프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜의 목적은 정화와 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모델 체 외에 모노 문화 (MC), 사이토 조절 매체 (ACM), MC에에서 pBECs에 기반을 확립 하 고 pBECs의 재배에 대 한 최적화 절차를 제시 하 고 비 접촉 공동 문화 (NCC)의 돼지 이다 또는 쥐 근원. pBECs 절연 되었고 국내 돼지 5-6 개월의 뇌 외피가에서 모세 혈관의 조각에서 경작. 이 파편 meninges, 격리 및 회색 문제, 여과, 소화 효소, 그리고 원심 분리의 균질의 주의 제거에 의해 순화 되었다. 더 오염 세포 제거, 모 세관 조각 puromycin 포함와 경작 했다 매체. 60-95% 합칠, 모 세관 조각에서 성장 하는 pBECs를 passaged 했다 때 투과 할 멤브레인 필터 삽입 하 고 모델에 설립. 장벽 압박감 및 BBB 특성 표현 형 pBECs의 증가, 셀 다음 차별화 요인으로 취급 했다: 막 permeant 8-CPT-캠프 (여기 약식된 캠프), 하이드로 코 티 손, 그리고 포스 억제제, RO-20-1724 (RO)입니다. 절차 9 월 11 일의 기간 동안 실시 됐다 그리고 NCC 모델을 설정할 때는 이다 2-8 주 사전에 교양 있었다. 프로토콜에서 설명 된 절차를 준수 제한이 paracellular 침투성와 내 피 층의 설립을 허용 했다, NCC 1249 ± 80 Ω cm 는 평균 transendothelial 전기 저항 (TEER)를 보여주는 모델 2, 그리고 paracellular 침투성 (Papp) 루시퍼 노란색 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 cm 초-1 의 대 한 (± sem의 의미 n = 55). PBEC 표현 형이 더 평가 했다 5, 긴밀 접합 단백질 claudin의 좋은 표현 조-1, occludin 및 외화 접합 단백질 p120 catenin. 건강 및 질병에 BBB의 연구의 범위에 대 한 제시 하는 모델을 사용할 수 있습니다 그리고, 매우 제한적인 paracellular 침투성이이 모델은 전송 및 세포내 매매의 연구에 적합.
서론
세포의 구조와 기능 혈액-뇌 장벽에의
순환 및 중앙 신경 시스템 (CNS)의 인터페이스에서 BBB 역할 CNS microenvironment의 homoeostatic 컨트롤에 대 한 주요 규제 사이트는 적절 한 기능과 신경 시스템의 보호를 위해 필수적 이다. BBB 사이트는 혈관 루멘을 일렬로 세우는 내 피 세포. 뇌 모세 혈관, 내 피 세포는 복잡 한 세포 꽉 접합 형성 하 고 특정 유입 및 경과 전송기의 강하게 편광된 식 패턴은 혈액과 뇌 1사이 높은 특정 분자 전송 보장. 단단한 접속점 복합물의 구조 구성 요소는 occludin 및 claudin, zonula occludens (ZO) 단백질, cingulin에서 단백질을 포함 하 고 접합 접착 분자 (잼) 관련. Claudin 5 paracellular 접합 제한에서 특히 중요 하다. Pericytes, 이다, 신경 및 뇌 내 피 함께 세포 형태는 지하실 막를 포함 하 여 주변 셀와 동적 상호 작용을 포함 하는 유도 및이 특성 BBB 내 피 형의 유지 보수는 혈관 단위 (NVU)2,3. 이러한 상호 작용에 관여 하는 메커니즘은 ....
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프로토콜
돼지 두뇌 덴마크 식품 산업의 부산물으로 가져온. 덴마크어 Slaughterhouses 엄격한 감독 및 환경과 식품의 덴마크 내각에 의해 관찰 된다.
이다의 절연에 사용 되는 쥐 사육 되었고 덴마크어에 따라 수 의사의 검사에서 12/12 h 다크/라이트 사이클에 22 ° C-23 ° C의 주변 온도에서 로컬 동물 시설에 그룹 보관 실험실 동물에 대 한 규정입니다. 그들은 (1986 년 11 월 24 일의 유럽 공동체 위원회 지시 86/609/EEC); 동물의 윤리적 사용에 대 한 국제 지침 및 덴마크어 지침 희생 했다 전에 쥐 안락사 되었다. 아니 vivo에서 실험 동물 또는 인간 자료가이 실험에 사용 되었다.
참고: 다음은 정화 (단계 1), (2 단계) 재배 (3 단계) TEER 측정을 설명 하는 pBEC 주요 프로토콜. 이다와 NCC의 설치에 대 한 정화의 재배 쥐와 돼지 이다를 설명 하는 대체 protcol (4 단계) 제공 됩니다.
1. 돼지 뇌의 모세 혈관의 정화
- 국내 돼지....
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결과
모델 체 외에 BBB의 설립
제시, 최적화 된 방법에서 pBECs의 재배와 설립 투과성 막 삽입 시스템의 MC 또는 ACM 또는 NCC 없이 이다 (그림 1)와 수행 되었다 9 월 11 일 (그림 2)의 동안. 내 피 세포의 선택을 위해, 순화 된 모 세관 파편의 초기 문화 puromycin 최대 5 일 대부분 오염 세포를 제거 하 고 승진에서 스핀 들 모양의 내 피 세포의 성장에 대 한 치료와 함께 결합 된 모 세관 파편 (그림 3A-C). 하루 4-6, pBECs는 접촉 저해, 경도 정렬 셀으로 겹치지 않는, 성장 60-95%의 confluency에 확산 했다........
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토론
정화와 pBEC의 확산
정화 절차 동안에 중요 한 단계는 meninges의 신속 하 고 효과적인 제거 및 정화 수율 및 순도 대 한 모델의 적절 한 설립에 대 한 중요 하다 흰색과 회색 물질의 분리를 포함 합니다. 모델에 대 한 제시 생체 외에서 BBB pBECs를 사용 하 여, 우리 향상 있고 고립 된 회색 물질, 크기-선택적 microvessels, 콜라와 소화의 격리에 대 한 필터링의 기계적 균질에 따라 정화 절차를 간소화 DNase 및 트립 신, microvessel 조각의 초기 문화. 일반적으로 정화 및 1 차 셀의 주요 과제 중 하나는 오염 세포의 제거 이다. 경험과 기본 뇌 내 피 세포의 정화는 meninges 및 백색 질 결과의 철저 한 제거 순도 모세의 수율 개선으로 내 피 세포 성장 및 BBB의 표현을 증가 표시 하고있다 특성입니다. 이러한 이유로, meninges 제시 프로토콜에서 (sulci 안에 포함)의 제거 및 arteriolar 동맥 부드러운.......
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공개 사항
저자는 충돌의 관심을 보고.
감사의 글
저자 엘리자베스 헬레나 Bruun, 사라 크리스틴 크리스텐슨, 기술 지원, 닐스 M. Kristiansen를 인정 하 고 Lundbeck 재단 번호 R155-2013-14113를 부여.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 피브로넥틴 | 시그마-알드리치 | F1141 | |
| 콜라겐 IV | 시그마-알드리치 | C5533 | |
| 폴리-L-라이신 | 시그마-알드리치 | P1524 | |
| DMEM/F-12 | 론자 | BE12-719F | |
| DMEM/저혈당 | 시그마-알드리치 | D6046 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco Invitrogen | 15140 | |
| 플라즈마 유래 혈청(PDS) | First Link UK Ltd. | 60-00-89 | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Gibco Invitrogen | 10-270-106 | |
| Trypsin/EDTA | Gibco Invitrogen | 15090-046 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
| 8-CPT-cAMP | Biolog | C010 | |
| RO 20-1724 | Sigma-Aldrich | B8279 | |
| 겐타마이신 설페이 | 트 Lonza | 17-518Z | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 34896 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EtOH | VWR | 20,824,296 | 의 70 % 용액을 혼합합니다. |
| D4513 | |||
| 콜라겐 분해 효소 CLS2 | 시그마 알드리치 | C6885 | |
| ddH2O | Elga 시스템 | ||
| T75 플라스크로 | Thermo Scientific | 156499 | |
| Costar Transwell 인서트 (세포 투과성 멤브레인 인서트) | Costar | CLS3401 | 12-well 플레이트, 12mm 직경, 0.4 μ m 폴리카보네이트 멤브레인 |
| 15ml 원심분리기 튜브 | Cellstar | 188271 | |
| 50ml 원심분리기 튜브 | Cellstar | 227261 | |
| 페트리 접시 | Thermo Scientific | 150350 | |
| 크라이오 바이알 | Thermo Scientific | 377224 | |
| 500ml 병 | Thermo Scientific | 159910/159920 | |
| 메스 | Swann-Morten | REF0211 | 유형 24 |
| 조직 균질화 기 | 시그마 | D9188 | |
| 140 μ m 필터 | MERCK | NY4H04700 | |
| 40 μ m 필터 | Corning | 431750 | |
| EndOhm 챔버 시스템 | World Precision Instruments | ENDOHM-12 | EndOhm 챔버 12mm 배양 컵 |
| EVOM2 전극 시스템 | World Precision Instruments | 300523+STX100C | 견고한 STX-100C 전극 쌍이 있는 TEER 측정 시스템 |
| 긴 바늘 | 시그마 | 주사기에 부착 | |
| 팁 곡선 집게 | KLS Martin | 12-409-12-07 | |
| 넓은 팁 집게 | VWR | 82027-390 | |
| 필터 홀더 | MERCK Milipore | Swinnex-47 | |
| 50 ml 주사기 | Braun | 4617509F | |
| 10 ml 주사기 | Terumo | SSt20ESI | |
| Anti-Occludin 항체 | Abcam | ab31721 | 1:100 |
| Anti-p120 카테닌 항체 | BD Transduction laboratories | 610133 | 1:200 |
| Anti-ZO-1 항체 | Invitrogen | 61-7300 | 1:200 |
| Anti-Claudin 5 항체 | Sigma-Aldrich | SAB4502981 | 1:100 |
| Alexa Flour 568과 결합된 당나귀 안티 토끼 IgG | Thermo Scientific | A10042 | 1:500 |
| Alexa Flour 488 | 과 결합된 당나귀 안티 마우스 IgGThermo Scientific | A21202 | 1:500 |
| 자당 | Perkin Elmer | NEC100X250UC | 0.15µ l/ml 최종 작동 conc |
| Lucifer Yellow | Sigma | L0144 | 10 &마이크로; g/ml 최종 작동 conc |
참고문헌
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0 (0), 1-29 (2016).
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.
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