샘플 추출 및 독 소 루비와 미토마이신 C 다음 약물 조합을 전달 나노 입자에 종양 방위 쥐의 동시 크로마 정량

Summary

이 프로토콜에 설명 합니다 샘플 추출의 효율적이 고 편리한 분석 프로세스와 여러 약물, 독 소 루비 (DOX), 미토마이신 C (MMC) 및 심장 독성 DOX 대사 산물, doxorubicinol (DOXol), 생물학에서의 동시 결정 전 임상 유 방 종양 모델에서 샘플 시너지 약물 조합의 나노 제형으로 치료.

Abstract

조합 화학요법은 자주 사용 병원에서 암 치료; 그러나, 정상 조직에 관련 된 불리 한 효과 치료 혜택을 제한할 수 있습니다. 나노 기반 약물 조합 무료 약 조합 치료에 의해 발생 하는 문제를 완화 하기 위해 표시 되었습니다. 우리의 이전 연구는 그 두 항 암 약물, 독 소 루비 (DOX) 및 미토마이신 C (MMC)의 조합, 두 murine에 대 한 시너지 효과 생산 하 고 인간의 유방암 세포 생체 외에서. DOX 및 MMC 공동 로드 폴리머-지질 하이브리드 나노 입자 (DMPLN) 다양 한 경과 전송 펌프 multidrug 저항 및 유 방 종양 모델에 설명 된 향상 된 효능을 부여 하는 무시 됩니다. 기존의 솔루션 형태에 비해, DMPLN의 이러한 우수한 효능 DOX 및 MMC nanocarrier pln.로 활성화 하는 종양 세포 내 생체 이용률 증가 세포내 약물의 동기화 된 약물 동력 학에 기인 했다

약 동학 및 바이오-분포의 평가를 공동 관리 DOX 및 MMC 무료 솔루션에 나노 형태, 역 상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는을 사용 하 여 간단 하 고 효율적인 다중 약물 분석 방법 개발. 달리는 플라즈마에 DOX 또는 MMC를 개별적으로 분석 하는 방법에 대 한 이전에 보고 된,이 새로운 HPLC 방법은 동시에 quantitate DOX, MMC 및 주요 심장 독성 DOX 대사 산물, 다양 한 생물 학적 행렬 ( 에서에서 doxorubicinol (DOXol), 수 예를 들어, 전체 혈액, 유 방 종양, 및 심 혼). 이중 형광 및 자외선 흡수 성 조사 4-methylumbelliferone (4-무) 다른 검출 파장 다중 약물 분석의 단계 검출을 위한 내부 표준 (윙하)으로 사용 되었다. 이 방법은 성공적으로 DOX 및 MMC 전체 혈액에 나노와 솔루션 접근 및 orthotopic 유 방 종양 murine 모델에서 다양 한 조직에 의해 전달의 농도 결정 하기 위해 적용 되었습니다. 제시 하는 분석 방법 약물 조합 중 나노 기반 배달의 전 임상 분석을 위한 유용한 도구입니다.

Introduction

아직 그것은 종종 심각한 부작용 및 약물 저항으로 인해 제한 된 효능 및 다른 요인^1,2,3관련 된 화학 요법 많은 암에 대 한 기본 치료 양식 적임 이다. 화학 요법의 결과 개선 하기 위해, 약물 조합 regimens 겹치지 독성, 약물 행동, 그리고 크로스 비 약물 저항^4,5 의 다른 메커니즘 같은 고려 사항에 따라 병원에 적용 된 ^{, 6}. 임상 시험에서 더 나은 종양 응답 속도 종종 관찰 되었다 약물 조합을 순차적 마약 배달^7,8의 처방에 비해 관리 동시에 사용 하 여. 그러나, 무료 약물 형태 중 최적의 바이오-분포, 인해 여러 약물의 동시 주입 치료 효과^9,,1011를 능가 하는 저명....

Protocol

모든 동물 실험 동물 관리 위원회의 대학 건강 네트워크 온타리오 암 연구소에 의해 찬성 하 고 캐나다 위원회 동물 관리 지침에 따라 실시 했다.

1. 생물학 견본 준비

1. 전체 혈액, 주요 기관, 수집 하 고 포함 하는 약물의 정 맥 (i.v.) 관리 후 정해진된 시간 포인트에서 종양을 유 정립 (예를 들어, DMPLN, 자주 DOX)
   1. 준비 포함 하는 약물 배합 유 방 종양 베어링 마우스 i.v. 주입.
   2. 흡입 가능 2 %isoflurane 밀폐 챔버에 제공 하 여 지정 된 시간-포인트 (예를 들어, 15 분)에서 마우스를 anesthetize.
   3. 마 취 마우스의 뒷면을 통해 지속적으로 공급 하는 2% isoflurane nosepiece는 코를 넣어.
      참고: 마우스 겪 습 깊은 마 취 되도록 부드럽게 대 타 마우스와 어떤 꿈 틀 운동에 대 한 보고의 앞 팔.
   4. 가슴 및 복 부 지역 70% 에탄올을 사용 하 여 철저 하 게 청소 한 다음 heparinized 1 mL 주사기 23 G 바늘을 사용 하 여 깊은 마 취 쥐에 심장 펑크의 터미널 절차 수행.
   5. 레이블이 나....

Results

두 항 암 약물, DOX MMC, 뿐만 아니라 DOX 대사 산물, DOXol, 동시에 형광 및 자외선 감지기는 윙하도 4-무를 사용 하 여 동일한 적용 된 그라데이션 HPLC 조건 하에서 어떤 생물 학적 간섭 없이 감지 했다. DOX, MMC, DOXol 및 4-무 잘 보존 시간 mmc 5.7 분, DOXol 위한 10.4 분, 4-뮤, 10.9 분 및 DOX (그림 2)에 대 일 분 서로에서 분리 했다. 전체 혈액에 각 약물 및 다양 한 조직 상관 관계 계수 (R²) 0.98에서 1.00 (그림 3 및 표 1)에 이르기까지 함께 농도 선형성을 보였다. DOX, DOXol 및 MMC의 정량 (LLOQ)의 하한값은 10 ng/mL, 10 ng/mL 및 100 ng/mL 전 혈 및 25 ng/mL.......

Discussion

한 번에 단일 약물의 탐지를 가능 하 게 다른 컬럼에 방법에 비해, 현재 HPLC 프로토콜은 동시에 변경 하는 필요 없이 동일한 생물학 매트릭스에 세 약 화합물 (DOX, MMC, 및 DOXol)을 quantitate 수 모바일 단계입니다. 약 동학 및 바이오-2 나노 기반 약물 전달 시스템의 배포를 확인 하려면이 준비 및 분석 방법은 성공적으로 적용 (즉, 자주 DOX와 DMPLN)²². 이후 PEGylated 나노 연장 시간의 오랜 기간 동안 높은 혈액 약물 농도 결과로 로드 된 약물의 전신 순환 (> 24 h), 설명된 컬럼에 메서드는 큰 규모의 샘플 분석을 위한 비용 효율적인 전 임상 연구²²나노 공동 로드 약물 조합. 무료 DOX 솔루션 및 자주 DOX 그림 4A 의 약 동학은 설치류

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
독소루비신	Polymed Theraeutics	111023	항암제
Mitomycin C	Polymed Theraeutics	060814	항암제
Doxorubicinol (DOXol)	토론토 연구 화학물질	D558020
4-Methylumbelliferone 나트륨 염의 대사산물	Sigma-Aldrich	M1508	내부 표준
Myristic Acid	Sigma-Aldrich	544-63-8	폴리지질 하이브리드 나노입자용 재료
폴리옥시에틸렌 (100) 스테아레이트	스펙트럼	M1402	폴리지질 하이브리드 나노입자용 재료
폴리옥시에틸렌 (40) 스테아레이트	시그마-알드리치	P3440	폴리지질 하이브리드 나노입자용 재료
Pluronic F68 (PF68)	BASF Corp.	9003-11-6	폴리 지질 하이브리드 나노 입자
재료 초음파 (UP100H)	Hielscher, 초음파 기술	NA	나노 입자 준비
수조 (ISOTEMP 3016HS)	Fisher Scientific	NA	나노 입자 준비
Liposomal Doxorubicin  (케일릭스)	Janssen	약국에서 구매 Princess Margaret Hospital	임상적으로 승인된 나노 입자 제형
HPLC 등급 메탄올	Caledon Chemicals	6701-7-40	HPLC 이동상 구성
HPLC 등급 H2O	Caledon Chemicals	8801-7-40	HPLC 이동상 조성
HPLC 등급 아세토니트릴	Caledon 화학	물질 1401-7-40	HPLC 이동상 조성
Trifluoroacetic 산	시그마 - 알드리치	302031	HPLC 이동상 조성
0.45 μ m 나일론 멤브레인 여과지	Whatman	WHA7404004	HPLC 이동상 준비
1cc 플라스틱 주사기	Becton, Dickinson and Company	2606-309659	처리 주입
5cc 플라스틱 주사기	Becton, Dickinson and Company	2608-309646	조직 수집
30G 1/2 바늘	Becton, Dickinson and Company	305106	치료 주입
25G 5/8 바늘	Becton, Dickinson and Company	305122	조직 컬렉션
멸균 0.9% 식염수	토론토 대학 하우스 브랜드	1011	조직 관류
13 ml 둥근-바닥 원뿔형 튜브	SARSTEDT	62.515.006	프로리프롤렌, 조직 균질화
알파 최소 필수 배지(MEM)	Gibco	12571063	Cell medium
1 x 인산염 완충액 식염수	Gibco	10010023	조직 균질화
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100 ML	조직 균질화
Formic acid	Caledon Chemicals	1/5/3840	추출 용매를 위해 pH 조정
헤파린 나트륨 스프레이 플라스틱 튜브	Becton, Dickinson and Company	367878	혈액 채취
분석 계량 저울	싸토리우스	CPA225D	NA
pH 미터	Fisher Scientific	13-637-671	Accumet BASIC
Vortex Mixter	Fisher Scientific	02-215-365	원하는 속도로 샘플 볼텍싱
1.5 ml  마이크로 원심분리기 튜브	Fisherbrand	2043-05408129	Prolyprolene
모델 1000 균질화기	Fisher Scientific	08-451-672	조직 균질화
원심분리기 5702R	Eppendorf	5702R	추출 준비
가열식 증발기 시스템	Glas-Col	NA	샘플 재구성
HPLC 나사산 바이알	DIKMA	5320	HPLC 샘플 주입
HPLC 스크류 캡과 PTFE 화이트 실리콘 격막	DIKMA	5325	HPLC 샘플 주입
HPLC 폴리프로필렌 인서트	Agilent Technologies	5182-0549	최대 볼륨 250 μ l, HPLC 샘플 주입
Xbridge C18 Column	Waters Corporation	186003117	약물 분석
그라디언트 펌프	Waters Corporation	W600	약물 분석
자동 샘플러	Waters Corporation	W2707	약물 분석
포토다이오드 어레이 검출기	Waters Corporation	W2998	약물 분석
멀티 λ 형광 검출기	Waters Corporation	W2475	약물 분석
EMPOWER 2	Waters Corporation	NA	데이터 분석 소프트웨어
과학자	Micromath	NA	약동학 분석
Female Balb/c Mice	Jackson Laboratory	001026	In vivo
EMT6/WT 유방암 세포	Ian Tannock 박사 제공; 온타리오 암 연구소	NA	In vivo