방법 논문

Sialoglycan Microarray Assay를 사용하여 Human Sera에서 Anti-Neu5Gc IgG 프로파일 링

DOI:

10.3791/56094

⸱

2017년 7월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University, 2Department of Chemistry, University of California-Davis

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시알로 글리 칸 마이크로 어레이 분석은 인체 혈청에서 항 -Neu5Gc 항체를 평가하는 데 사용될 수있어 암 및 기타 만성 염증 매개 질환에 대한 잠재적 인 고효율 진단 분석법이됩니다.

초록

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세포는 일반적으로 암에서 변형되고 시알 산 (Sia) 발현의 변화를 포함하는 탄수화물 사슬 (glycans)의 외투로 덮여 있습니다. 이들은 9 탄소 백본을 가지고 있으며 세포 표면에 척추 동물의 glycan을 캡핑하는 산성 당입니다. 포유 동물의 주요 Sia 형태 중 두 가지는 N- 아세틸 뉴 라민 산 (Neu5Ac)과 N- 히드 록 실화 형태 인 N- 글리콜 노 뉴라민 산 (Neu5Gc)입니다. 인간은 cytidine 5'monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH)를 암호화하는 유전자의 불 활성화 때문에 내인성 Neu5Gc를 생성 할 수 없다. 외래 Neu5Gc는 붉은 육류 및 유제품의식이 섭취를 통해 인간 세포에 의해 획득되고 이후 세포 표면의 다양한 글리 칸에 주로 나타나 암종에 축적됩니다. 결과적으로 인간은 암 및 기타 만성 염증 매개 질환에서 다양한 역할을하는 순환 Neu5Gc 항체를 가지고 있으며 잠재적 인 진단 및 치료제가되고있다rgets. 여기, 우리는 인간 항체에서 이러한 안티 Neu5Gc 항체를 평가하는 높은 처리량 sialoglycan microarray 분석을 설명합니다. Neu5Gc 함유 글리 칸과 각각 일치하는 대조군 쌍 (Neu5Ac 함유 글리 칸)은 각각 핵심 1 차 아민과 함께 에폭시 코팅 유리 슬라이드에 공유 결합되어 있습니다. 우리는 인쇄 당 최대 896 개의 어레이를 생성 할 수있는 특정 나노 프린터를 사용하여 16- 웰 포맷으로 56 개의 슬라이드를 인쇄하는 것을 예시합니다. 각 슬라이드는 안티 Neu5Gc 항체 특이성, 강도 및 다양성의 평가를 위해 16 개의 다른 인간 혈청 샘플을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜은이 견고한 도구의 복잡성을 설명하고 배열 형식으로 다양한 임상 샘플에서 Neu5Gc식이 탄수화물 항원에 대한 반응을 조사하고자하는 사람들을위한 기본 지침을 제공합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sias는 척추 동물의 세포 표면 당 단백질과 당지질의 글리 칸 쇄를 덮는 산성 당입니다. Sia 발현은 암세포 1 에서 변형되고 진행 및 / 또는 전이와 관련이있다 2 , 3 . 포유 동물의 주요 시아 형태의 두 Neu5Ac 및 수산화 형태, Neu5Gc 2이다. 인간은 CMAH 효소를 암호화하는 유전자의 특정 불활 화 때문에 Neu5Gc를 합성 할 수 없다. 이 비인간적 인 Sia는 Neu5Gc가 풍부한식이 요법 ( 예 : 붉은 고기)에서 유래하여 "자기"로 인간 세포에 대사 적으로 결합합니다 4 , 5 . Neu5Gc는 인간 상피와 내피의 세포 표면에 낮은 수준으로 존재하지만 특히 암종에 축적됩니다. Neu5Gc는 인체 체액 성 면역계에 의해 외국으로 인정됩니다 2 , 6 .Neu5Gc 글리 칸의 항원 복잡성은 모든 인간 6 항 Neu5Gc 항체 반응의 복잡성에 의해 반사, Neu5Gc 수정, 연결, 기본 글리 칸과 비계, 그 밀도 등의 여러 수준에서 발생할 수 있습니다. 이러한 항체의 일부는 암 바이오 마커 및 잠재적 immunotherapeutics (7)의 역할을한다. 다른 sialoglycans (8)의 화학 효소 적 합성의 출현 당쇄 마이크로 어레이 기술 (9) (10)의 사용에 의해 용이 항체의 더 심도 깊은 분석을위한 방법을 닦았다. 따라서, 천연 및 합성 탄수화물의 큰 도서관의 촉진 준비와 조작으로, 글리 칸 마이크로 어레이는 생체 분자 (10), (11)의 무수히 많은 탄수화물의 상호 작용을 조사하기위한 강력한 높은 처리량 기술이있다, 12 , 13 . 배열 형태로, 최소량의 물질이 사용되며, 생물학적으로 관련이있는 글리 칸의 다가의 디스플레이는 단일 실험에서 수천 개의 결합 상호 작용을 조사 할 수 있습니다. 중요한 것은,이 기술은 바이오 마커 발견 및 12, 다양한 시료 7에 대한 면역 반응을 모니터링에 적용될 수있다.

성공적인 glycan microarray 제작에는 3 가지 중요한 측면, 즉 프린터 로봇 유형, glycan 접합 화학 및 검출 광학을 고려해야합니다. 인쇄 기기 고려 사항에 관해서는 접촉 및 비접촉식 프린터의 두 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 접촉 프린팅에서 1-48 강철 핀을 글리 칸 용액이 들어있는 멀티 웰 원판에 담궈 유리 슬라이드 표면에 직접 접촉시켜 관능 화 된 유리 슬라이드에 얼룩을지게합니다. 솔루션 금액 de슬라이드에 생존하는 것은 슬라이드 표면의 느린 지속 시간의 함수입니다. 일반적으로 샘플은 슬라이드 표면에 인쇄되기 전에 먼저 유리 블록 (균질 한 지점에 도달하기 위해)에서 미리 얼룩을지게됩니다. 비접촉식 프린터 ( 예 : 압전기 프린터)에서 글리 칸은 제어 된 전기 신호를 사용하여 유리 모세관에서 인쇄됩니다. 접촉 식 인쇄에 비해 더 정밀한 인쇄를 달성하기 위해 전기 신호를 미세하게 조정할 수 있습니다. 스폿의 크기와 형태 또한 비교적 균질합니다. 추가적인 이점은 인쇄 후 시료를 원판에 재활용하는 것입니다. 그럼에도 불구하고 피에조 전자 프린터의 가장 큰 단점은 인쇄 팁 제한 (4 또는 8)으로 매우 긴 인쇄 시간을 초래하며 슬라이드 안정성, 온도, 습도 및 샘플 증발에 특별한주의가 요구됩니다. 비접촉식 잉크젯 프린터에는 더 큰 샘플 용적이 필요합니다 14 .

인쇄 방법에 대한 제한된 사용 가능한 옵션과는 대조적으로, 글리 칸 접합 화학은 선택할 수있는 많은 옵션이있는보다 복잡한 고려 사항입니다. 선택된 고정화 화학은 글리 칸의 활성 그룹 및 슬라이드 표면 반응성 모두를 고려해야한다. 합성 적으로 합성되거나 자연적으로 분리 된 특정 마이크로 어레이 표면 상에 고정화 될 글리 칸은 모두 동일한 반응기를 필요로한다. 또한, glycans은 순수하고 균질해야합니다. 한편, 고정화 표면 및 화학은 재현성 및 신뢰성있는 부착 밀도를 제공해야한다. 공유 결합 또는 비공유 (물리적 흡수) 부착 10 , 11 , 12 , 13 으로 다중 고정화 방법이 개발되었다. Uninitiate를위한 인쇄 된 glycan microarray 기술에 관한 매우 자세한 정보는연구원은 훌륭한 리뷰 13 , 15를 참조하십시오. 중요한 것은 글리코 믹스 실험 (MIRAGE) 이니셔티브에 대한 최근의 최소 필요한 정보는 샘플 준비 (16)과이 성장하는 분야의 표준을 개선하기 위해 (17)을 분석 글리 칸 마이크로 어레이 데이터를보고하기위한 지침을 설명합니다.

여기, 우리는 16 웰 형식의 특정 연락처 나노 프린터를 사용하여 sialoglycan microarrays의 제조에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 각 글리 칸은 에폭시 활성화 유리 슬라이드에 대한 공유 결합을 매개하는 1 차 아민을 가지고 있습니다. 우리는 또한 다양한 인간 혈청 시료, 항체 및 Sia 결합 식물 렉틴을 사용하여 한 슬라이드의 개발과 분석을 설명합니다. Sialoglycan 마이크로 어레이 분석은 어레이 제조, 프로세싱, 개발 및 분석을 포함한 몇 가지 주요 단계를 포함합니다. 어레이 제작에는 ar 계획이 필요합니다.나노 그리드 및 소스 플레이트 준비, 나노 프린터 프로그래밍, 슬라이드 인쇄 등의 작업을 수행 할 수 있습니다. 이어서 슬라이드를 처리, 개발 및 분석합니다 ( 그림 1 ).

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프로토콜

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인체 혈청 샘플은 이스라엘 혈액 은행 (Israeli Blood Bank)에서 얻은 것이며 헬싱키 선언 및 Tel Aviv University Institutional Review Board에 따라 사용되었습니다.

1. 어레이 제조 계획 및 레이아웃

  1. 슬라이드 레이아웃을 결정하십시오.
    참고 : 각 슬라이드에는 B1 ~ B16으로 번호가 매겨진 16 개의 동일한 블록으로 분할 된 16 개의 하위 어레이가 포함됩니다 ( 그림 1B , 보충 그림 1A ).
  2. 핀 배치를 결정하십시오. 슬라이드마다 4 개의 하위 배열 (블록)을 인쇄하는 4 개의 핀을 사용하십시오.
    핀 1은 블록 1, 2, 9 및 10을 인쇄하고,
    핀 2는 블록 3, 4, 11 및 12를 인쇄합니다.
    핀 3은 블록 5, 6, 13 및 14를 인쇄합니다. 과
    핀 4는 블록 7, 8, 15 및 16을 인쇄합니다 ( 보충 그림 1A ).
  3. 블록 및 384 웰 플레이트 레이아웃을 결정하십시오.
    참고 : 글리 칸이 각 블록에 나타나는 순서는주의 깊은 계획이 필요합니다. 이 예제에서 arr4 개의 복제본으로 각 샘플을 인쇄하고, 오른쪽 하단 모서리 (형광 분석을 용이하게하기 위해)에 형광 마커 스폿을 디자인하고, 증가하는 농도로 표준 곡선 IgG (STD) 스폿을 인쇄합니다 ( 보충 그림 1B ).
    1. 인쇄 된 각 스폿에 대해 먼저 384 웰 플레이트에 4 개의 웰 (각 핀 당 하나)에 재료를 분배합니다.
      참고 : 384 웰 플레이트의 재료 순서는 설계된 블록 레이아웃 ( 그림 1B-C )에 달려 있습니다.

2. 글리 칸 및 소스 플레이트의 제조

  1. 글리 칸 인쇄 버퍼 (300 MM 인산 완충액, 산도 8.4 50 ML)를 준비합니다. 모노 소듐 포스페이트 모노 하이드레이트 58.5 mg의 (에 NaH 2 PO 4 .1H 2 O)과 40㎖의 탈 이온수 (DIW)의 인산 나트륨 수화물 (NA 2 HPO 4 · 7H 2 O) 3.9 g을 계량. 4 M NaOH를 사용하여 pH 8.4로 적정한다. 볼륨을 50 mL로 조절하십시오.0.2 μm 멤브레인을 통해 여과하여 살균합니다.
  2. 표지 버퍼 (187 MM 인산 버퍼 50 ML, 산도 5)를 준비합니다. 모노 소듐 포스페이트 모노 하이드레이트 289 mg의 (에 NaH 2 PO 4 .1H 2 O)과 DIW 40 ㎖의 인산 나트륨 수화물 (NA 2 HPO 4 · 7H 2 O)을 1.94 g을 단다. 1 M HCl을 사용하여 pH 5로 적정한다. 50 ML에 볼륨을 조정하고 멸균 0.2 μm의 멤브레인을 통해 필터.
  3. STD 곡선 버퍼 (50 % PBS - 글리세롤 : 100 % 글리세롤 주식에서 10 % 글리세롤을 보충 한 인산염 완충 식염수, 인산염 완충 식염수)를 준비하고 멸균을 위해 0.2 μm 멤브레인을 통해 걸러냅니다.
  4. DIW 10 MM에서 각 glycan 주식 솔루션을 준비합니다. 역상 고압 액체 크로마 토 그래피 분석 18 에서 형광 검출에 의해 시알 릴화 glycan 농도를 확인하십시오.
  5. glycan 인쇄 버퍼의 100 μL 총 볼륨 100 μM 각 glycan을 희석microcentrifuge 관에서.
  6. 형광 염료가 포함 된 1 급 아민을 준비하십시오. Alexa 555- 히드라 지드를 마커 버퍼로 1 mg / mL로 용해시킨 다음 1 mL 총 부피에서 1 μg / mL로 희석하십시오.
    참고 : 다른 모든 1 급 아민 함유 염료는 슬라이드 스캐너에 따라 적절한 파장으로 사용할 수 있습니다.
    참고 : 마커 스폿은 분석하는 동안 각 블록에서 격자 정렬을 용이하게합니다.
  7. 인간 IgG STD 곡선 희석을 준비하십시오 : STD 곡선 버퍼에서 160 ng / μL에서 인간 IgG의 원액 0.5 mL를 준비하십시오. 연속적으로 주식을 1 : 1로 6 번 희석하여 80, 40, 20, 10, 5 및 2.5 ng / μL를 얻으십시오. 모두 STD 곡선 버퍼에 200 μL를 넣으십시오.
    참고 : 실험에 적합하다면 다른 Ig 이소 타입을 사용할 수 있습니다 ( 예 : 인간 IgA, IgM, IgE 또는 다른 유기체의 Ig).
  8. 얼음에 384 잘 접시를 놓습니다. 전자 멀티 피펫을 사용하여 각 글리 칸, 마커 및 STD 곡선의 7 μL 분량 IgG - 4 복제( 그림 1C ). 정확성을 높이기 위해 각 시료 35 μL를 적재하고 시료의 4 개 웰 각각에 7 μL를 분주하십시오. 원래의 튜브에 각 glycan의 나머지 7 μL를 다시 놓습니다.
  9. 플레이트를 파라 필름으로 덮고 250g 및 12 ° C에서 2 분 동안 스핀 다운합니다. 빛으로부터 보호 된 실온 (RT)에 판을 놓습니다. 실내 습도가 60-70 %에 도달하기 전에 판을 꺼내지 마십시오.

3. 나노 프린터 프로그래밍

  1. "Microarray Manager"소프트웨어를 엽니 다. "메서드 속성"창을 사용하십시오.
  2. 작업 테이블 레이아웃 설정 : "56 슬라이드 구성"을 선택하십시오.
    참고 :이 슬라이드는 56 개의 슬라이드를 인쇄 할 수 있도록 미리 정의 된 구성입니다. 각 유형의 판, 핀 및 인쇄 형식을 보정하십시오 ( 추가 그림 2 , 1 단계).
  3. "핀 구성"을 선택하십시오.| "핀 공구 1x4 9mm."
    참고 : 이것은 4 개의 핀을 사용하기위한 사전 정의 된 구성입니다 ( 보충 그림 2 , 2 단계).
  4. "핀 유형"을 정의하십시오. 인쇄에 적합한 핀 유형을 계산하고 작성하십시오.
    참고 :이 단계는 핀이 샘플 384-well에 재 채취되기 전에 인쇄 할 지점 수를 정의하며 다른 핀 유형과 슬라이드 표면 화학에 맞게 최적화되어야합니다.
    참고 : 946MP3 핀을 사용하는 경우 두 가지 중요한 문제를 고려하십시오. 1) 각 핀은 최대 140 개의 균일 한 스폿을 인쇄 할 수 있으며 2) 사전 스폿 팅은 슬라이드에 인쇄하기 전에 핀 끝에서 과도한 액체를 배출하는 데 필수적입니다. 따라서 각 핀을 사전 인쇄 블록 (에폭시 코팅 슬라이드의 946MP3 핀에 맞게 최적화 됨)에 20 개의 사전 스폿을 인쇄하도록 프로그램하십시오.
    1. 샘플 당 인쇄 된 총 스팟 수를 계산하십시오.
      참고 : 각 핀은 하위 어레이 (블록) 당 4 개의 스폿을 인쇄합니다. 슬라이드 당 총 4 개의 서브 어레이 = 16 개 / sl이상. 슬라이드 7 장 후, 각 핀은 16 x 7 = 112 스폿을 인쇄합니다. 또한, 인쇄 전 20 사전 스폿은 132 스폿 / 딥을 제공합니다. 따라서 핀 유형은 "946MP3-132 스폿"(블록 당 샘플 4 개 x 4 블록 x 7 슬라이드 + 20 개 예비 스폿 = 132)으로 정의됩니다.
    2. "핀 유형"을 만듭니다 ( 보충 그림 2 , 3 단계). "설정"을 누르십시오 (소프트웨어의 왼쪽 패널) | "마이크로 검출 핀"| "새 이름"(946MP3-132 점). 딥 (132), 스폿 직경 (100 μm), 흡수 (0.25 μL), 전달 (0.7 nL) 및 최소 스폿 간격 (100 μm) 당 스팟 수를 정의하십시오. "확인"을 누르십시오 | "승인."
    3. "Method properties"창에서 "946MP3-132 spots"핀 유형을 선택하십시오.
  5. 세척 조건을 정의하십시오. "시작하기 전에 닦으십시오"및 "마무리 후 씻으십시오"를 "표준 세척"( 보충 그림 2 , 4 단계)으로 설정하십시오.
  6. "플레이트 목록"을 정의하십시오.
    참고 : 이것은 플레이트 레이아웃에 따라 플레이트에서 샘플링 패턴 (384 웰 플레이트의 딥 순서)입니다. 플레이트를 플레이트 목록에 업로드하려면 플레이트 샘플링 패턴을 설정하십시오.
    1. 플레이트 "샘플링 패턴"을 만듭니다. "템플릿"( 부록 3 )으로 이동하십시오. "샘플링 패턴." 새 이름을 지정하십시오 ( 예 : JoVE 배열). "Insert"를 선택하십시오. "상단 하단 채우기"| "핀 공구 1 x4 9 mm." 사전 정의 된 플레이트 레이아웃 ( 추가 그림 1A )에 따라 웰 픽업의 순서를 선택하십시오. "확인"을 누르십시오 | "승인."
    2. 플레이트 샘플링 패턴을로드하십시오. "Plate list"셀의 오른쪽을 클릭하십시오 ( 보충 그림 3 ). "Add plate"를 선택하고 정확한 플레이트 샘플링 패턴을 선택하십시오 (3.6.1 절에서 설명 된 "JoVE array"). "일반 워시"를 선택하십시오. 프레스"OK"| "승인."
  7. "Sample Plates (샘플 플레이트)"로 이동하여 위치 오프셋을 1 (플레이트가 배열 기 데크에있는 위치를 결정하는)로 변경하십시오.
    참고 : 오프셋 위치 0은 초음파 분쇄기에 가깝습니다.
  8. "Microarray Print Design"을 정의하십시오. 블록 간 거리와 간격을 계산하십시오.
    1. 슬라이드를 7 x 7 mm 크기의 16 개의 웰로 분할하는 현상 툴의 크기를 고려해보십시오. 서브 어레이 사이의 간격은 2 mm입니다 (블록 사이의 합계 9 mm, 보충 그림 4 ).
    2. 서브 어레이 크기를 고려하십시오.
      참고 : 스폿 간 간격은 0.275mm이며이 인쇄 디자인에는 12 열과 18 행이 있습니다. 전체 크기는 너비 (11 x 0.275 mm = 3.025 mm) 및 높이 (17 x 0.275 mm = 4.675 mm)입니다. 수평 간격을 계산하십시오 : 9 mm - (11 0.275) = 5.97 mm. 수직 간격을 계산하십시오 : 9 mm - (17 x 0.275) = 4.325 mm. d를 계산하십시오.슬라이드 왼쪽에서 4.43 mm + 1.07 mm = 5.5 mm. 슬라이드의 위쪽에서부터의 거리를 계산하십시오 : 2.95 mm + 0.55 mm = 3.5 mm ( 보충 그림 4 ).
    3. "인쇄물 디자인"을 정의하십시오 ( 보충 그림 5 ). "템플릿"| "디자인 인쇄"| "새로운."
      1. "Pin Setup"을 선택하십시오 | "핀 공구 1 x 4 9 mm"| "핀 - 946MP3-132 개 반점." "General"탭에서 "Microarray Print"의 이름을 변경하십시오 ( 예 : "JoVE array"). "Spot Speed"를 선택하십시오 | "복제 번호"(4) | "터치 포인트 높이"(0 mm) | "소프트 터치 높이"(3 mm) | "사용 가능한 모든 위치에 인쇄하십시오"( 보충 그림 5A ).
      2. "Microarray"탭에서 수평 및 수직 간격 (3.8.2 단계에서 5.9mm 및 4.325mm)과 수평 및 수직 마이크로 어레이 수 (2)를 선택하십시오. '인쇄'를 선택하십시오.Microarray Horizontally "|"Print Duplicate Microarray "( 보충 그림 5B ).
      3. 하위 배열 탭에서 최대 열 수 (12), 최대 행 수 (18) 및 열과 행 사이의 거리 (275 μm)를 선택하십시오 ( 보충 그림 5C ).
      4. 측정 탭에서 슬라이드 왼쪽에서부터의 거리 (5.5 mm), 슬라이드 상단에서의 거리 (3.8.2에서 계산 된 3.5 mm), 인쇄 슬라이드 너비 (25 mm) , 인쇄 슬라이드 높이 (75 mm) ( 보 조 그림 5D ). "확인"을 누르십시오 | "승인."
  9. "Microarray Print Designs"셀의 오른쪽을 클릭하고 정의 된 디자인 (3.8.3 단계의 "JoVE array", 보충 그림 6 )을 선택하십시오.
  10. "슬라이드 카운트"(56)를 정의하고 "위치 오프셋"(0)을 변경하십시오. 이것은 po를 결정합니다.arrayer 데크에 인쇄 할 첫 번째 슬라이드의 위치 ( 그림 6 ).
  11. "Microarray Pre-Print Design"을 정의하십시오 ( 보충 그림 6 ). "유리 블록"선택 | "1mm x 4mm 핀 공구 사전 인쇄"
    참고 :이 스폿 간격 설정은 유리 블록에 46,464 개의 사전 스폿 (4 개 핀 모두)을 허용하므로 핀 당 46,464 / 4 = 11,616 개의 사전 스폿이 가능합니다. 사전 인쇄 블록의 공간이 모두 소모되면 프린터가 중지되고 블록을 뒤집어 야합니다.
    참고 : 인쇄 전 블록이 채워진 샘플 수를 계산하려면 다음을 고려하십시오. 모든 샘플은 384 웰 플레이트에서 8 핀 디핑으로 56 슬라이드 (딥 당 7 슬라이드)를 완료하고 각 딥 추가로 20 개의 사전 스폿이있어 샘플 당 총 160 개의 사전 스팟을 제공합니다. 그러므로 11,616 / 160 = 72.6 샘플. 따라서 사전 인쇄 유리 블록은 72 샘플 후에 뒤집을 필요가 있습니다 (뒤집기 시간을 측정하려면 h한 샘플이 56 개의 슬라이드에서 전체 실행을 완료 한 다음 72로 곱하면됩니다.
  12. "Use PrePrint Design"을 선택하십시오. "예"| "바코드 스캔"(아니오) | "단일 복제본 인쇄"(No) ( 보충 그림 6 ).
  13. "Validate"를 클릭하십시오 ( 보충 그림 6 ).
  14. "저장"을 클릭하고 메소드를 arr 파일로 저장하십시오 ( 예 : "JoVE array.arr", 보충 그림 6 ).

4. 설계된 배열 인쇄하기

참고 : 모든 단계는 습기가 60-70 % 인 깨끗한 방에서 보호를 위해 적절한 장갑과 의복으로 수행되어야합니다

  1. 나노 프린터 기계와 가습기를 켜십시오.
  2. 세척 완충액과 가습을 위해 DI 수를 채 웁니다. 세척 병 (배수구)과 가습 트랩 카보이 ( 추가 그림 7A )를 비우십시오.
  3. 가습기를로 설정하십시오.70 % 습도 및 가습 시작.
  4. 인쇄하기 전에 모든 핀을 청소하십시오. 고온 (65 ° C) 핀 - 팁 세척 용액 (핀 - 팁 세척 시약 15 g 및 65 mL 물 50 mL)을 50 mL 씩 준비하고 고체 시약이 완전히 녹을 때까지 완전히 혼합합니다.
    1. 핀 팁 브러시 (미세)를 핀 팁 세척 용액에 담그고 각 핀 팁의 표면을 닦아서 각 핀 팁에 세척 용액을 바릅니다.
      참고 : 핀 팁 세척 용액은 부식성이며 독성이 있습니다. 이 솔루션을 사용할 때는 항상 장갑과 보안경을 착용하십시오. 핀 팁 세척 용액에 핀을 몇 분 이상 담가두면 영구 핀이 손상 될 수 있습니다.
    2. 1L의 증류수로 초음파 욕조를 채우고 욕조의 부유 식 핀 세척 랙에 핀을 놓습니다. 5 분 동안 초음파 처리하고 핀을 제거하십시오. 클린 룸의 특수 헝겊으로 건조하고 부드럽게 닦아냅니다.
  5. "Microarray Manager"프린트 열기어 소프트웨어; 연결이 설정되면 프린터 표시등이 켜집니다 (빨간색 / 녹색). "중지"를 누르십시오 | "지우기"| "Init"( 보충 그림 7B , 단계 1-3); 프린트 헤드 암은 X, Y, Z 정렬을 재설정합니다.
  6. 핀을 인쇄 헤드에로드하려면 "Load"( 보충 그림 7B , 4 단계)를 누르고 인쇄 / 핀 도구 레이아웃의 정의 된 구성 ( 보충 그림 7C )에 따라 핀을 인쇄 헤드에 놓습니다 . 이 레이아웃은 각 슬라이드에 4 개의 하위 어레이를 인쇄하는 4 개의 핀을 사용하여 슬라이드 당 총 16 개의 하위 어레이를 얻습니다 ( 보충 그림 1A ). 핀을 놓은 후 "Init"를 다시 누르십시오.
  7. Arrayer 덱에서 슬라이드를 조립하십시오. 슬라이드 상자를 열고 초 고순도 질소 가스를 불어 넣어 각 슬라이드를 청소하십시오. 어레이 플랫폼에 원하는 수의 슬라이드를 놓습니다. 두 개의 손가락으로 슬라이드를 잡고 아래 모서리에 놓은 다음 슬라이드를위치. 오른쪽 모서리 두 개를 잡고 슬라이드가 제 위치에 완전히 끼울 때까지 왼쪽 모서리를 조심스럽게 누릅니다. 단단히 고정되도록 왼쪽 아래 구석을 향해 살짝 미십시오 ( 보충 그림 7D ).
  8. 증류수, 70 % 에탄올 및 100 % 에탄올로 사전 블록 유리를 닦아 낸 다음 공기 건조시켜야합니다 (전용 클린 룸 와이프 만 사용하십시오). 프리 블록 유리를 데크의 위치에 놓습니다.
  9. sonicator bath를 채 웁니다 ( 보충 그림 7B ). "Fill"을 55 초 동안 누른 다음 "OK"를 누르십시오. "Drain"을 20 초 동안 누른 다음 "OK"를 눌러 초음파 분쇄기를 배출하십시오. 채우기 및 배수를 한 번 더 반복 한 다음 55 초 동안 다시 채 웁니다.
  10. 세척 욕조를 채우십시오 ( 보충 그림 7B ) : "Prime"을 40 초 동안 누른 다음 "OK"를 누르십시오.
  11. aliquoted 샘플과 384 잘 판을 arrayer 갑판에 그 위치에 놓고 parafilm 덮개를 제거하십시오.
  12. 인쇄를 시작하십시오.
  13. 인쇄가 완료되면 초음파 분쇄기 배수구 ( 그림 7B 참조 )를 배출하고 가습기를 끕니다.
  14. 가습없이 슬라이드를 16 ~ 24 시간 동안 건조시켜야합니다.
  15. 알코올 / 내용 매성 마킹 펜으로 번호를 매기고 어두운 곳에서 진공 봉인 된 상자에 보관하십시오.

5. 배열 처리 및 개발

  1. 진공 봉인 된 상자에서 슬라이드를 꺼내어 배열이 위를 향하게 5 분간 화학 후드에 놓아 과도한 액체를 증발시킵니다.
  2. 가장 높은 게인 (950 PMT)으로 슬라이드를 스캔하여 모든 스폿이 인쇄되었는지 확인하십시오.
  3. 슬라이드의 에폭시 그룹을 화학적으로 차단하십시오.
    1. 에탄올 아민 차단 용액 (0.1 M Tris-HCl, pH 8 및 0.05 M 에탄올 아민) 50 mL를 준비한다. 140 mL의 DIW와 8.8 mL의 트리스 -HCl (1.7 M, pH 8) 및 0.45 mL의 에탄올 아민 (16.6 M)을 혼합한다. 5로 이동0-mL 염색 튜브 ( 보충 그림 8A )로 옮기고 50 ° C로 따뜻하게합니다.
    2. 슬라이드를 수화합니다. DIW로 가득 찬 염색 튜브에 슬라이드를 넣고 호일로 덮은 다음 RT에서 천천히 부드럽게 흔들어 5 분 동안 배양합니다.
    3. 슬라이드의 반응성 에폭시 그룹을 차단하십시오. 미리 데워진 ethanolamine 블록 솔루션으로 가득 50 ML 얼룩 튜브에 슬라이드를 담가 호일로 덮고, RT에서 천천히 부드러운 흔들어와 30 분 동안 품어.
    4. 적절한 biohazard 쓰레기통에 ethanolamine 블록킹 용액을 버리고 50 ° C DIW로 채워진 새롭고 깨끗한 염색 튜브에 슬라이드를 놓습니다. 호일로 덮고 RT에서 천천히 부드럽게 흔들어 10 분간 품어 라.
    5. 물을 버리고 슬라이드를 유리 염색 홀더에 옮깁니다 ( 보충 그림 8B ). 스윙 플레이트 홀더에 유리 얼룩 홀더를 놓고 200 xg 및 RT에서 5 분 동안 슬라이드를 원심 분리 건조시킵니다.
  4. 칸막이를 설치하고 생물학적 차단으로 진행하십시오.
    1. 슬라이드를 16 - 웰 구분선에 놓으십시오 ( 보충 그림 8C ).
    2. PBST 세척 용액 준비 : 인산 완충 식염수 (PBS), pH 7.4 + 0.1 % Tween-20 50 mL.
    3. 생물학적 차단 용액 (PBS-OVA)을 준비하십시오 : 5 mL의 PBS, pH 7.4 + 1 % 닭 오발 부민 (10 mg / mL).
      참고 : 차단 시약의 선택은 항 -Neu5Gc 항체의 검출 성공에 중요합니다. 오발 부민은 인간과 마찬가지로 Neu5Gc를 합성 할 수없는 닭에서 만들어지며이 Sia의 발현이 부족합니다. Neu5Gc의 검출을 위해, 심지어 사소한 오염 물질은 분석의 민감도를 극적으로 감소시킬 수 있으며 때로는 어떠한 Anti-Neu5Gc 반응도 검출하지 못합니다. 예를 들어, 가장 일반적으로 사용되는 블로킹 시약인 소 혈청 알부민 (BSA)은 그 자체로는 글 라이코 실화되지 않지만 Neu5Gc- 잔기를 보유하는 소 IgG IgG 오염 물질을 포함하므로 w항 -Neu5Gc 항체로 시료에 결합 할 때 인쇄 된 글리 칸 19 , 20 .
    4. 우물을 미리 준비하십시오. 멀티 피펫을 사용하여 PBST 200 μL를 슬라이드 웰에 넣고 습도가 높은 챔버에 넣고 5 분간 흔들어줍니다.
      참고 : 습도 챔버는 샘플을 빛으로부터 보호하기 위해 나일론 랩과 호일로 덮인 젖은 수건 종이가있는 유리 트레이입니다.
    5. 깨끗한 종이 타월에 부드럽게 톡톡 두드려서 PBST를 제거하고 각 웰에 PBS-OVA blocking buffer 200 μL를 분취하십시오. 습도가 높은 챔버에 넣고 부드럽게 흔들어 RT에서 1 시간 동안 배양합니다.
  5. 표 2에 나열된 바와 같이 PBS-OVA 차단 완충액으로 희석 한 1 차 검출을 준비합니다.
    참고 :이 시알로 글리 칸 마이크로 어레이의 품질 관리 (QC) 평가를 위해 여러 Sia 결합 단백질을 사용하십시오 : 엘더베리 나무 껍질에서 분리 된 Sambucus nigra lectin (SNA)은 Sia &# 945; Maackia Amurensis Lectin II (MALII)는 Siaα23을 인식 할 것으로 기대된다. 및 닭 anti-Neu5Gc IgY는 모든 Neu5Gc 함유 시알로 글리 칸을 인식 할 것으로 기대된다. 또한, 다양한 Neu5Gc IgG 반응을 프로파일 링하기 위해 다양한 인간 혈청 샘플을 사용하십시오. 렉틴 / 항체 / 혈청의 농도는 실험적으로 보정해야합니다.
  6. 건조 PBS - OVA 차단 버퍼를 가볍게 치고 우물 당 1 차 항체 200 μL를 추가합니다 (웰당 최소 부피 : 70 μL). 습도가 높은 챔버에서 2 시간 동안 품어 둡니다.
  7. 1 차 검출을 톡톡히 말려서 PBST로 4 회 세척하십시오 (3 회 및 4 회 세척 사이, 습도가 높은 챔버에서 5 분 동안 PBST에서 슬라이드를 품을 것). PBS로 한번 씻으십시오.
  8. 표 2에 나열된대로 PBS에 보조 항체를 준비합니다.
  9. PBS를 톡톡히 말리고 2 차 항체 200 μL를 첨가하십시오. 흔들어서 RT에서 1 시간 동안 품어 낸다.
  10. 이차 항체를 톡톡히 말려서 PBST로 4 번 씻으십시오 (3Rd 및 제 4 회 씻어, 습한 챔버 내에서, 5 분)에 대한 PBST에서 슬라이드를 배양한다.
  11. 조심스럽게 프레임을 제거하고 PBS로 채워진 50 ML 슬라이드 얼룩 튜브에 슬라이드를 놓고 5 분 동안 흔들어.
  12. 2 개의 슬라이드 얼룩이는 욕조 ( 그림 8D 참조 )를 DIW로 채우고 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 욕조에 담그십시오. 빠르게 10 번 담그고 두 번째 욕조로 옮기고 10 번 더 담그십시오. 흔들어 섞으면 서 RT에서 10 분 동안 품어 낸다.
  13. 물을 버리고 슬라이드를 유리 염색 홀더에 옮기십시오 ( 보충 그림 8B , 슬라이드가 공기 건조하게하십시오). 스윙 플레이트 홀더에 유리 얼룩 홀더를 놓고 원심 분리기를 200g 및 RT에서 5 분 동안 건조시킵니다.
  14. 슬라이드를 스캔 한 다음 어둠 속의 진공 봉인 된 상자에 보관하십시오.

6. 어레이 스캐닝 및 데이터 분석

  1. 형광 슬라이드 스캐너를 열고 5 분 동안 따뜻하게하십시오. 그스캐닝 및 분석 소프트웨어.
  2. 스캐닝 매개 변수를 설정하십시오 ( 보충 그림 9A ) : 532 nm 및 100 % 출력에서 ​​350 PMT의 이득으로 스캔하십시오. 평균은 한 줄, 초점 위치는 0 μm입니다. 10.0 μm 픽셀 크기 해상도를 사용하십시오.
    참고 : 스캔 매개 변수는 다양한 슬라이드 유형, 형광 및 해상도로 조정할 수 있습니다.
  3. 개발 된 슬라이드를 스캔하십시오. 스캐너 도어를 열고 어레이 안쪽을 아래로 향하게 슬라이드를 놓으십시오. 스캔을 시작합니다 (소프트웨어 탐색 패널 메뉴의 녹색 "재생"버튼, 추가 그림 9B ).
  4. 스캔 한 슬라이드를 tiff 파일로 저장하십시오.
  5. 분석을 위해 슬라이드를 준비하십시오. "로드 배열 목록"을 선택하고 슬라이드의 각 블록에있는 배열을 매핑하는 적절한 GAL 파일을 업로드합니다 ( 추가 그림 9C ).
    참고 : GAL 파일에는 슬라이드의 각 지점의 ID와 위치 (X, Y)에 관한 정보가 들어 있습니다. 이 파일을 만들 수 있습니다.384-well 소스 플레이트의 샘플 ID와 정의 된 인쇄 디자인을 기반으로 탭으로 구분 된 텍스트 파일을 내보내는 프린터 소프트웨어가 있습니다.
  6. 정렬 및 분석 매개 변수를 설정하십시오. 소프트웨어 탐색 패널 메뉴에서 "Option"버튼을 누릅니다 ( 추가 그림 10 ).
  7. 정렬 매개 변수를 정의하십시오. 원형 피쳐를 찾고 50 ~ 350 % 정렬 할 때 피쳐의 크기를 조정하고 최대 이동 거리를 40μm로 제한하고 배경 임계 값 (CPI 임계 값 0)에 실패한 피쳐를 제거하고 블록을 찾을 때 줄 바꿈 및 회전을 추정하고 이미지 등록을 자동화합니다. (10 픽셀) ( 보충 그림 10 ).
  8. 분석 매개 변수를 정의하십시오 : W1 / 532 비율, 표준 표준 편차, 부재 부재 분석 및 배경 빼기. "선택"을 클릭 한 다음 "로컬 기능 배경 중앙값"을 클릭하고 배제 할 2 픽셀 및 배경의 3 픽셀 너비를 설정합니다. "확인"을 누르십시오. Set 스캐너 채도 레벨을 기본값으로 설정합니다 ( 보충 그림 10 ).
    참고 : 배경 빼기 방법은 실험 설계에 따라 다르며 필요에 따라 수정할 수 있습니다.
  9. 기능 맵을 정렬하십시오. 프로그램을 블록 모드로 설정하고 ( "B"누름) 모든 블록 (Ctrl + A)을 선택하고 배열 맵 격자를 배치하고 모든 블록을 정렬합니다 (Alt + Shift + F7) ( 보충 그림 11 ).
  10. 각 블록의 형상 정렬을 수정합니다. 왼쪽 상단 블록에 확대 / 축소 ( "Z"를 줌 모드로 들어가기), 다시 "B"를 눌러 (블록 모드),이 블록의 그리드를 누르십시오. 이 블록이 블록 스팟과 완벽하게 정렬 될 때까지이 블록의 그리드를 이동하고 F5를 눌러이 선택된 블록의 피쳐를 정렬합니다. 스팟들이 완벽하게 원이 될 때까지 그리드 이동과 F5 정렬을 반복하십시오. 모든 격자가 제 위치에 놓일 때까지 16 개의 블록 중 하나에 대해 동일하게하십시오.
  11. 데이터를 분석하고 저장하십시오. 모든 블록을 선택하십시오 (Crtl +A)를 선택하고 데이터를 분석하십시오 (Alt + A). 분석 결과 (Ctrl + U)를 .gpr 파일로 저장하십시오.
  12. 스프레드 시트 프로그램에서 저장된 .gpr 파일을 열고 로컬 배경 빼기 (F532-B532) 후 형광을 기반으로 각 지점의 강도를 분석합니다.

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결과

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배열 인쇄, 개발 및 분석 :

여러 개의 glycan 시료와 human IgG STD 곡선을 가진 sialoglycan microarray를 16 개 블록으로 인쇄하려면 모든 시료가 슬라이드 당 16 개의 블록과 동일한 인쇄 작업에서 모든 슬라이드에 가능한 한 균일하게 인쇄되도록 철저한 보정이 필요합니다. 따라서 각 시료 유형, 슬라이드 유형 및 제조, 384-well plate type, 습도 수준, 384-well plate의 시료 부피, pre-of-plate의 양에 대한 buffer 조성을 포함하여 특정 인쇄 매개 변수가 결정되기 전에 여러 교정 실험이 필요합니다 모든 샘플 유형, 인간 IgG STD 곡선 농도 및 마커 유형에 대한 인쇄. 인쇄 된 sialoglycan 어레이 슬라이드의 내구성은 실온에서 어두운 곳에서 진공 밀봉 된 상자에서 최대 10 개월 ...

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토론

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성공적인 glycan microarray 제작에는 신중한 계획이 필요하며 프로토콜에 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 여기에는 (1) 모든 후속 매개 변수 ( 예 : 거리, 간격, 샘플 양 및 인쇄)를 정의하는 블록 및 플레이트 레이아웃 계획. (2) 핀을 클리닝하고 핀의 완전성을 보장하는 것, 이는 스팟 동질성을 제어하는 ​​데 중요합니다. (3) 인쇄 중 습도를 높게 유지하며, 장시간 인쇄시 샘플 증발을 피하는 것이 중요하며, 이는 얼룩 동질성을 손상시킬 수 있습니다. (4) 결과에 영향을 줄 수있는 적절한 정렬 및 분석 매개 변수 ( 예 : 배경 빼기 방법, 임계 값 및 스폿 크기 유연성)를 선택합니다.

이 방법은 특정 실험 설계 및 목표를 충족시키기 위해 추가로 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 예비 스포팅 번호는 어레이에 인쇄 할 각 유형의 재료에 더 잘 맞도록 수정할 수 있습니다. 핀 세척 단계인쇄물을 다른 인쇄물에 맞게 최적화 할...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 부분적으로 Israel Cancer Research Fund의 Research Career Development Award, Israeli National Nanotechnology Initiative의 보조금 및 Personalized Theranostics (VP-K)의 Nanomedicines에 대한 Focal Technology Area의 Helmsley 자선 신탁 및 National 보건 당국 R01GM076360 (XC에).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 차 아민 함유 sialoglycansGlycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)화합물 요청 문의 info@glycohubusa.com 인쇄된 글리칸
인산 Monosodium phosphate monohydrate시그마S9638인쇄 버퍼 구성 요소
인산 나트륨 헵타 하이드레이트시그마S9390인쇄 버퍼 구성
요소 인산염 완충 식염수Hy-LabsBP-507/500D인쇄 완충액/배양/세척 완충액
Tris-baseSigmaT1503슬라이드 차단 시약
글리세롤SigmaG-7893인쇄 버퍼 구성 요소
EthanolamineThermo-Fisher Scientific0700/08슬라이드 차단 시약
오브알부민(V 등급)SigmaA5503슬라이드 차단 단백질
Tween-20SigmaP7949슬라이드 세척 세제
Alexa 555-HydrazideThermo-Fisher ScientificA20501MPMarker on array
ChromPure Human IgG, whole moleculeJackson Immunoresearch009-000-003Printing component
Biotinylated- SNAVector LaboratoriesB-1305Plant Lectin – binding 시아-알파2– 6-linked
Biotinylated-MALIIVector LaboratoriesB-1265식물 렉틴 – 결합 Sia-alpha2– 3-linked
Chicken-anti Neu5Gc IgYBioLegend1469031차 검출
Cy3-StreptavidinJackson Immunoresearch016-160-0848비오틴 결합
Cy3-anti Human IgGJackson Immunoresearch109-165-088human IgG
Cy3-anti Chicken IgYJackson Immunoresearch703-165-155Secondary 닭고기에 대한 검출 IgY
인간 혈청 샘플이스라엘 혈액 은행1차 검출
압축 질소(5등급)일반 분진/건조 도구
에폭시 코팅 슬라이드Corning40044슬라이드
에폭시 코팅 슬라이드PolyAn2D 104-00-221슬라이드. 이러한 유형의 슬라이드에서 표면은 (코어링 슬라이드에 비해) 소수성이므로 글라이칸 인쇄 버퍼에 0.005% Tween-20을 보충하여 100 µ를 얻어야 합니다. M 사이즈 반점.
384웰 마이크로타이터 플레이트Genetix2070인쇄판
VWR 랩 마커VWR52877-310슬라이드 라벨링
염색 튜브어레이ItMST슬라이드 현상 도구
염색조VWR25608-904슬라이드 현상 도구
슬라이드 유리 홀더VWR631-9321슬라이드 현상 도구
GenePix 스캐너분자 장치4000B슬라이드 스캐너
LM-60 나노프린터어레이잇LM-60어레이 프린터
핀어레이잇946MP3프린팅 핀
ProPlate 모듈Grace Bio-LabsP37004슬라이드 개발 모듈
어레이어 및 가습기에 필요한증류수Bio-Lab2321020500
전자 멀티 피펫, 8 채널, 볼륨 범위 2-125 μ LThermo-Fisher Scientific (Matrix)MA-2131 Impact2 Equalizer 384멀티 피펫으로 시료를 384웰 플레이트로 분배

참고문헌

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