생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

요약

프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

초록

이 프로토콜의 목적은 정화와 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모델 체 외에 모노 문화 (MC), 사이토 조절 매체 (ACM), MC에에서 pBECs에 기반을 확립 하 고 pBECs의 재배에 대 한 최적화 절차를 제시 하 고 비 접촉 공동 문화 (NCC)의 돼지 이다 또는 쥐 근원. pBECs 절연 되었고 국내 돼지 5-6 개월의 뇌 외피가에서 모세 혈관의 조각에서 경작. 이 파편 meninges, 격리 및 회색 문제, 여과, 소화 효소, 그리고 원심 분리의 균질의 주의 제거에 의해 순화 되었다. 더 오염 세포 제거, 모 세관 조각 puromycin 포함와 경작 했다 매체. 60-95% 합칠, 모 세관 조각에서 성장 하는 pBECs를 passaged 했다 때 투과 할 멤브레인 필터 삽입 하 고 모델에 설립. 장벽 압박감 및 BBB 특성 표현 형 pBECs의 증가, 셀 다음 차별화 요인으로 취급 했다: 막 permeant 8-CPT-캠프 (여기 약식된 캠프), 하이드로 코 티 손, 그리고 포스 억제제, RO-20-1724 (RO)입니다. 절차 9 월 11 일의 기간 동안 실시 됐다 그리고 NCC 모델을 설정할 때는 이다 2-8 주 사전에 교양 있었다. 프로토콜에서 설명 된 절차를 준수 제한이 paracellular 침투성와 내 피 층의 설립을 허용 했다, NCC 1249 ± 80 Ω cm ^{는 평균 transendothelial 전기 저항 (TEER)를 보여주는 모델 2}, 그리고 paracellular 침투성 (P_app) 루시퍼 노란색 0.90 10^-6 ± 0.13 10^-6 cm 초^-1 의 대 한 (± sem의 의미 n = 55). PBEC 표현 형이 더 평가 했다 5, 긴밀 접합 단백질 claudin의 좋은 표현 조-1, occludin 및 외화 접합 단백질 p120 catenin. 건강 및 질병에 BBB의 연구의 범위에 대 한 제시 하는 모델을 사용할 수 있습니다 그리고, 매우 제한적인 paracellular 침투성이이 모델은 전송 및 세포내 매매의 연구에 적합.

서론

세포의 구조와 기능 혈액-뇌 장벽에의

순환 및 중앙 신경 시스템 (CNS)의 인터페이스에서 BBB 역할 CNS microenvironment의 homoeostatic 컨트롤에 대 한 주요 규제 사이트는 적절 한 기능과 신경 시스템의 보호를 위해 필수적 이다. BBB 사이트는 혈관 루멘을 일렬로 세우는 내 피 세포. 뇌 모세 혈관, 내 피 세포는 복잡 한 세포 꽉 접합 형성 하 고 특정 유입 및 경과 전송기의 강하게 편광된 식 패턴은 혈액과 뇌 ¹사이 높은 특정 분자 전송 보장. 단단한 접속점 복합물의 구조 구성 요소는 occludin 및 claudin, zonula occludens (ZO) 단백질, cingulin에서 단백질을 포함 하 고 접합 접착 분자 (잼) 관련. Claudin 5 paracellular 접합 제한에서 특히 중요 하다. Pericytes, 이다, 신경 및 뇌 내 피 함께 세포 형태는 지하실 막를 포함 하 여 주변 셀와 동적 상호 작용을 포함 하는 유도 및이 특성 BBB 내 피 형의 유지 보수는 혈관 단위 (NVU)^2,3. 이러한 상호 작용에 관여 하는 메커니즘은 ....

프로토콜

돼지 두뇌 덴마크 식품 산업의 부산물으로 가져온. 덴마크어 Slaughterhouses 엄격한 감독 및 환경과 식품의 덴마크 내각에 의해 관찰 된다.

이다의 절연에 사용 되는 쥐 사육 되었고 덴마크어에 따라 수 의사의 검사에서 12/12 h 다크/라이트 사이클에 22 ° C-23 ° C의 주변 온도에서 로컬 동물 시설에 그룹 보관 실험실 동물에 대 한 규정입니다. 그들은 (1986 년 11 월 24 일의 유럽 공동체 위원회 지시 86/609/EEC); 동물의 윤리적 사용에 대 한 국제 지침 및 덴마크어 지침 희생 했다 전에 쥐 안락사 되었다. 아니 vivo에서 실험 동물 또는 인간 자료가이 실험에 사용 되었다.

참고: 다음은 정화 (단계 1), (2 단계) 재배 (3 단계) TEER 측정을 설명 하는 pBEC 주요 프로토콜. 이다와 NCC의 설치에 대 한 정화의 재배 쥐와 돼지 이다를 설명 하는 대체 protcol (4 단계) 제공 됩니다.

1. 돼지 뇌의 모세 혈관의 정화

1. 국내 돼지....

결과

모델 체 외에 BBB의 설립

제시, 최적화 된 방법에서 pBECs의 재배와 설립 투과성 막 삽입 시스템의 MC 또는 ACM 또는 NCC 없이 이다 (그림 1)와 수행 되었다 9 월 11 일 (그림 2)의 동안. 내 피 세포의 선택을 위해, 순화 된 모 세관 파편의 초기 문화 puromycin 최대 5 일 대부분 오염 세포를 제거 하 고 승진에서 스핀 들 모양의 내 피 세포의 성장에 대 한 치료와 함께 결합 된 모 세관 파편 (그림 3A-C). 하루 4-6, pBECs는 접촉 저해, 경도 정렬 셀으로 겹치지 않는, 성장 60-95%의 confluency에 확산 했다........

토론

정화와 pBEC의 확산

정화 절차 동안에 중요 한 단계는 meninges의 신속 하 고 효과적인 제거 및 정화 수율 및 순도 대 한 모델의 적절 한 설립에 대 한 중요 하다 흰색과 회색 물질의 분리를 포함 합니다. 모델에 대 한 제시 생체 외에서 BBB pBECs를 사용 하 여, 우리 향상 있고 고립 된 회색 물질, 크기-선택적 microvessels, 콜라와 소화의 격리에 대 한 필터링의 기계적 균질에 따라 정화 절차를 간소화 DNase 및 트립 신, microvessel 조각의 초기 문화. 일반적으로 정화 및 1 차 셀의 주요 과제 중 하나는 오염 세포의 제거 이다. 경험과 기본 뇌 내 피 세포의 정화는 meninges 및 백색 질 결과의 철저 한 제거 순도 모세의 수율 개선으로 내 피 세포 성장 및 BBB의 표현을 증가 표시 하고있다 특성입니다. 이러한 이유로, meninges 제시 프로토콜에서 (sulci 안에 포함)의 제거 및 arteriolar 동맥 부드러운.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
피브로넥틴	시그마-알드리치	F1141
콜라겐 IV	시그마-알드리치	C5533
폴리-L-라이신	시그마-알드리치	P1524
DMEM/F-12	론자	BE12-719F
DMEM/저혈당	시그마-알드리치	D6046
페니실린/스트렙토마이신	Gibco Invitrogen	15140
플라즈마 유래 혈청(PDS)	First Link UK Ltd.	60-00-89
소 태아 혈청 (FBS)	Gibco Invitrogen	10-270-106
Trypsin/EDTA	Gibco Invitrogen	15090-046
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001
8-CPT-cAMP	Biolog	C010
RO 20-1724	Sigma-Aldrich	B8279
겐타마이신 설페이	트 Lonza	17-518Z
DMSO	Sigma-Aldrich	34896
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
EtOH	VWR	20,824,296	의 70 % 용액을 혼합합니다.
		D4513
콜라겐 분해 효소 CLS2	시그마 알드리치	C6885
ddH2O			Elga 시스템
T75 플라스크로	Thermo Scientific	156499
Costar Transwell 인서트 (세포 투과성 멤브레인 인서트)	Costar	CLS3401	12-well 플레이트, 12mm 직경, 0.4 μ m 폴리카보네이트 멤브레인
15ml 원심분리기 튜브	Cellstar	188271
50ml 원심분리기 튜브	Cellstar	227261
페트리 접시	Thermo Scientific	150350
크라이오 바이알	Thermo Scientific	377224
500ml 병	Thermo Scientific	159910/159920
메스	Swann-Morten	REF0211	유형 24
조직 균질화 기	시그마	D9188
140 μ m 필터	MERCK	NY4H04700
40 μ m 필터	Corning	431750
EndOhm 챔버 시스템	World Precision Instruments	ENDOHM-12	EndOhm 챔버 12mm 배양 컵
EVOM2 전극 시스템	World Precision Instruments	300523+STX100C	견고한 STX-100C 전극 쌍이 있는 TEER 측정 시스템
긴 바늘	시그마		주사기에 부착
팁 곡선 집게	KLS Martin	12-409-12-07
넓은 팁 집게	VWR	82027-390
필터 홀더	MERCK Milipore	Swinnex-47
50 ml 주사기	Braun	4617509F
10 ml 주사기	Terumo	SSt20ESI
Anti-Occludin 항체	Abcam	ab31721	1:100
Anti-p120 카테닌 항체	BD Transduction laboratories	610133	1:200
Anti-ZO-1 항체	Invitrogen	61-7300	1:200
Anti-Claudin 5 항체	Sigma-Aldrich	SAB4502981	1:100
Alexa Flour 568과 결합된 당나귀 안티 토끼 IgG	Thermo Scientific	A10042	1:500
Alexa Flour 488	과 결합된 당나귀 안티 마우스 IgGThermo Scientific	A21202	1:500
자당	Perkin Elmer	NEC100X250UC	0.15µ l/ml 최종 작동 conc
Lucifer Yellow	Sigma	L0144	10 &마이크로; g/ml 최종 작동 conc