시알로 글리 칸 마이크로 어레이 분석은 인체 혈청에서 항 -Neu5Gc 항체를 평가하는 데 사용될 수있어 암 및 기타 만성 염증 매개 질환에 대한 잠재적 인 고효율 진단 분석법이됩니다.
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방법 논문
Sialoglycan Microarray Assay를 사용하여 Human Sera에서 Anti-Neu5Gc IgG 프로파일 링
이 논문에서
요약
초록
세포는 일반적으로 암에서 변형되고 시알 산 (Sia) 발현의 변화를 포함하는 탄수화물 사슬 (glycans)의 외투로 덮여 있습니다. 이들은 9 탄소 백본을 가지고 있으며 세포 표면에 척추 동물의 glycan을 캡핑하는 산성 당입니다. 포유 동물의 주요 Sia 형태 중 두 가지는 N- 아세틸 뉴 라민 산 (Neu5Ac)과 N- 히드 록 실화 형태 인 N- 글리콜 노 뉴라민 산 (Neu5Gc)입니다. 인간은 cytidine 5'monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH)를 암호화하는 유전자의 불 활성화 때문에 내인성 Neu5Gc를 생성 할 수 없다. 외래 Neu5Gc는 붉은 육류 및 유제품의식이 섭취를 통해 인간 세포에 의해 획득되고 이후 세포 표면의 다양한 글리 칸에 주로 나타나 암종에 축적됩니다. 결과적으로 인간은 암 및 기타 만성 염증 매개 질환에서 다양한 역할을하는 순환 Neu5Gc 항체를 가지고 있으며 잠재적 인 진단 및 치료제가되고있다rgets. 여기, 우리는 인간 항체에서 이러한 안티 Neu5Gc 항체를 평가하는 높은 처리량 sialoglycan microarray 분석을 설명합니다. Neu5Gc 함유 글리 칸과 각각 일치하는 대조군 쌍 (Neu5Ac 함유 글리 칸)은 각각 핵심 1 차 아민과 함께 에폭시 코팅 유리 슬라이드에 공유 결합되어 있습니다. 우리는 인쇄 당 최대 896 개의 어레이를 생성 할 수있는 특정 나노 프린터를 사용하여 16- 웰 포맷으로 56 개의 슬라이드를 인쇄하는 것을 예시합니다. 각 슬라이드는 안티 Neu5Gc 항체 특이성, 강도 및 다양성의 평가를 위해 16 개의 다른 인간 혈청 샘플을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜은이 견고한 도구의 복잡성을 설명하고 배열 형식으로 다양한 임상 샘플에서 Neu5Gc식이 탄수화물 항원에 대한 반응을 조사하고자하는 사람들을위한 기본 지침을 제공합니다.
서론
Sias는 척추 동물의 세포 표면 당 단백질과 당지질의 글리 칸 쇄를 덮는 산성 당입니다. Sia 발현은 암세포 1 에서 변형되고 진행 및 / 또는 전이와 관련이있다 2 , 3 . 포유 동물의 주요 시아 형태의 두 Neu5Ac 및 수산화 형태, Neu5Gc 2이다. 인간은 CMAH 효소를 암호화하는 유전자의 특정 불활 화 때문에 Neu5Gc를 합성 할 수 없다. 이 비인간적 인 Sia는 Neu5Gc가 풍부한식이 요법 ( 예 : 붉은 고기)에서 유래하여 "자기"로 인간 세포에 대사 적으로 결합합니다 4 , 5 . Neu5Gc는 인간 상피와 내피의 세포 표면에 낮은 수준으로 존재하지만 특히 암종에 축적됩니다. Neu5Gc는 인체 체액 성 면역계에 의해 외국으로 인정됩니다 2 , 6 .Neu5Gc 글리 칸의 항원 복잡성은 모든 인간 6 항 N....
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프로토콜
인체 혈청 샘플은 이스라엘 혈액 은행 (Israeli Blood Bank)에서 얻은 것이며 헬싱키 선언 및 Tel Aviv University Institutional Review Board에 따라 사용되었습니다.
1. 어레이 제조 계획 및 레이아웃
- 슬라이드 레이아웃을 결정하십시오.
참고 : 각 슬라이드에는 B1 ~ B16으로 번호가 매겨진 16 개의 동일한 블록으로 분할 된 16 개의 하위 어레이가 포함됩니다 ( 그림 1B , 보충 그림 1A ). - 핀 배치를 결정하십시오. 슬라이드마다 4 개의 하위 배열 (블록)을 인쇄하는 4 개의 핀을 사용하십시오.
핀 1은 블록 1, 2, 9 및 10을 인쇄하고,
핀 2는 블록 3, 4, 11 및 12를 인쇄합니다.
핀 3은 블록 5, 6, 13 및 14를 인쇄합니다. 과
핀 4는 블록 7, 8, 15 및 16을 인쇄합니다 ( 보충 그림 1A ). - 블록 및 384 웰 플레이트 레이아웃을 결정하십시오.
참고 : 글리 칸이 각 블록에....
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결과
배열 인쇄, 개발 및 분석 :
여러 개의 glycan 시료와 human IgG STD 곡선을 가진 sialoglycan microarray를 16 개 블록으로 인쇄하려면 모든 시료가 슬라이드 당 16 개의 블록과 동일한 인쇄 작업에서 모든 슬라이드에 가능한 한 균일하게 인쇄되도록 철저한 보정이 필요합니다. 따라서 각 시료 유형, 슬라이드 유형 및 제조, 384-well plate type, 습도 수준, 384-well plate의 시료 부피, pre-of-plate의 양에 대한 buffer 조성을 포함하여 특정 인쇄 매개 변수가 결정되기 전에 여러 교정 실험이 필요합니다 모든 샘플 유형, 인간 IgG STD 곡선 농도 및 마커 유형에 대한 인쇄. 인쇄 된 sialoglycan 어레이 슬라이드의 내구성은 실온에서 어두운 곳에서 진공 밀봉 된 상자에서 최대 10 개월 .......
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토론
성공적인 glycan microarray 제작에는 신중한 계획이 필요하며 프로토콜에 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 여기에는 (1) 모든 후속 매개 변수 ( 예 : 거리, 간격, 샘플 양 및 인쇄)를 정의하는 블록 및 플레이트 레이아웃 계획. (2) 핀을 클리닝하고 핀의 완전성을 보장하는 것, 이는 스팟 동질성을 제어하는 데 중요합니다. (3) 인쇄 중 습도를 높게 유지하며, 장시간 인쇄시 샘플 증발을 피하는 것이 중요하며, 이는 얼룩 동질성을 손상시킬 수 있습니다. (4) 결과에 영향을 줄 수있는 적절한 정렬 및 분석 매개 변수 ( 예 : 배경 빼기 방법, 임계 값 및 스폿 크기 유연성)를 선택합니다.
이 방법은 특정 실험 설계 및 목표를 충족시키기 위해 추가로 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 예비 스포팅 번호는 어레이에 인쇄 할 각 유형의 재료에 더 잘 맞도록 수정할 수 있습니다. 핀 세척 단계인쇄물을 다른 인쇄물에 맞게 최적화 할.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 부분적으로 Israel Cancer Research Fund의 Research Career Development Award, Israeli National Nanotechnology Initiative의 보조금 및 Personalized Theranostics (VP-K)의 Nanomedicines에 대한 Focal Technology Area의 Helmsley 자선 신탁 및 National 보건 당국 R01GM076360 (XC에).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 차 아민 함유 sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | 화합물 요청 문의 info@glycohubusa.com 인쇄 | 된 글리칸 |
| 인산 Monosodium phosphate monohydrate | 시그마 | S9638 | 인쇄 버퍼 구성 요소 |
| 인산 나트륨 헵타 하이드레이트 | 시그마 | S9390 | 인쇄 버퍼 구성 |
| 요소 인산염 완충 식염수 | Hy-Labs | BP-507/500D | 인쇄 완충액/배양/세척 완충액 |
| Tris-base | Sigma | T1503 | 슬라이드 차단 시약 |
| 글리세롤 | Sigma | G-7893 | 인쇄 버퍼 구성 요소 |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | 슬라이드 차단 시약 |
| 오브알부민(V 등급) | Sigma | A5503 | 슬라이드 차단 단백질 |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | 슬라이드 세척 세제 |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding 시아-알파2– 6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | 식물 렉틴 – 결합 Sia-alpha2– 3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | 1차 검출 |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | 비오틴 결합 |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary 닭고기에 대한 검출 IgY |
| 인간 혈청 샘플 | 이스라엘 혈액 은행 | 1차 검출 | |
| 압축 질소(5등급) | 일반 분진/건조 도구 | ||
| 에폭시 코팅 슬라이드 | Corning | 40044 | 슬라이드 |
| 에폭시 코팅 슬라이드 | PolyAn | 2D 104-00-221 | 슬라이드. 이러한 유형의 슬라이드에서 표면은 (코어링 슬라이드에 비해) 소수성이므로 글라이칸 인쇄 버퍼에 0.005% Tween-20을 보충하여 100 µ를 얻어야 합니다. M 사이즈 반점. |
| 384웰 마이크로타이터 플레이트 | Genetix | 2070 | 인쇄판 |
| VWR 랩 마커 | VWR | 52877-310 | 슬라이드 라벨링 |
| 염색 튜브 | 어레이It | MST | 슬라이드 현상 도구 |
| 염색조 | VWR | 25608-904 | 슬라이드 현상 도구 |
| 슬라이드 유리 홀더 | VWR | 631-9321 | 슬라이드 현상 도구 |
| GenePix 스캐너 | 분자 장치 | 4000B | 슬라이드 스캐너 |
| LM-60 나노프린터 | 어레이잇 | LM-60 | 어레이 프린터 |
| 핀 | 어레이잇 | 946MP3 | 프린팅 핀 |
| ProPlate 모듈 | Grace Bio-Labs | P37004 | 슬라이드 개발 모듈 |
| 어레이어 및 가습기에 필요한 | 증류수 | Bio-Lab | 2321020500 |
| 전자 멀티 피펫, 8 채널, 볼륨 범위 2-125 μ L | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | 멀티 피펫으로 시료를 384웰 플레이트로 분배 |
참고문헌
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and resp....
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재인쇄 및 허가
