로토콜 (온라인 설명서 참조)
    DECADE II 전기 화학 검출기Antec, Leiden, 네덜란드Lite&trade의 검출기 프로그램; 전기화학 검출기 유형 175 및 176HPLC 프로토콜용

    참고문헌

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