CRISPR/Cas9 복잡 한 Pronuclear를 주입 하 여 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터의 생산

요약

클러스터의 pronuclear (PN) 주입은 정기적으로 짧은 구조 반복 (CRISPR) interspaced 그리고 CRISPR 관련 단백질-9 nuclease (CRISPR/Cas9) 시스템은 생산 하는 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터는 매우 효율적인 방법. 여기, 우리는 유전자 녹아웃 햄스터 CRISPR/Cas9 시스템의 생산에 대 한 자세한 PN 주입 프로토콜을 설명합니다.

초록

Pronuclear (PN) 주입 기술 1 셀 단계 배아의 pronuclei로 외국 유전 물질을 소개 하는 마우스에 처음 설립 되었다. 소개 유전 물질 배아 게놈으로 통합 하 고 외국 유전 정보 전송 주입된 태아의 어머니를 육성 하기 위해 유전자 변형 동물 생성 수 있습니다. 마우스에 성공, PN 주입 성공적으로 많은 다른 동물 종에 적용 되었습니다. 최근, PN 주입은 성공적으로 고용 되었다 유전자-수정 된 시 약을 소개 활동, 여러 실험실에서 사이트별 유전 수정 하 고 동물 농장을 CRISPR/Cas9 시스템 등. 마스터링 PN 주입 하 여 유전자 변형된 동물을 생산 하기 위해 microinjection 능력의 특별 한 세트, 뿐만 아니라 연구원 이해 해야 한다 재생산 생리학 및 동작의 대상 종 각 종족 고유 때문에 도전입니다. 예를 들어 시리아 황금 햄스터 배아는 독특한 PN 주입 기술을 우리의 그룹에 의해 최근 혁신까지이 종에 불가능 했다 그런 생체 외에서 요구 사항 처리. 우리의 종 수정 PN 주입 프로토콜, 우리는 여러 유전자 녹아웃 (KO)를 생성 하 고 모델 인간의 질병을 성공적으로 사용 되었습니다 (기) 햄스터를 쫓 고에 성공 했다. 여기 우리 햄스터, 배아 처리 조건, 배아 전송 절차, zygotes에 CRISPR/Cas9 복잡 한을 제공 하기 위한 PN 주입 절차를 설명 하 고 농업 유전자를 생산 하는 데 필요한 수정 햄스터.

서론

골든 시리아 햄스터 (Mesocricetus auratus) 생물 의학 연구에 대 한 가장 널리 사용 되는 설치류 중 하나입니다. 농업의 미 교육부에 따르면 약 100000 햄스터 동물 복지 행위 (http://www.aphis.usda.gov; 액세스에 의해 보호 종 중 총 실험 동물 사용의 13%, 2015 년에는 미국에서 사용 되었다 3 월 10 일, 2017).

햄스터는 다양 한 인간 질병의 연구에 다른 설치류에 여러 이점을 제공합니다. 예를 들어 햄스터에서 유도 된 N-nitrosobis(2-oxopropyl) 아민 (밥)의 histopathology 췌 장 ductal adenocarcinomas 비슷합니다 인간의 췌 장 종양, 밥 처리는 주로 쥐와 폐에서 갑 상선 종양, 간 종양에 유도 하는 동안 마우스¹. 햄스터는 작은 설치류 adenoviruses의 복제를 지원 하기 위해 발견, 때문에 그들은 또한 oncolytic 아 데 노비 루스 기반 벡터 및 안티 아 데 노 바이러스 약^2,,34테스트를 위한 선택의....

프로토콜

이 프로토콜에서 설명 하는 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 유타 주립 대학에 의해 승인 되었다 (IACUC 프로토콜: 2484). 이 프로토콜에서 사용 하는 햄스터는 성인 (나이의 6-10 주) LVG 스트레인 시리아 황금 햄스터. 모든 햄스터 Bioinnovation 센터, 유타 주립 대학에서 물고기에서 지 내게 됩니다. 실내 온도 23 ° C에서 설정, 습도 40-50%에서 설정 되 고 가벼운 주기 설정 14 L: 10 (빛: 어둠). 가능 하다 면, 살 균 기술로 배아 조작 및 surugical 절차를 수행 합니다.

1. sgRNA 및 Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) 준비

1. SgRNAs 절차에 따라 체 외에 전사 (자료 테이블, 보충 1) 합성 키트 설명서에 설명 된 음성 합성.
2. Ribonucleoproteins 조립, 1 µ g의 sgRNA와 Cas9의 2 µ g을 혼합 하 고 10-15 분 동안 실내 온도에 믹스를 품 어. PN 주입, 100 ng / µ L Cas9, 50 ng / µ L sgRNA 10 m m 테 버퍼 (RNase 무료, 자료 테이블)의 농도에서 작업 ....

결과

다음 두 가지 중요 한 단계의 결과에 따라 유전자 변형된 햄스터를 생성에서 설명한 프로토콜의 효율성: 받는 사람 성과 의도 유전 수정 라이브 새끼 수의 라이브 출생 률. 출산 율은 배아 품질의 직접적인 결과 및 PN 사출 고 배아 전송 절차를 수행 하는 개인의 기술. 조작된 배아의 발달 잠재력 손상 되지 보장 하기 위해, 큰 관심은 햄스터 배아의 시험관에서 처리 하는 동안 필요 합니다. 우리는 정기적으로 pseudopregnant 받는 사람 여자와 라이브 출생 률의 60-80%를 얻을. 표 3 에서는 RAG1 녹아웃 실험에서 라이브 출생 률 (pseudopregnant 여성 사용 되었다) 및 STAT2 녹아웃 실험 (사실 임신 검은 암컷 사용 되었다;이 경우 출산 율으로 계산 했다는 새끼의 비율 황금 강아지 생산).

토론

더 나은 인간 질병의 모델로 시리아 황금 햄스터의 잠재력을 악용, 우리는 CRISPR/Cas9 복잡 한 햄스터 게놈을 대상으로 제공 하기 위한 PN 주입 프로토콜을 개발 했다. PN 주입 프로토콜 배아 배양, 온도 및 빛¹³의 파장을 포함 하 여 몇 가지 주요 변수를 최적화 합니다. 또한 성공적으로 햄스터에 유전자를 대상으로 실시 하기 위한 따라야 하는 여러 햄스터 관련 동물 처리 절차가 있다. 예를 들어 성적으로 성숙한 여성 햄스터 외 인 호르몬 (예: PMSG)와 동기화 될 수 없는 안정적인 4 일 estrous 사이클 있다. 따라서 각 여성의 estrous 사이클을 정확 하 게 추적 하는 것은 superovulation 및 pseudopregnancy 준비 중요 합니다. 30-그녀는 성공적으로 superovulated 경우는 여성에서 60 zygotes는 생산 수 있습니다. 성공적인 superovulation를 위해 지방 종의 증 착을 고려할 필요가 있다. 특히 그.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Cas9	Invitrogen	B25640	1 &뮤; 지/&무; L (~6.1 μ M)
GeneArtTM 정밀 합성 키트	Invitrogen	A29377	sgRNA 합성
알부민	Sigma	A1653	배양 매체용
조명기	Nikon	NI-150	배아 이식용
인큐베이터	New Brunswick	Galaxy 14S	배아 배양용
Microforge	Narishige	PB-7	주사 바늘 제작용
현미경	Nikon	ECLIPSE Ti-S	미세 주입 현미경
	invitrogen	SMZ745T	배아 이식 용
미네랄 오일	Sigma	M1840	어둠 보관
PMSG	Sigma	G4877-2000IU	과배란 용

인간 혈청의 용