방법 논문

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

DOI:

10.3791/56277

⸱

2017년 9월 24일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

초록

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이 프로토콜의 목적은 정화와 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모델 체 외에 모노 문화 (MC), 사이토 조절 매체 (ACM), MC에에서 pBECs에 기반을 확립 하 고 pBECs의 재배에 대 한 최적화 절차를 제시 하 고 비 접촉 공동 문화 (NCC)의 돼지 이다 또는 쥐 근원. pBECs 절연 되었고 국내 돼지 5-6 개월의 뇌 외피가에서 모세 혈관의 조각에서 경작. 이 파편 meninges, 격리 및 회색 문제, 여과, 소화 효소, 그리고 원심 분리의 균질의 주의 제거에 의해 순화 되었다. 더 오염 세포 제거, 모 세관 조각 puromycin 포함와 경작 했다 매체. 60-95% 합칠, 모 세관 조각에서 성장 하는 pBECs를 passaged 했다 때 투과 할 멤브레인 필터 삽입 하 고 모델에 설립. 장벽 압박감 및 BBB 특성 표현 형 pBECs의 증가, 셀 다음 차별화 요인으로 취급 했다: 막 permeant 8-CPT-캠프 (여기 약식된 캠프), 하이드로 코 티 손, 그리고 포스 억제제, RO-20-1724 (RO)입니다. 절차 9 월 11 일의 기간 동안 실시 됐다 그리고 NCC 모델을 설정할 때는 이다 2-8 주 사전에 교양 있었다. 프로토콜에서 설명 된 절차를 준수 제한이 paracellular 침투성와 내 피 층의 설립을 허용 했다, NCC 1249 ± 80 Ω cm 는 평균 transendothelial 전기 저항 (TEER)를 보여주는 모델 2, 그리고 paracellular 침투성 (Papp) 루시퍼 노란색 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 cm 초-1 의 대 한 (± sem의 의미 n = 55). PBEC 표현 형이 더 평가 했다 5, 긴밀 접합 단백질 claudin의 좋은 표현 조-1, occludin 및 외화 접합 단백질 p120 catenin. 건강 및 질병에 BBB의 연구의 범위에 대 한 제시 하는 모델을 사용할 수 있습니다 그리고, 매우 제한적인 paracellular 침투성이이 모델은 전송 및 세포내 매매의 연구에 적합.

서론

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세포의 구조와 기능 혈액-뇌 장벽에의

순환 및 중앙 신경 시스템 (CNS)의 인터페이스에서 BBB 역할 CNS microenvironment의 homoeostatic 컨트롤에 대 한 주요 규제 사이트는 적절 한 기능과 신경 시스템의 보호를 위해 필수적 이다. BBB 사이트는 혈관 루멘을 일렬로 세우는 내 피 세포. 뇌 모세 혈관, 내 피 세포는 복잡 한 세포 꽉 접합 형성 하 고 특정 유입 및 경과 전송기의 강하게 편광된 식 패턴은 혈액과 뇌 1사이 높은 특정 분자 전송 보장. 단단한 접속점 복합물의 구조 구성 요소는 occludin 및 claudin, zonula occludens (ZO) 단백질, cingulin에서 단백질을 포함 하 고 접합 접착 분자 (잼) 관련. Claudin 5 paracellular 접합 제한에서 특히 중요 하다. Pericytes, 이다, 신경 및 뇌 내 피 함께 세포 형태는 지하실 막를 포함 하 여 주변 셀와 동적 상호 작용을 포함 하는 유도 및이 특성 BBB 내 피 형의 유지 보수는 혈관 단위 (NVU)2,3. 이러한 상호 작용에 관여 하는 메커니즘은 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 짧은 기간에 BBB 침투성의 변조를 허용 하 고 장기 BBB 기능4유도 세포 사이의 화학 신호 교환 포함. 이다 특히 뇌 내 피 세포 표현 형을 위해 알려져 있으며 glial 파생 된 neurotrophic 요인 (영향을 미치는 세포내 캠프)5,6기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 등 규제 요인의 원천 날린7, 그리고 변형 성장 인자 (TGF-β) β8. 그러나 TGF-β의 효과, 토론된9되었습니다.

생체 내에서 생체 외에서 BBB에서

Vivo에서 학문 계속 BBB 생물학에 유용한 정보를 제공 합니다. 그러나, 셀 문화 모델 추가적인 통찰력을 제공 하 고 건강 및 질병에 BBB의 상세한 분자와 기능적인 측면을 이해 하는 데 유용한 도구를 구성할 수 있습니다. 세포 유형 및 BBB의 성분 사이 복잡 한 상호 작용 생체 외에서 모델에 완벽 하 게 달성 하기 어려운 있지만, 거기는 이후, 뇌 내 피 세포의 첫 번째 정화 및 모노 문화에서 이러한 응용 프로그램 10 , 11 , 12, BBB의 성장 조건과 정화 절차의 광범위 한 개발 문화 모델, vivo에서 방 벽을 더 닮 았의 결과 세포. 일반적으로 사용 되 체 외에 BBB 모델은 기초를, 돼지, 설치류 및 소 출신의 1 차 셀에 불멸 하 게 세포에. 각 모델은 서로 다른 장점과 단점이 있다. 비교 및 모델 선택에 대 한 유효성 검사 마커 BBB 효소, 운송업 자, 수용 체, 그리고 구조 단백질의 표현 등은 현재 설립된 모델1의 개요를 만드는 데 사용 됩니다.

프로토콜의 목표

BBB의 중요 한 기능 중 하나는 배리어 견고 하 고 높은 TEER 아직 사용 가능한 모델의 많은 수를 반영 하지 않습니다 잘 비보에 수준. 이 프로토콜의 목표 BBB 모델 체 외에서 높은 TEER 기본과 기본 pBECs MC 또는 ACM, 없이 또는 NCC에 기반을 구축 하는 방법을 제시 하는 여러 실험실에서 개발 및 최적화 기여를 통합, 쥐 또는 돼지 근원의 이다입니다. 적용된 절차와 모델의 설립 포함 오염 세포를 제거 하 고 BBB 표현 형으로 pBECs의 차별화를 개선 하기 위해 노력 합니다. 이 작품은 낮은 paracellular 침투성 및 주요 꽉 접합, 전송기, 단백질과 수용 체의 기능 표현의 좋은 안정적이 고 높은 TEER 모델의 설립에 결과 있다. 그러나,는 이다 뇌 내 피 세포 표현 형을 기여 하는 요소는, 문화의 세 가지 다른 조건 뇌 내 피 세포의 3 개의 다른 고기를 나타냅니다. NCC 모델은 최대한 표현의 BBB 특징은 약물 발견, 전송 및 세포내 매매에 관련 된 특정 전문된 메커니즘의 연구 뿐만 아니라 세포 세포 상호 작용의 조사를 위해 특히 유용 유리.

기원과 프로토콜의 역사

여기에 설명 된 pBEC 모델은 기반 사이 실험실 (런던)에서 개발 된 돼지 모델 닥터 루이스 모건과 동료, whichis는 성공적인 이전 소 뇌 내 피 세포 모델13을 기반으로 합니다. 셀 준비의 원래 방법이 이었다 나일론을 사용 하 여 2 단계 여과 순도 개선 하기 위해 subculturing 단계 뒤 microvessels를 잡으려고 메시. 메서드의 이전 개발에 최적의 BBB 표현 형 및 압박감 ACM을 포함 하 여 보충된 매체에 성장에 의해 달성 했다. 메서드에 추가 수정 R. 스키 너에 의해 맨체스터 영국14,15명. 로스웰 교수 실험실에서 만들어졌다. 메서드는 Abbott 실험실, KCL 런던, Patabendige 크게 이다 또는 ACM의 사용을 피 함으로써 그리고 puromycin와 pericytes와 같은 오염 셀을 제거 하 여 준비를 간단 하 게 했다 그것은 의해 채택 되었다. 첫 번째 서류 MC 모델은 vivo에서 BBB, 효과적인 단단한 접속점, 수용 체-중재 transcytosis16,17 , 막 교통 시스템 등의 여러 가지 중요 한 기능을 유지 확인 , 18 , 19 , 20. 미 Yusof 나중 다시 사이토 공동 문화를 시험 하 고 그것은 크게 향상 된 TEER, 그래서 이것이 기본 variant 애 보트 연구소21에서 현재 사용 발견. 모델 지금은 성공적으로 되었습니다 M. 닐슨 전송 오르후스, 추가 수정 되었습니다 연구소 소개 (이 프로토콜), 단순화 그레이 포함 하 여 중요 한 메쉬 여과 단계와 단일 필터 코팅 단계를 사용 하 여 추출 콜라겐과 fibronectin 결합. 돼지 이다 (이 프로토콜)의 절연을 위한 적용된 절차는 센 외22에 의해 설명 된 알 보 그에서 토니 무스 연구소에 의해 개발 된 프로토콜에 근거 했다. 아후 스에서 생성 된 모델의 다른 속성과 TEER 비슷합니다는 자신감 개념 모델과 실험실 사이 전송 쉽게 잘 주의 관찰 및 합리화 방법 단계에 응답을 하 신 다. 실제로, S. Yusof 이제는 열 대 국가 (말레이시아)23, 현지 조건 및 조직 소스에 대 한 추가 조정 관련 MC 모델을 설립 했다.

이점을 다른 방법 및 현재 설립 모델

소와 설치류의 뇌 내 피 세포에 비해, pBECs는 vivo에서 BBB 형 절연24다음의 손실의 낮은 속도의 이점을 제공 합니다. 또한, pBECs bEND.5 및 bEND.3 (50 Ω c m2) 같은 셀 라인의 monolayers에 대 한 일반적으로 보고 된 수준에 비해 MC (800 Ω cm2)16 에서 재배 하는 경우에 상대적으로 꽉 내 피 방 벽을 형성 할 수 있다 25 , 26 , 27, ㄷ (300-800 Ω c m2)28,,2930및 cerebEND (500 Ω c m2)29,,3132, 그리고 기본 뇌 마우스 (100-300 Ω c m2)의 내 피 세포ss = "외부 참조" > 33,,3435,36 및 쥐 (100-300 Ω c m2)37,38. 그러나,는 TEER 정화 및 문화 절차에 의존성을 보이고 있다. 대부분의 경우, ACM의 추가 또는 이다 공동 문화 내 피 레이어1의 견고에 증가 내 피 세포에 차별화 효과 보여줍니다. 그럼에도 불구 하 고, 자란 조건 최적화에 노력, 소 기반 모델 나타났습니다 TEER 값 돼지 기반 모델 (평균 800 Ω cm2 MC, 사이토 공동 문화에 2500 Ω c m2 )에 비해13 ,39,40,41,,4243,44,45. 모델 기본 소 뇌를 기반으로 내 피 세포 사이 및 실험실14,45,,4647,48, 내 큰 변화가 나타났습니다. 재현성에 문제가 있을 수 있습니다. 여기 보고 pBEC 모델에서 기여 실험실 낮은 가변성, 실험실 사이 매우 비슷한 TEER 그리고 paracellular 침투성 값 달성 했다. 따라서, 그것은 여기에서 설명한 메서드를 사용 하 여 낮은 변화 강력한 모델 확립에 다른 실험실에 대 한 가능 해야 합니다. 단단한 내 피 층을 형성, 뿐만 아니라 pBECs 모델 이전 검증 된 꽉 접합, 기능적인 BBB 전송기, 수용 체와 효소, 단백질과 연구15 의 범위에 대 한 시연된 적합성의 식에 의해 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. 또한, pBECs의 공동 문화에 게시 되지 않은 transcriptome 데이터 BBB 전송기와 수용 체 (미 발표 결과, 닐슨 그 외 여러분)의 예상된 프로필을 보여줍니다.

BBB 돼지-기반 모델에는 게놈, 해부학, 생리학, 더 이점이 있다 그리고 돼지의 질병 진행 반영 인간의 생물학60을 유리한는 기능에 대 한 다른 기존된 모델 보다 더 높은 학위에는 제약 산업입니다. 돼지 머리 고기 업계의 일반적인 부산물 이기 때문에, 그들은 두뇌의 쉽게 접근할 수 있는 소스는 실험에 필요한 한 돼지의 뇌에서 높은 정화 수확량을 제공 하는 동물의 수를 최소화 하는 내 피 세포 구성. 정화 및 1 차 셀의 다소 시간이 소요 되 고 표준화 모델 설정에 대 한 전문 지식이 필요로, 1 차 셀 가장 신뢰할 수 있는 BBB 모델을 생성 합니다. 불멸 하 게 셀 라인 수 없습니다 대신, 중요 한 속성으로 같은 수 장벽 압박감, 전송 식 프로필, 및 microenvironment 규칙 vivo에서실험 결과61, 를 반영 하지 않습니다. 62. 생체 외에서 모델 라이브 셀 높은 해상도 이미징, 목표를 사용 하 여 샘플링 또는 관찰 된 셀에 대 한 근접 접근 함으로써 세포내 프로세스의 시각화를 가능 하 게의 이점을 제공 높은 확대와 더 나은 광학 품질63. 이건 살아있는 동물에서 2 광자 현미경의 사용에 대 한 경우입니다. 또한, 생체 외에서 모델 transfect 세포, 태그 단백질의 시각화와 그들의 매매의 조사 하는 기능을 제공 합니다.

모델의 응용 프로그램

BBB의 기능 고정 되지 않습니다 하 고 동적으로 생리학과 병 리에 변조 될 수 있습니다. 신경를 포함 하 여 많은 신경 질환, 염증 성 및 전염 성 질병, 장애 및 BBB의 증가 된 침투성은 관찰64,,6566,67 . 감소 하 고 질병의 진행 및 후속 피해 방지, 식별 및 BBB의 변조를 기본 분자 메커니즘의 중요 한 중요성의 있습니다. 이러한 맥락에서 신뢰할 수 있는 생체 외에서 모델 높은 수요 제약 산업에에서 있는 고 BBB 침투성 CNS 약물의 예측에 중요 한 역할 게다가. 어떤 체 외 모델 침투성 화면으로 제한적인 paracellular 통로, 순수 현실 셀 건축과 기능 표현의 전송 메커니즘68표시 되어야 합니다. 이전 연구16,17,의57, 그리고 paracellular 침투성 및 여기 TJ 고에 단백질의 표정에 의해 입증, 제시 모델 이러한 모든 조건을 충족 하며 적합 BBB의 범위 두 정상 생리에서 및 병리학에서 연구입니다. 제시 정화 및 재배 방법의 강점 단순의 조합을 포함 하 고 재현성 및 astrocytic를 포함 하는 기능 결과 강력 하 고 신뢰할 수 있는 높은 TEER 생체 외에서 BBB 모델 영향. 이 대 한 목적, 돼지의 이다 고 쥐 원점 비슷한 방식으로22에 pBECs의 BBB 표현 형을 증가 시키기 위해 표시 되었습니다.

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프로토콜

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돼지 두뇌 덴마크 식품 산업의 부산물으로 가져온. 덴마크어 Slaughterhouses 엄격한 감독 및 환경과 식품의 덴마크 내각에 의해 관찰 된다.

이다의 절연에 사용 되는 쥐 사육 되었고 덴마크어에 따라 수 의사의 검사에서 12/12 h 다크/라이트 사이클에 22 ° C-23 ° C의 주변 온도에서 로컬 동물 시설에 그룹 보관 실험실 동물에 대 한 규정입니다. 그들은 (1986 년 11 월 24 일의 유럽 공동체 위원회 지시 86/609/EEC); 동물의 윤리적 사용에 대 한 국제 지침 및 덴마크어 지침 희생 했다 전에 쥐 안락사 되었다. 아니 vivo에서 실험 동물 또는 인간 자료가이 실험에 사용 되었다.

참고: 다음은 정화 (단계 1), (2 단계) 재배 (3 단계) TEER 측정을 설명 하는 pBEC 주요 프로토콜. 이다와 NCC의 설치에 대 한 정화의 재배 쥐와 돼지 이다를 설명 하는 대체 protcol (4 단계) 제공 됩니다.

1. 돼지 뇌의 모세 혈관의 정화

  1. 국내 돼지에 게 (예: 근처 도살에서) 5-6-개월에서 8-10 두뇌를 수집 하 고 실험실에 얼음에 그들을 전송. 동물의 종료의 2-3 h에서 다음 정화 절차를 시작 하는 것이 좋습니다.
  2. 살 균 흐름 도구에 머리를 놓고 부드럽게 얼음에 비 커에 1 L PBS와 함께 그들을 씻어합니다
  3. 신중 하 게 파인 팁 집게를 사용 하 여 한 번에 하나의 두뇌에서 meninges를 제거 하 고 얼음에 PBS를 가진 또 다른 1 리터 비 커에 meninges 무료 두뇌를 전송. 시간 확장 제거 복잡 해질 수 있습니다. 각 두뇌에 사용 되는 대략적인 시간 10-15 분 해야 합니다.
  4. 메스를 사용 하 여 한 번에 하나의 두뇌에서 회색 물질을 긁어와 접시 (8.8 cm 2) 20 mL DMEM 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12) 얼음에 포함 된 격리 된 자료 전송. 백색 질 물자를 철수 하지 않고 가능한 많은 회색 물질로 격리 합니다. 초기 조각화에 대 한 회색 물질 소재 바늘 없는 50 mL 주사기를 통해 실행 합니다. 모든 두뇌에 대 한 계속 하 고 수집 된 회색 물질 자료 수영장. 시간 확장 제거 복잡 해질 수 있습니다. 각 두뇌에 사용 되는 대략적인 시간 10-15 분 해야 합니다.
  5. 는 DMEM/F-12 미디어와 50: 50의 비율로 소형 조직 균질 화기의 분쇄기 튜브 절연된 회색 물질 자료 전송. 8 선 위아래로 꽉 유 봉과 뒤 느슨한 유 봉과 선 위아래로 8 함으로써 자료를 균질. 재료 무 균까지 모두 격리 계속 하, 500 mL 병에는 homogenate 전송 DMEM/F-12 약 450 mL 전체 볼륨을 희석.
  6. 필터 홀더를 가진 500 mL 블루 모자 병 및 140 µ m 필터 메쉬를 사용 하 여 homogenate를 필터 및 필터를 통해 조직을 실행 하 여 모세 혈관을 분리. Homogenate의 50 mL 당 하나의 필터를 사용 하 고 이후에 DMEM/F-12 각 필터를 세척.
  7. 장소 모 세관 포함 된 트립 신/EDTA (2.5 %trypsin, PBS에서 0.1 nM EDTA)의 소화 솔루션 접시 콜라 CLS2 필터 (2000 U/mL)와 DMEM/F-12에서 DNase (3400 U/mL) 1. 1 페 트리 접시 (8.8 cm 2, 20 mL 해결책)를 사용 하 여 3 필터 메쉬 당.
  8. 180 rpm에서 궤도 통에 1 시간 동안 37 ° C에서 배양 접시 또는 부드럽게 모든 10 분 저 어. 1 시간 후 1 mL 피 펫을 사용 하 여 배양 접시에서 서 스 펜 션 필터에서 모 세관 씻어.
  9. 2 50 mL 튜브 3 요리에서 현 탁 액을 분할 하 고 각 50 mL 튜브에 10 mL DMEM/F-12를 추가 하 여 소화를 중지.
  10. 원심 분리기는 세포 정지 250 x g, 4 ° C에서 5 분에 대 한 발음은 supernatants 고 다시 DMEM/F-12의 10 mL에 각 펠 릿을 중단. 각 튜브를 DMEM/F12의 추가 20 mL를 추가 합니다. 이 원심 분리기 단계를 반복 하 여 두 번.
  11. 튜브 5 분 동안 얼음에 진정 및 전송 솔루션 2 새로운 50 mL 튜브.
  12. 셀-정지 250 x g, 4 ° C에서 5 분간 원심 하 고 다시 냉동 솔루션 FBS에 10 %DMSO 구성의 8-10 ml (약 1 mL/두뇌 사용) 각 펠 릿을 일시 중지.
  13. 세포 현 탁 액 cryovials, cryovial 당 1 mL를 사용 하 여 전송. 평균적으로, 한 정화 두뇌 사용, 평균 12-16 삽입에 대 한 내 피 세포를 제공 당 1 유리병에 결과. 적어도 4 하룻밤까지 h-80 ° C에서 냉동 상자에 튜브를 놓습니다. 나중에, 액체 질소와 cryotank에는 cryovials를 저장.
    주의: 액체 질소는 매우 낮은 온도. 적절 한 보호를 착용 하십시오.

2. 기본 pBECs (8-10 일)의 재배

  1. 초기 문화 (3-5 일)
    1 일
      pBECs의 첨부 파일에 대 한 조건을 최적화 하
    1. 마지막으로 솔루션을 추가 하 여 T75 플라스 크의 코팅을 수행 콜라겐 IV의 농도 (150 µ g/mL) 및 fibronectin ddH 2 O 확인 솔루션 전체 표면을 커버 하 고 플라스 크를 (50 µ g/mL). 10 mL를 사용 하 여 각 T75 플라스 크에 대 한. 2 h. 위해 37 ° C에서 품 어
      참고: 코팅 수 있습니다 사용의 바로 전에 또는 1 주일 전에 수행 되며 4 ° c.에 PBS를 가진 저장 코팅 건조 하지 해야 합니다, 또는 그것은 더 이상 적합 한 부착 및 성장 표면 형성 합니다.
    2. PBEC 성장의 준비 16 mL 매체 DMEM/F-12의 구성 된 보충 10% 플라스마 파생 된 혈 청 (PDS), 페니실린 (100 U/mL), 스 (100 µ g/mL), 및 헤 파 린 (15 U/mL). 내 피 세포에 대 한 선택에 puromycin (4 µ g/mL)와 매체를 보충. Puromycin 치료만 5 일의 최대 사용 될 수 있다는 점에 유의.
    3. 약 6 mL와 10 mL 두 15 mL 튜브에 볼륨으로 준비 된 매체 수.
    4. 액체 질소 (단계 1.13)에서 모세 혈관으로 유리병을 지참 하 고 37 ° C 물 목욕의 사용 하거나 6 mL 약 수에서 준비 된 매체의 750 µ L을 추가 하 여 모세를 녹여. 매체를 추가 하 여 해 동 하는 경우 신중 하 게 녹여 현 탁 액을 균질 하도 여기저기 플라스틱. 동 때 세포 현 탁 액 aliquot 6 mL 매체에 전송.
    5. 250 x g, 7 분에 대 한 4 ° C에 아래로 모세 혈관 회전 고정 매체를 제거 하려면
    6. 신중 하 게는 상쾌한 발음 하 고 다시 10 mL 약 수의 1-2 mL에 펠 릿을 중단. 때 다시 일시 중단, 전송 솔루션 aliquot 10 mL 매체.
    7. 코팅된 T75 플라스 크를 모 세관 현 탁 액을 전송 하 고 부드럽게 표면에 동등 하 게 분배 되도록 플라스 크를 기울기. 37 ° c, 5% CO 2 T75 플라스 크를 놓습니다.
      제 2 일
    8. 하룻밤 부 화 후 10 mL pBEC 성장 매체 puromycin (4 µ g/mL) 한 T75 플라스 크에 대 한 보충을 준비 하 고 수행 하는 중간 변경. 셀에 적용 된 모든 중간 솔루션은 사용 하기 전에 37 ° C에 미리 데워 진 수 한다.
      참고: 또는, 중간 변경 될 수 있습니다 수행된 4-6 h 후 도금 모 세관 표면에 첨부 해야 하는 경우. 60-95% 합류 이루어집니다, 녹고에서 일반적으로 3-5 일 때까지 세포를 품 어. 여 보세요 하지 마십시오정지 수 접촉 금지를 피하기 위해 100% 합류에 도달 w 셀 추가 셀 성장.
      제 4-6 일
    9. 원하는 confluency를 달성 하는 때 통로 내 피 세포 투과성 막 삽입 (섹션 2.2 참조). 원하는 confluency 4 일에 달성 하지, 매체의 변경 수행 됩니다. 6 일에 최신에 세포 투과성 막 삽입에 passaged 한다. 필요한 confluency 주 6에 의해 달성 되지 않은, 경우 세포 실험 사용에 적합 하지 않습니다.
      참고: 준비의 NCC 위한 이다: 공동 문화 모델, 2-설정 하는 경우 8 주 된 이다 문화 (섹션 4 참조)에 삽입 하는 내 피 세포를 뿌리고 전날에 중간 변화를 수행 하 여 공동 문화 모델에 대 한 준비 되어야 한다. 각 사이토는, 사이토 성장 매체의 1500 µ L를 준비 DMEM 구성 된 낮은 포도 당 보충 10 %FBS, 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 µ g/mL)와 중간 변경 수행.
  2. 투과성 막 삽입 (5 일)에 pBECs의 성장
    하루 4-6
    1. 준비 투과성 막 삽입 (1.12 c m 2 면적, 0.4 µ m 숨 구멍의 삽입과 12-잘 접시)에 대 한 pBEC의 콜라겐 IV와 코팅에 의해 시드 (500 µ g/mL) 및 fibronectin (100 µ g/mL) ddH 2 각각 O. 사용 약 300 µ L에에서 넣고 솔루션 전체 성장 표면을 덮어 다는 것을 확인. 37 ° C, 5% CO 2 2 헤의 최소에서 품 어
    2. PBEC 성장 매체의 30 mL를 준비 (미디어 구성 섹션을 참조 2.1.2) puromycin 없이.
    3. T75 플라스 크에서 pBEC 문화에서 중간 및 실 온에서 5 mL 살 균 PBS를 가진 두 번 부드럽게 세척 발음.
    4. 트립 신-EDTA 솔루션 (2.5 %trypsin, PBS에서 0.1 nM EDTA) T75을 2 개 mL를 추가 하 여 셀을 trypsinize 하 고 37 ° C, 5% CO 2 5-7 분에 플라스 크를 배치
    5. 뇌 내 피 세포를 분리 하려면 부드럽게 손끝, 플라스 크의 표면에 생존 하 고 더 강한 연결 pericytes을 떠나 결국 T75 플라스 크의 측면을 누릅니다. 시각적으로 분리 현미경으로 조사 한다. 80% 분리 관찰 하는 때 매체의 5 mL을 추가 하 여 trypsinization 중지.
    6. 셀 솔루션 15 mL 튜브를 사용 하 여 10 mL 피 펫 및 스핀 뇌 내 피 세포 250 x g, 7 분간 4 ° C에서 원심 분리 하 여 전송.
    7. 신중 하 게는 상쾌한을 제거 하 고 1 mL 중에 펠 릿을 resuspend. 일시 중단 하는 경우 추가 3 ml 전체 볼륨을가지고 매체의 더 2 mL
    8. 챔버 또는 자동 셀 카운팅 시스템 계산 셀을 사용 하 여 셀의 수를 수동으로 계산 하는 방법. 10 5 셀/mL 매체, 10 5 셀/삽입 x 1.1의 최종 시드 밀도 결과 x 2.2의 셀 솔루션 준비.
    9. 투과성 막 삽입에서 코팅 솔루션을 제거 하 고 각 삽입을 세포 현 탁 액의 500 µ L를 전송. 삽입 중 하나에, 유일한 매체를 추가 하 고로이 삽입을 사용 하는 '만 필터 ' TEER 측정 제어.
    10. 내 피 세포 MC, ACM, 함께 MC 또는 NCC와 설정 이다 다음과 같은 방식으로:
      1. 대 MC: 추가 1500 µ L pBEC 성장 매체/acm 투과성 막 삽입 아래 12-잘 접시의 당. 37 ° C, 5% CO 2에 침투성 막 삽입을 놓고 2 일 동안 품 어.
      2. 대 한 NCC: 사이토 성장 매체와 함께 새롭게 이다와 웰 스 전송 삽입 하루 전에. 37 ° C, 5% CO 2에 침투성 막 삽입을 놓고 2 일 동안 품 어.
        참고: 세 가지 모델의 하단 우물에서 다른 미디어 종류의 사용의 유의.
        하루 6-8
    11. 하루에 2, pBECs로 침투성 막 삽입에서 미디어 변경. 삽입, 당 pBEC 성장 매체의 500 µ L를 준비 하 고 신중 하 게 수행 셀 계층의 장애를 최소화 하기 위해 변경. 2 일에 대 한 셀을 품 어. 미디어 변경 삽입, 그리고 하단 우물에 수행 됩니다 것을 유의.
  3. 차별화 요소 (1-2 일)와 자극
    하루 8-10
    1. 각각 다른 모델에 대 한 자극 미디어 다음으로 준비 되어야 한다:
      1. 위한 MC: 각 삽입 하 고, 포함 된 캠프 (250 µ M), 날린 pBEC 성장 매체의 500 µ L를 준비 (550 nM)와 RO (17.5 µ M).
        MC: 준비 캠프 (250 µ M), 날린 포함 pBEC 성장 매체의 또한 1500 µ L (550 nM)와 RO (17.5 µ M).
        ACM와 MC: ACM의 1500 µ L를 해 동 하 고 캠프 (250 µ M), 날린 보충 (550 nM)와 RO (17.5 µ M).
      2. 대 한 NCC: 각 삽입에 대 한 준비 포함 된 캠프 (250 µ M), 날린 pBEC 성장 매체의 500 µ L (550 nM)와 RO (17.5 µ M). 각 사이토 잘에 대 한 준비 DMEM/F-12의 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 µ g/mL), 헤 파 린 (15 U/mL), 캠프 보충 (250 µ M), 날린 1500 µ L (550 nM)와 RO (17.5 µ M).
    2. 각각 다른 모델에 대 한 다음과 같은 미디어 교환 수행:
      1. 대 MC: 신중 하 게 우물과 삽입에서 매체를 발음 하 고 각 삽입 500 µ L를 사용 하 여 두 구획을 차별화 매체 추가 및 각 잘 1500 µ L입니다. 삽입의 어느 한쪽에 중단에 영향을 미칠 수 있으며 셀 레이어를 방해 수.
      2. 대 한 NCC: 신중 하 게 우물에서 매체를 발음 하 고 잘 당 750 µ L 차별화 매체를 추가. 조심 스럽게 삽입에서 매체를 발음 하 고 삽입 당 500 µ L 차별화 매체를 추가 합니다. 잘 각 사이토를 나머지 750 µ L 차별화 매체 추가.
    3. 모든 모델에 대 한: 37 ° C, 5% CO 2에서 셀을 배치 하 고 다음 날까지 차별화 매체와 품 어.
      참고: 알고 있어야 그 이다와 NCC에 대 한 이다 혈 청 자유로운 매체에 보관 하는이 시점에서.

3. TEER 측정

  1. 당일 차별화 매체와 자극 세포 챔버 rinsing 하 여 TEER 측정을 위한 조직 저항 측정 챔버 시스템을 준비 후 두 번 ddH 2 O, 한 번 70% EtOH 5 분 그리고 2 번 더 ddH 2 o.
  2. 조직 저항 측정 챔버에 DMEM/F-12의 4 mL를 추가 하 고, 시스템에 연결 하 고 다음 설정에 따라 약 30 분에 대 한 보정: R = 0, 테스트 R = 1000, 모드 = R.
  3. 신중 하 게 조직 저항 측정 챔버에 삽입을 배치 하 여 TEER 측정을 수행 합니다. 각 삽입에 대 한 3 중에서 측정을 수행 하 고 계산 하는 평균 Ω c m 2.
    참고: 공동 문화 모델 TEER 값은 도달할 것으로 예상 > 500 Ω c m 2. 적절 한 TEER 수준 측정 TEER의 첫날에 도달 하지, 새로운 차별화 요소를 추가 (캠프 (250 µ M), 하이드로 코 티 손 (550 nM)와 RO (17.5 µ M)) 다음 날에 다시 TEER 측정. 적절 한 수준을 달성 하는 때에 모델 계획 된 실험에 대 한 준비 되어야 합니다. 셀 TEER 측정 후 복구 하는 실험을 수행 하기 전에 적어도 3 h 동안 휴식 한다 다는 것을 유의 하십시오. 자극, 후 TEER 값 일반적 남아 24-48 h 적합 자극 후.
    참고: 또한 엄밀한 STX-100 C 전극 쌍을 사용 하 여 대체 하 고 빠른 방법이 모델 81에서 높은 TEER를 기록 합니다. 유연한 STX2 요소ctrode 쌍 제공 덜 신뢰할 수 있는 판독.

4. 비-접촉 공동 문화에 대 한 준비의 이다: 다른 방법

  1. 정화의 이다
    1. 각 쥐 두뇌 사용, 각 ddH 2 O에서에서 폴 리-L-리 신 (5 µ g/mL)의 10 mL를 추가 하 여 2 T75 플라스 크 코트 T75 플라스 크입니다. 30 분 동안 37 ° C에 플라스 크를 품 어
    2. 이다의 격리는 다음과 같이 수행할 수 있습니다:
      1. 이다 쥐:
        1. Decapitate 2 1-2 일 된 쥐를 승인 된 방법을 사용 하 여.
        2. 코 쪽으로 목에서 시작 하는 두개골에서 피부를 잘라내어 화살 절 개를 가진 뼈를 잘라.
        3. 두개골 곡선된 겸 자와, 뇌를 꺼내 열고 DMEM 낮은 포도 당 10 %FBS gentamycin 황산 (125 µ g/mL)와 보완의 11 mL 15 mL 튜브 (튜브 1)에 배치.
        4. 신중 하 게 meninges 파인 팁 집게를 사용 하 여 제거 하 고 뇌 자료 1 mL 피 펫을 사용 하 여 중단.
      2. 돼지 이다:
        1. 5 6 개월 국내 돼지에서 얻을 1 뇌.
        2. 파인 팁 겸 자 또는 손을 사용 하 여 뇌에서 meninges를 조심 스럽게 제거.
        3. 수집 4 g 회색의 뇌에서 중요 하 고 1-2 mL DMEM 낮은 포도 당 10 %FBS gentamycin 황산 (125 µ g/mL) 페 트리 접시에 보충에 조각을 놓으십시오. 조각 큰 경우 scalpels와 집게 말하다.
        4. DMEM 낮은 포도 당 10 %FBS gentamycin 황산 (125 µ g/mL) 11 mL의 총 볼륨을 보충와 함께 15 mL 관 (1 관) 및 채우기 이동 중단 1 mL 피 펫을 사용 하 여 절연된 소재.
        5. 계속 10 mL 주사기에 부착 된 긴 바늘으로 절연된 재료를 조직 하 고 3 번 아래로 중단. 큰 조각, 튜브의 하단에 정착 될 때까지 기다린 후 관 (1 관)의 상단에서 7 mL 매체 수집.
        6. 새 50 mL 튜브 (튜브 2)로 7 mL 세포 현 탁 액 40 µ m 나일론 필터를 통해 필터링.
        7. 추가 7 mL 튜브 1 두뇌와 매체. 균질 및 단계 4.1.2.2.5-6에서 여과 관 2에서에서 필터링 된 셀 서 스 펜 션의 볼륨은 약 35 mL 때까지 계속.
    3. T75 플라스 크 [4.1.1 단계]에서 코팅 솔루션을 제거. 5 mL PBS 폴 리-L-리 신을 가진 외피 세포는 코팅 솔루션의 모든 독성 효과 의해 감염 되지 않도록 하는 데 사용할 수 있습니다 후로 빠른 세척.
    4. 분할 하 고 씨앗 T75 플라스 크 사이 고립 된 사이토 솔루션. 37 ° C, 5% CO 2 3-5 일 동안에 플라스 크를 품 어.
  2. 경작 이다 및 내 피 세포 (3 주)와 함께 준비 NCC
    1. 초기 문화
      1. 외피의 3-5 일 후 신중 하 게 매체를 발음 하 고 10 mL을 추가 하 여 중간 변경 수행 DMEM 낮은 포도 당 10 %FBS gentamycin 황산 (125 µ g/mL)와 보완의.
        참고: 첫 번째 중간 변경 후 중간 바뀌어야 한다 매 5 일. 처음 2 주 동안은 플라스 크를 흔들어 하 고 매체를 변경할 때 셀 PBS 철저 하 게 세척. 이 오염 microglia의 제거에 에이즈.
      2. 재배의 3 주 후 각 T75 플라스 크의 하단에 트립 신-EDTA 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 여 셀을 trypsinize 하 고 37 ° C, 5% CO 2 5-7 분 대에 그들을 품 어
      3. 중간의 5 mL을 추가 하 여 trypsinization 15 mL 튜브에 셀 솔루션을 전송 멈추고 250 x g, 7 분에 대 한 4 ° C에 이다 원심
      4. 신중 하 게는 상쾌한을 제거 하 고 다시 10% DMSO FBS에 구성 된 솔루션에 셀 중단.
      5. 셀의 수를 계산 하 고 10 6 셀/mL x 4.0의 셀 솔루션을 준비 합니다. Cryovials 유리병 당 1 mL을 추가 셀 고정.
    2. 투과성 막 삽입 시스템 하단 웰 스 (2-12 주)에서 성장
      1. ddH 2 O 각 잘 폴 리-L-리 신 (5 µ g/mL)의 1 mL를 추가 하 여 12-잘 접시 이다의 성장을 위한 준비. 2 h. 위해 37 ° C에서 접시를 놓고
      2. 각 12-잘 접시 준비의 사이토 성장 매체 (DMEM 낮은 포도 당 보충 10 %FBS 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 µ g/mL)) 25 mL.
      3. 액체 질소에서 이다의 유리병을 지참 하 고 750 µ L DMEM 낮은 포도 당 매체를 추가 하 여 셀을 녹여. 신중 하 게 녹여 균질 정지를 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 해 동, 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 매체 7 mL의 총 볼륨 추가.
        주의: 액체 질소는 매우 낮은 온도, 그래서 착용 장갑 등 개인 보호.
      4. 250 x g, 7 분에 대 한 4 ° C에 아래로 모세 혈관 회전 고정 매체를 제거 하려면
      5. 신중 하는 상쾌한 발음 하 고 다시 셀 중간에 중단.
      6. 12 잘 접시의 우물에서 코팅을 제거 하 고 잘 당 1 mL 사용 하 우물에 세포 현 탁 액을 전송. 37 ° C, 5% CO 2에서 셀을 품 어.
      7. 3 매일 매체를 새로 고침 하 고 최소 2 주 전에 내 피 세포와 공동 문화에 대 한 셀을 사용 하 여 셀 문화. 녹고, 최적의 나이 되 고 2-8 주 후 최대 12 주 동안 공동 문화에 대 한 셀을 사용할 수 있습니다.

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결과

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모델 체 외에 BBB의 설립

제시, 최적화 된 방법에서 pBECs의 재배와 설립 투과성 막 삽입 시스템의 MC 또는 ACM 또는 NCC 없이 이다 (그림 1)와 수행 되었다 9 월 11 일 (그림 2)의 동안. 내 피 세포의 선택을 위해, 순화 된 모 세관 파편의 초기 문화 puromycin 최대 5 일 대부분 오염 세포를 제거 하 고 승진에서 스핀 들 모양의 내 피 세포의 성장에 대 한 치료와 함께 결합 된 모 세관 파편 (그림 3A-C). 하루 4-6, pBECs는 접촉 저해, 경도 정렬 셀으로 겹치지 않는, 성장 60-95%의 confluency에 확산 했다....

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토론

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정화와 pBEC의 확산

정화 절차 동안에 중요 한 단계는 meninges의 신속 하 고 효과적인 제거 및 정화 수율 및 순도 대 한 모델의 적절 한 설립에 대 한 중요 하다 흰색과 회색 물질의 분리를 포함 합니다. 모델에 대 한 제시 생체 외에서 BBB pBECs를 사용 하 여, 우리 향상 있고 고립 된 회색 물질, 크기-선택적 microvessels, 콜라와 소화의 격리에 대 한 필터링의 기계적 균질에 따라 정화 절차를 간소화 DNase 및 트립 신, microvessel 조각의 초기 문화. 일반적으로 정화 및 1 차 셀의 주요 과제 중 하나는 오염 세포의 제거 이다. 경험과 기본 뇌 내 피 세포의 정화는 meninges 및 백색 질 결과의 철저 한 제거 순도 모세의 수율 개선으로 내 피 세포 성장 및 BBB의 표현을 증가 표시 하고있다 특성입니다. 이러한 이유로, meninges 제시 프로토콜에서 (sulci 안에 포함)의 제거 및 arteriolar 동맥 부드러운...

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공개 사항

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저자는 충돌의 관심을 보고.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 엘리자베스 헬레나 Bruun, 사라 크리스틴 크리스텐슨, 기술 지원, 닐스 M. Kristiansen를 인정 하 고 Lundbeck 재단 번호 R155-2013-14113를 부여.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
피브로넥틴시그마-알드리치F1141
콜라겐 IV시그마-알드리치C5533
폴리-L-라이신시그마-알드리치P1524
DMEM/F-12론자BE12-719F
DMEM/저혈당시그마-알드리치D6046
페니실린/스트렙토마이신Gibco Invitrogen15140
플라즈마 유래 혈청(PDS)First Link UK Ltd.60-00-89
소 태아 혈청 (FBS)Gibco Invitrogen10-270-106
Trypsin/EDTAGibco Invitrogen15090-046
HeparinSigma-AldrichH3393
PuromycinSigma-AldrichP8833
HydrocortisoneSigma-AldrichH4001
8-CPT-cAMPBiologC010
RO 20-1724Sigma-AldrichB8279
겐타마이신 설페이트 Lonza17-518Z
DMSOSigma-Aldrich34896
PBSSigma-AldrichD8537
EtOHVWR20,824,296의 70 % 용액을 혼합합니다.
D4513
콜라겐 분해 효소 CLS2시그마 알드리치C6885
ddH2OElga 시스템
T75 플라스크로Thermo Scientific156499
Costar Transwell 인서트 (세포 투과성 멤브레인 인서트)CostarCLS340112-well 플레이트, 12mm 직경, 0.4 μ m 폴리카보네이트 멤브레인
15ml 원심분리기 튜브Cellstar188271
50ml 원심분리기 튜브Cellstar227261
페트리 접시Thermo Scientific150350
크라이오 바이알Thermo Scientific377224
500ml 병Thermo Scientific159910/159920
메스Swann-MortenREF0211유형 24
조직 균질화 기시그마D9188
140 μ m 필터MERCKNY4H04700
40 μ m 필터Corning431750
EndOhm 챔버 시스템World Precision InstrumentsENDOHM-12EndOhm 챔버 12mm 배양 컵
EVOM2 전극 시스템World Precision Instruments300523+STX100C견고한 STX-100C 전극 쌍이 있는 TEER 측정 시스템
긴 바늘시그마주사기에 부착
팁 곡선 집게KLS Martin12-409-12-07
넓은 팁 집게VWR82027-390
필터 홀더MERCK MiliporeSwinnex-47
50 ml 주사기Braun4617509F
10 ml 주사기TerumoSSt20ESI
Anti-Occludin 항체Abcamab317211:100
Anti-p120 카테닌 항체BD Transduction laboratories6101331:200
Anti-ZO-1 항체Invitrogen61-73001:200
Anti-Claudin 5 항체Sigma-AldrichSAB45029811:100
Alexa Flour 568과 결합된 당나귀 안티 토끼 IgGThermo ScientificA100421:500
Alexa Flour 488과 결합된 당나귀 안티 마우스 IgGThermo ScientificA212021:500
자당Perkin ElmerNEC100X250UC0.15µ l/ml 최종 작동 conc
Lucifer YellowSigmaL014410 &마이크로; g/ml 최종 작동 conc
96 % EtOH DNAse 1 Sigma-Aldrich 제작 미세한

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