말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

요약

이 프로토콜 생체 외에서 인간 전 임상 모델의 주변 혈액 monocytes 배양 암 세포 osteoclast 상호 작용을 모방 하기 위해 유 방 암 세포 라인에서 osteoclastogenesis의 개발을 설명 합니다. 모델 뼈 전이 형성의 우리의 이해를 심화 하 고 향상 치료 옵션 사용 될 수 있습니다.

초록

종양 세포 및 뼈 세포 뼈 microenvironment에서 사이 누화 뼈 전이 형성의 메커니즘 이해 결정적 이다. 우리는 생체 외에서 완전히 인간의 전 임상 모델을 유방암 세포 및 osteoclasts로 차별화를 진행 하는 monocytes의 공동 문화를 개발 했다. 우리는 주변 혈액 건강 한 기증자 로부터 수집 된 샘플에서 시작 하는 osteoclastogenesis의 모델을 최적화. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) 처음 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 분리, 높은 밀도에서 시드 되었고 두 성장 인자 (GFs)을 추가 하 여 차별화 하는 유도: 핵 요인-κB ligand (RANKL) 및 대 식 세포의 수용 체 활성 콜로 니 자극 인자 (MCSF). 셀은 14 일 문화에 남아 다음 고정 고 다운스트림 분석 하 여 분석. Osteolytic 뼈 전이에 뼈에 암 세포 도착의 효과 중 하나는 osteoclastogenesis의 유도 이다. 우리는 따라서 GFs와 관련 하 여 암 세포의 분화 능력 연구 유방암 세포의 공동 문화 우리의 모델 도전. 암 세포 osteoclast 상호 작용을 공부 하는 간단한 방법 간접 공동 문화 조절된 매체 유 방 암 세포 배양에서 수집 하 고 신선한 매체와 혼합의 사용에 따라 수행 하는 것입니다. 이 혼합물 다음 osteoclast 차별화를 유도 하는 데 사용 됩니다. 우리는 또한 직접 공동 문화는 암에서 세포, monocytes 분화를 겪고 매체 공유와 분 비 요소를 교환 하는 방법을 최적화 합니다. 이것은 상당한 개선을 원래 간접 공동 문화 메서드를 통해 연구자는 두 종류의 세포 상호 작용을 관찰 하 고 암 세포와 osteoclasts 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 유방암에서 파생 된 씨 셀 라인을 전이성 뼈 microenvironment에 약물의 효과 연구 수 있습니다. 모델도 골다공증 또는 다른 뼈 조건 등 다른 질병 연구를 사용할 수 있습니다.

서론

뼈 질병^1,2,3의 과정에서 뼈 전이 개발 하는 환자의 20-25%와 폐, 유 방, 전립선 암, 등 기본 종양의 종류에 대 한 전이의 일반적인 사이트입니다. 특히, 유 방 암 환자의 70% 죽음⁴에서 뼈 전이의 증거를가지고. 종양 및 stromal 세포 상호 작용은 암 진행에 필수적인 기본 암에 보조 병 변. 뼈 microenvironment에서 유방암에서 osteolytic 뼈 전이 암 세포, 뼈 세포, 뼈 microenvironment 사이 발생 하는 병 적인 악순환의 설립에 따라 달라 집니다. 암 세포 뼈 재흡수^5,,67증가 뼈 균형을 방해.

정상 및 병 적인 조건에서 osteoclasts는 뼈 재흡수에 대 한 책임 셀 반면 osteoblasts, 입금 새로운 매트릭스에 새로운 뼈 대형⁸에 대 한 책임이 있습니다. Osteoclast 활동 RANKL, 사전 osteoclast 표면에 그것의 수용 체 순위를 바인딩하는 사전 osteoclast 퓨전, 차별화 성숙한 osteoclasts에 필요한 과정을 유도의 표현을 통해 osteoblasts에 의해 통제 된다. Osteoclastogenesis의 유도 뼈 재흡수를 증가합니다. Vivo에서 연구의 많은 수는 크게 뼈 전이 형성^9,,1011의 우리의 이해를 개선 했다. 유방암 세포 주 종양에서와 뼈 microenvironment에서 osteoclastogenesis 홍보 뼈 항상성 교란 하 고 뼈 재흡수⁸. 이 시나리오에서는 모든 분자 사이 상호 작용에 발생 하는 암 세포와 osteoclasts에 중요 한 중요성의. 이미 언급 했 듯이, vivo에서 쥐 모델에서 뼈 전이 형성의 메커니즘을 해명 되었습니다 했습니다. 그러나, 모든 vivo에서 동물 실험 윤리 위원회의 승인에 대 한 필요, 이외에 높은 비용 및 시간이 걸리는 방법을 포함 vivo에서 실험을 수행 하는 것 다른 몇 가지 단점이 있다. 몇몇 저자는 사전 osteoclasts 라는 RAW246.7^9,,1011의 murine 라인을 사용 하 여 osteoclastogenesis의 전 임상 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델을 결합 했다. 이 모델의 단점이 사실 셀 이미 사전 osteoclasts 되기 위해 최선을 다하고 있습니다 및 인간 근원의 하지 않습니다에서 줄기. 이러한 이유로, 변환 연구는 생체 외에서 완전히 인간의 전 임상 모델의 뼈 암 세포 상호 작용을 공부 하 여부에서 크게 유익할 수 있었다.

우리 osteoclastogenesis에서 생체 외에서 인간 주변 혈액 샘플^12,13에서 시작 하는 방법을 최적화 합니다. Osteoclasts는 monocytes는 존재, 이기는 하지만 작은 정도에, 말 초 혈액 샘플에서에서 파생. 단 세포는 먼저 구분 granulocytes 전체 혈액에 존재 하 고 적혈구에서 Ficoll 밀도 기울기; 그들은 다음 세포와 달리 플라스틱 기판에 그들의 능력 덕분에 선택 됩니다. 시드, 후 셀 14 일 동안 교양. MCSF 및 RANKL GFs monocytes에 먼저 대 식 세포로 그리고 osteoclasts^14,15차별화 하는 데 필요한 있습니다. RANKL은 osteoclastogenesis의 후반 단계에서 분화 과정을 유도 하는 데 사용 됩니다 반면 MCSF의 분석 결과, 전체 기간 동안 필요 합니다. 차별화의 초기 단계에서 MCSF monocytes 증식 및^14,15살아남을 수 있습니다. Osteoclastogenesis의 두 번째 부분에서, 세포 융합 및 osteoclasts, 고리에 걸 F의 특성 분포를 보여 주는 및 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정), 칼 시 토 닌 수용 체 등 특정 마커를 표현으로 성숙 (CTR) ^{14 , 15}. 우리의 방법을 일 7 ~ 14에서에서 실험 및 MCSF와 RANKL의 첫 번째 7 일 동안 monocyte 문화에 MCSF를 추가 구성 됩니다. 실험의 끝에, osteoclastogenesis로 아래 차별화 된 셀을 계산 하 여 분석 된다.

GFs에 의해 분화를 유도 하는 monocyte 문화는 우리의 전 임상 모델의 기초를 형성 한다. 우리 유방암 세포의 osteoclastogenic 힘을 더 잘 이해 하는 GFs 없이 공동 문화 시스템 최적화. 우리가 먼저 개발 간접 공동 문화 매체를 추가 하 여 (80% α-최소한의 필수 매체 (α-MEM)와 20% 조절 매체에서에서 수집 된 유방암 세포의 문화는 했다 셀에 약 90% 합칠 겪고 차별화¹² . (혈 청 부족 조건 하에서 수집 되지 않습니다) 바른된 매체 24 시간 후 수집 된 고 1: 4의 비율에 신선한 매체와 혼합. 바른된 매체 부정적인 제어에 관하여 상당한 osteoclast 차별화를 유도 한다. 그러나, 암 세포 및 뼈 세포 간의 상호 상호 작용에 대 한 정보는 손실 간접 공동 문화를 사용 하는 경우, 우리는 개선 우리의 시스템 직접 공동 문화를 수행 하 여. 우리는 0.4 µ M 삽입 및 단 세포 도금 했다 우물에 그들을 배치에서 암 세포를 시드. 이 메서드를 사용 하 여 셀 같은 매체를 공유 하 고 분 비 단백질을 교환 한다. 우리는 따라서 osteoclastogenesis 암 세포¹³에 의해 유도 된의 완전히 인간의 전 임상 모델을 만들었습니다.

이 시스템은 매우 다재 다능 하 고 다른 연구 목적, 예를 들면, 뼈 전이에 약물의 역할을 조사 하는 약리 연구에 사용 될 수 있습니다. 우리의 모델 효능과 뼈-타겟 요법 암 세포¹³의 뼈 microenvironment에 antitumor 약물의 행동의 메커니즘을 연구를 가능 하 게. 올바른 컨트롤 실험 설계, 즉, 암 세포와 개별적으로 경작 osteoclasts 쉽게 마약 활동에 공동 문화에 미치는 영향을 이해 하는 것 있습니다. 이 이렇게 공부 되 고 마약 대상 모두 암 세포와, 예를 들어, osteoclasts everolimus¹⁶때 더욱 흥미로운 됩니다. 이 모델은 또한 암 세포 및 뼈 세포 사이 상호 작용의 새로운 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.

프로토콜

인간 osteoclasts 준 서 면된 동의 연구에 참여 하는 건강 한 기증자의 PBMCs에서 분화 되었다. 연구 프로토콜 1964 헬싱키 선언에서 윤리적인 표준 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. osteoclast 차별화

참고: EDTA에 건강 한 인간 기증자 로부터 말 초 혈액 이나 버 피 코트를 수집. 말 초 혈액의 미만 20 mL를 사용 하지 마십시오. 버 피 코트는 들은 단 세포의 더 큰 풍부 때문에 바람직합니다. 메 마른 조직 문화 후드에 모든 다음 단계를 수행.

희석 EDTA 전 혈 1:1 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x

. 다시 잘 중단.
1. 레이어 림프 구 분리 미디어 (PBS 혈액: 림프 구 분리 미디어, 2:1) 50 mL 튜브에.
   1. 혈액 50 mL 튜브에 PBS에 희석의 30 mL를 플라스틱.
   2. 부드럽게 림프 구 분리 미디어의 15 mL 50 mL 튜브의 하단에 아래에 배치.
2. 실내 온도 (브레이크)에 10 분 동안 757 × g에서 원심 분리기.
3. 단 세포를 수집:
   1. agitating 없이 단 셀 5 mL 피 펫의 흰색 레이어를 수집 하 고 새로운 50 mL 튜브에.
   2. PBS의 20 mL와 함께 수집된 PBMCs 희석.
4. 는 PBMCs 세척:
   1. 실 온에서 5 분에 대 한 225 x g에서 원심 분리기.
   2. 튜브를 거꾸로 하 여는 상쾌한을 삭제 합니다. 한번 반복.
5. RBC 세포:
   참고: 셀 펠 릿 빨간색 이면 버퍼 솔루션 lysing 적혈구 세포 치료 (재료의 표 참조).
6. 얼음에 50 mL 튜브
1. 붉은 혈액 세포를 lysing 버퍼의 5 mL을 추가.
2. 는 적혈구 세포를 완료 하려면 3-5 분 기다립니다. 시간 적혈구 오염 정도 따라 다릅니다.
3. PBS의 20 mL를 추가 하 여 반응을 중지.
4. 원심 분리기에서 225 x g 실 온에서 5 분. 튜브를 거꾸로 하 여는 상쾌한 삭제.
   참고: 선택 사항: 아래에 설명 된 RBC 세포 수행 하는 경우는 PBMCs 세척.
7. 워시 PBMCs:
   1. 225 x g 실 온에서 5 분 동안에 20 mL의 PBS와 원심 분리기를 추가.
   2. 튜브를 거꾸로 하 여는 상쾌한 삭제.
8. 다시 완전 한 α-MEM (1% 글루타민 (초기 농도 100 X)와 10% 태아 둔감 한 혈 청 보충)에 셀 중단.
9. 는 Neubauer 챔버와 셀을 계산합니다.
   1. 빙 초 산에 샘플 1: 100 희석 및 희석의 10 µ L를 사용 하 여 셀.
   2. 두 번 이상 계산 및 계산 셀의 평균 총 수집을 복제의 의미.
10. 셀 접시:
    1. c m ² 당 750000 PBMCs의 농도에 세포 격판덮개.
    2. 5% CO ₂ 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터에 도금된 셀 저장.
       참고: 디자인 셀 정상 완전 한 α-MEM MCSF 또는 RANKL GFs. 기억 하십시오 적어도 3 기술에서 수행 하는 각 조건 없이 함께 취급 되는 부정적인 컨트롤을 포함 하는 실험을 복제 합니다. 3 생물 복제 수행.
11. GFs와 보완 매체 변경:
    1. 셀 시드 후 약 3 h를 기다릴 한 다음 피 펫 (200-1000 µ L) 파편, 첨부 되지 않은 세포와 적혈구를 삭제 하 여 매체를 제거.
       참고: 셀 분리를 피하기 위해 매체를 변경할 때 조심.
    2. 추가 새로운 완전 한 α-MEM MCSF의 20 ng/mL으로 보충 (500 µ L/잘).
       참고: 때 암 세포와 공동 경작, 씨 암 세포 PBMC 시드 후 하루.
12. 미디어 (α-MEM MCSF의 20 ng/mL로 보충) 2-3 일 마다 변경:
    1. 200-1000 µ L 피 펫에 의해 매체를 폐기.
    2. 200-1000 µ L 피 펫에 의해 추가 새로운 신선한 매체.
13. 셀 시드, 후 6-7 일 추가 20 ng/mL RANKL의 완전 한 α-MEM + MCSF.
14. 매체 변경 (완전 한 α-MEM + MCSF + RANKL) 매 2-3 일:
    1. 200-1000 µ L 피 펫과 매체를 폐기.
    2. 는 200-1000 µ L 피 펫과 새로운 매체를 추가합니다. 셀 시드 후 14 일 분화의 유도 중지.
    3. 폐기 매체와 PBS로 두번 세척.
15. Paraformaldehyde로 셀 수정:
    1. 셀 건조 두고.
    2. 추가 4 %paraformaldehyde (재료의 표 참조).
    3. 실 온에서 20 분 동안 품.
16. Paraformaldehyde 삭제와 PBS의 500 µ L로 두 번 세척.
    주의: Paraformaldehyde은 독성; 장갑, 마스크와 안경을 착용 하십시오.
17. 건조 세포 허용.
18. 수행 트랩 제조 업체에 따라 얼룩 ' s 지침 (재료의 표 참조).
19. 수동으로 확대 10 배; 현미경 osteoclast 같은 셀의 개수 NA 0.30.
    참고: Osteoclast 같은 셀 4 핵으로 트랩 + polycarion 셀으로 정의 됩니다.

2. 암 세포 배양

참고: SCP2 ¹⁷, 트리플 부정적인 인간에서 발생 하는 osteotropic 셀 라인 등 유 방 선 암 세포 라인의 종류와 실험을 수행할 수 있습니다 유 방 암 세포 선 (MDA-MB-231), 그리고 호르몬 수용 체 양성 세포 선 MCF7.

1. 75 cm ² 플라스 크에 단층으로 셀 문화.
   1. 75 cm ² 플라스 크에 씨앗 1000000 암 세포.
   2. 1% 글루타민과 10% 태아 둔감 한 혈 청 5% CO ₂ 분위기에서 보완 하는 완전 한 α-MEM 매체에서 37 ° C에서 셀 저장.
2. 약 90%의 confluency에서 셀 분리:
   1. 매체 폐기, PBS, 세척 및 PBS에 트립 신 1 X의 2-3 mL를 추가.
   2. 37에서 3-5 분에 대 한 셀을 품 어 ° c.
   3. 10 mL 피 펫, 효소 반응을 중지를 완전 한 매체의 8 mL을 추가 하 여 75 cm ² 플라스 크에서 분리 된 세포를 수집.
   4. 5 분에 대 한 225 x g에서 원심 분리기
3. 암 세포 세척:
   1. PBS의 10 mL을 추가.
   2. 5 분에 대 한 600 x g에서 원심 분리기
4. Neubauer 챔버와 암 세포를 계산.
   1. 암 세포를 두 번 이상 계산 및 계산 셀의 평균 총 수집을 복제의 뜻.

3. 직접 암 세포의 공동 문화 nd Osteoclasts 향해 Monocytes 겪고 차별화

1. 삽입 (기 공 직경 0.4 µ m)에서 암 세포를 씨앗:
   1. c m ² 당 4, 000 셀의 농도에 암 세포 씨.
   2. 37 ° C, 5% CO ₂에서 품 어.
      참고: 씨 암 세포 PBMC 0.4 µ m 삽입에 공동 문화 실험에 대 한 시드 후 날.
2. 준수를 셀 수 있도록 24 시간 대기.
3. 공동 문화 (1.10 부분의 프로토콜 참조)을 시작 하 되 문화 통해 문화를 삽입 하는 장소는 시드.
4. 미디어 완전 한 α-MEM와 2-3 일 마다 변경합니다.
   1. 200-1000 µ L 피 펫과 매체를 폐기.
   2. 추가 500 µ L 신선한 매체.
      참고: 공동 문화의 기본 목표는 암 세포의 osteoclastogenic 힘을 이해 하는, 따라서, GFs는 추가 되지 않습니다 α-MEM에. 각 실험에서 공동 문화, ne 포함gative 컨트롤 (1.10 프로토콜의 단계에서 참고)와 osteoclasts RANKL과 MCSF (암 세포)로 분화의 긍정적인 컨트롤입니다. 암 세포는 단 세포에 배치 되지 삽입에 시드 공동 문화의 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.
5. 공동 문화를 중지 하 고 암 세포를 사용 하 여 다운스트림 분석:
   1. 13 일 PBMC 시드 후와 암 세포를 뿌리기, 후 12 일 새로운 접시에 삽입 장소.
   2. 중지 암 세포 배양은 기초 다운스트림 분석 (내용 참조)을 수행할 수 있습니다.
6. 날 14, osteoclast 차별화를 중지 하 고 셀, 1.15 단계에서 보고 된 문제를 해결.
7. 수행 트랩 얼룩 즉시 또는 14-30 일 이내.
   참고: 선택적 얼룩: 트랩 + polycarion 셀 osteoclasts는 것인지 연구 클릭률, osteoclast 특정 마커를 감지 추가 얼룩 수행할 수 있습니다. F-말라 반지의 발견은 다른 osteoclast 특정 얼룩 분석 결과 ^{12 , , 13 14}.

결과

메서드는 쉽게 인간의 말 초 혈액에 monocytes osteoclasts를 구별 하기 위해 최적화 되었다. Monocyte 문화 암 세포, 암 세포의 뼈 전이에 osteoclastogenesis를 유지 할 수 있다 (문학¹⁸에서 같이) 확인을 경작 했다. Osteoclasts 암 세포에서 분화 하 고 GFs는 그림 1에 나와 있습니다. Osteoclast 같은 셀 있는 셀 4 이상의 핵 이며 트랩 (보라색 세포를) 얼룩이 지기에 대 한 긍정적인. Osteoclast는 정의 하는 데 사용 하는 핵의 수에 대 한 허용된 컷오프는 3¹⁸, 하지만 우리는 최소한 잘못 된 반응의 위험을 줄이기 위해 4를 사용 하기로.

모델은 oste...

토론

모델 전 임상 시험관에 암 세포 및 뼈 세포 사이 누화의 메커니즘을 공부 하 고 새로운 치료 전략을 만드는 데 사용할 수 있는 뼈 전이의 메커니즘을 식별 하기 위해 필요 합니다. 우리는 모델을 완벽 하 게 인간의 생체 외에서 인간 주변 혈액 (그림 3)에서 osteoclastogenesis의 개발. 방법론의 최적화 하는 동안 중요 한 포인트의 번호 식별 하 고 해결 했다. 첫 번째 씨앗을 단 세포의 수량을 우려. 현미경 조사에 의해 취득 하는 셀의 수만 거친 정량화는 림프 톨, monocytes, 후자 되 고 대상 셀 osteoclastogenesis 실험에 대 한 씨앗을 구분 하기가 어렵습니다. 우리 때문에 림프 톨 플라스틱 기판에 고착 하지 않는 및 따라서 대부분 매체의 첫 번째 변화에서 탈락 했다 monocytes를 식별할 수 있었다. 그것은 차별화, 특히 osteoclastogenesis는 사전 osteoclasts 해야 서로 융합 하 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
&알파; MEM	Euroclone	BE12-169F
글루타민	Life-technologies	ECB3000D
소 태아 혈청	Life-technologies	ECS0180DPR
hMCSF	Peprotech	300-25	보관 표시를 준수해야 합니다
hRANKL	Peprotech	310-01	보관 표시를 준수해야 합니다
Acid Phosphatase, 백혈구(TRAP) 키트	Sigma Aldrich	387 A
림프구 분리 매체	Biowest	L0560-100
적혈구 용해 완충액	SIgma	11814389001 ROCHE
Trypsin	EuroClone	COD. ECB3052D
파라포름알데히드 4% 수용액, EM 등급	전자 현미경 과학	157-4-100
MDA-MB-231 세포주	ATCC	, CRM-HTB-267
MCF7	ATCC,	HTB-22
트랜스웰	코닝	, 3470-Clear	: 이 인서트는 24웰 플레이트용입니다. 6.5 mm, 0.4 & M; 모공 크기