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방법 논문

로컬 컨트롤 표면 점착을 고르지 Nanopatterns Dendrimer 기반: Chondrogenic 차별화 하는 방법

6.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56347

⸱

2018년 1월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Department of Engineering Electronics, University of Barcelona (UB), 3Networking Biomedical Research Center (CIBER), 4Instituto de Investigacin Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Organic Chemistry, Universidad de Málaga (UMA), 5Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND, 6Unidad de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC), Grupo de Reumatolog ía, Instituto de Investigación Biomèdica de A Coruña (INIBIC), Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), Sergas, Universidade da Coruña (UDC), 7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), 8Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Cell Biology, Genetics and Physiology, Universidad de Málaga (UMA)

이 논문에서

요약

받는 dendrimer 기반 고르지 nanopatterns 로컬 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD) 표면 밀도의 나노 제어를 허용 하는 방법은 설명 하 고 세포 접착 및 chondrogenic 분화의 연구에 대 한 적용.

초록

세포 접착 및 차별화는 주요 효과가 지역 농도와 세포 외 기질 (ECM) 성분의 나노 처리에 의해 조절 된다. 여기에 우리가 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD)의 대규모 고르지 nanopatterns를 얻을 하는 방법을 제시-기능성된 dendrimers 로컬 RGD의 나노 제어를 허용 하는 표면 밀도. Nanopatterns dendrimers 다른 초기 농도에 솔루션에서의 표면 흡착에 의해 형성 된다 물 접촉 각 (CA), 엑스레이 광전자 분광학 (XPS), 특징 및 현미경 기법 같은 프로브 검색 주사 터널링 현미경 (STM)와 원자 힘 현미경 (AFM). 최소 interparticle 거리의 확률 컨투어 지도 의하여 AFM 이미지를 사용 하 고 세포 접착 반응 및 차별화와 그 때 상관 RGD의 로컬 표면 밀도 측정 됩니다. 여기에 제시 된 nanopatterning 메서드는 큰 표면 영역을 간단한 방식으로 확장 될 수 있는 간단한 절차입니다. 따라서 세포 배양 프로토콜을 완벽 하 게 호환 이며 셀에 농도 의존 효과 발휘 하는 다른 ligands에 적용할 수 있습니다.

서론

여기 우리는 간단 하 고 다재 다능 한 dendrimer 기반 nanopatterning 프로시저는 nanoscale에 로컬 점착의 제어를 허용 하는 세포 문화 서피스를 설명 합니다. ECM의 나노 세부 보도 되 고,1,2,3 , nanopatterning의 세포 접착 표면 접착4에 관련 된 세포 요구 사항에 대 한 깊은 통찰력을 제공 하고있다 5. 실험 micellar 리소 그래피 기반 nanopatterns를 사용 하 여 약 70의 임계값 공개 RGD 펩타이드 nanospacing, 세포 접착이 값6,,78 위에 상당히 지연 되 고에 대 한 nm 9. 이 연구는 또한 세포 접착9,,1011에 글로벌 ligand 밀도 보다 로컬의 큰 영향을 강조 했다.

Morphogenesis, 동안 주변 환경과 상호 작용 세포 최종 복잡 한 조직 구조를 형성 될 때까지 계속 첫 번째 차별화 이벤트를 트리거합니다. 이 프레임 워크 내에서 nanopatterned 표면 morphogenesis에 초기 세포 표면 상호 작용의 영향을 해결 하기 위해 사용 되었습니다. 68의 측면 간격으로 RGD nanopatterns 리소 그래피 기반에서 β 형 Ti-40Nb nm 합금 95 및 150 nm 사이 RGD nanospacings의 차별화를 강화 하는 동안 저지른 비 줄기 세포12, 미 분화 형을 유지 하는 데 도움이 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) adipogenic/osteogenic13,,1415 와 chondrogenic 운명을16쪽으로. 또한, 신호 구성 요소를 사용 하 여 수정 자가 조립 고분자 나노 신호 신호17의 건축 규제를 제공 하 여 세포 접착 및 차별화를 직접 표시 되었습니다. 이와 관련, 그들의 외부 구체18,,1920 표면에 세포 상호 작용 moieties와 dendrimers의 증 착 세포 접착21,22, 공부 하는 데 사용 되었습니다. 형태학23,24, 그리고 마이그레이션 이벤트25,26. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 연구에서 표면 특성의 부족 어렵게 dendrimer 표면 구성 및 세포 반응 사이 어떤 상관 관계를 설정 합니다.

액체와 같은 순서 및 정의 된 간격 Dendrimer nanopatterns dendrimers 낮은 이온 힘을 가진 솔루션에서 낮은 충전 표면에 흡착 될 때 얻어질 수 있다. 27 이 속성을 기준으로 하 여 여기 선물이 메서드를 로컬 RGD 표면 밀도의 나노 제어를 허용 하는 낮은 충전 표면에 RGD 기능성된 dendrimers의 대규모 고르지 nanopatterns. 물 접촉 각 (CA), 엑스레이 광전자 분광학 (XPS) 및 스캐닝 조사 현미경 검사 법 기술 (STM 및 AFM nanopatterns) 표시 로컬 ligand 밀도 수정 솔루션에서 초기 dendrimer 농도 조정 될 수 있다. 로컬 RGD 표면 밀도 최소 interparticle 거리의 확률 컨투어 지도 의해 AFM 이미지에서 계량 하 고 세포 실험과 상관. 다른 nanopatterning 기법4와 비교 하면, dendrimer 기반 nanopatterning은 간단 하 고 따라서 셀 문화 응용 프로그램에 완벽 하 게 호환 되 고 큰 표면 영역을 쉽게 확장 될 수 있습니다. Nanopatterns는 생리 기판으로 성인 인간의 MSCs29의 chondrogenic 유도 및 세포 접착28 에 로컬 RGD 표면 밀도의 효과 평가 하는 데 사용 됩니다. 우리의 결과 보여준다 RGD dendrimer 기반 nanopatterns 세포의 성장을 유지 하 고 세포 접착은 높은 로컬 RGD 표면 밀도 의해 강화 된다. 차별화 실험에는 기판에 세포의 중간 접착 력 MSC 결로 및 초기 chondrogenic 차별화를 선호. 쉽게는 dendrimer 주변 그룹 수정할 수 있습니다 인해 여기 설명 하는 방법은 더 셀에 농도 의존 효과 발휘 하는 다른 ECM ligands를 확장할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 기판 준비

  1. 1.4 x 1.1 cm Au(111) 운 모 기판에 단련
    1. Au(111) 기판 유리-세라믹 호 브에 배치 하 고 아르곤 분위기 아래 시원한 기판 3 분 허용에 대 한 부탄 불꽃 anneal. 각 Au(111) 기판에 대해이 단계를 반복 합니다.
      참고: Au(111) 기판 열 처리 후 즉시 사용 해야 합니다.
  2. 폴 리 (L 젖 산)의 준비 (PLLA)-유리 기판 코팅.
    1. 절단 하 고 유리 슬라이드를 씻어.
      1. 1.25 cm x 1.25 cm 다이아몬드 팁 커터의 18 슬라이드를 현미경 슬라이드를 잘라. 상하 면 나중에 구별 될 수 있다 그래야 각 슬라이드의 하단 측면에 작은 들여쓰기를 확인 합니다.
      2. 96% 에탄올 뒤 이온된 수와 슬라이드를 철저히 씻으십시오. 그들이 건조 수 있습니다.
    2. 2 %PLLA 솔루션을 준비 합니다.
      1. 200mg PLLA의 압력 튜브에 1, 4-dioxane의 10 mL를 추가 합니다. 저 막대를 추가 하 고 튜브를 단단히 닫습니다.
      2. 24 h에 대 한 부드러운 교에서 60 ° C에서 뜨거운 접시에 글 리세 린 목욕으로 압력 튜브를 놓고 솔루션 15 mL 유리 유리병에 전송 합니다.
    3. PLLA 솔루션 유리 슬라이드 코팅.
      1. 유리 슬라이드와 PLLA 솔루션 유리병 60 ° c.에 깨끗 한 뜨거운 접시에 배치 위 슬라이드를 확인 하 고 필요한 온도 도달 하려면 적어도 10 분 동안 남아 있을 수 있도록.
      2. Spin coater를 준비 하 고 표 1에 지정 된 프로그램을 설정 합니다.
      3. 장소 슬라이드 얼굴 중 하나를 진공 시스템을 사용 하 여 spin coater에서. 파스퇴르 피 펫으로 0.25 mL PLLA 솔루션의 전체 표면 커버 확인 하 고 슬라이드에 적용 됩니다. 코팅 프로그램을 실행 합니다. 각 슬라이드에 대해이 단계를 반복 합니다.

2. Dendrimer Nanopatterning

  1. RGD 기능성된 Dendrimer (RGD Cys D1) 28 솔루션의 준비.
    1. 5 mg 이온된 수의 6.494 ml에서 dendrimer의 분해. 이것은 솔루션 1입니다.
      참고: dendrimer 재고 솔루션을 사용 하 여 준비의 6 개월 이내.
    2. 10 분에 대 한 솔루션을 sonicate 고 B 및 C는 표 2에 따라 솔루션을 준비 합니다.
    3. C 10 분에 대 한 솔루션을 sonicate 고 D, E 및 F 표 2다음 솔루션을 준비 합니다.
    4. 사용 될 때까지 4 ° C에서 B, C, D, E 및 F 솔루션을 저장 합니다. 솔루션은 나중에 사용-20 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. 기판에 RGD Cys D1 Dendrimers의 Nanopatterning
    1. 조직 문화 후드에서 13 분 자외선과 해 여는 기판 소독.
      참고:이 단계는 nanopatterned 기판 셀 문화 기판으로 사용 하려고 하는 경우에 필요. 이 경우 다음 단계에 대 한 살 균 조건 (조직 문화 후드, 살 균 자료, 솔루션 및 기술)을 유지 합니다.
    2. 핀셋으로 신중 하 게 그들을 처리 하는 접시의 우물에 각 기판 얼굴을 배치 합니다.
    3. 10 분에 대 한 솔루션 B, C, D, E 및 F sonicate
    4. 기판 (2 mL/음)을 포함 하는 우물에서 직접 주사기를 사용 하 여 0.22 μ m 지름 필터를 통해 RGD Cys D1 dendrimer 솔루션을 전달 합니다. Dendrimer 농도 당 적어도 3 개의 복제본 권장 됩니다. 및 접시 인감 닫고 실 온 (RT) 16 시간에서 그것을 두고.
    5. 제거 하 고 솔루션을 삭제. 살 균 이온된 수와 건조 기판 세척. 4 ° c.에 게 기판
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

3입니다. 제어 기판의 준비

참고: 메 마른 조직 문화 후드, 그리고 메 마른 재료만 솔루션에서 모든 단계를 수행 했다 고 기술 사용 되었다. 적어도 6 제어 기판 사용된 (긍정적인 통제의 3 개의 복제본) 및 부정적인 컨트롤의 3 개의 복제본을 했다.

  1. 조직 문화 후드에서 13 분 자외선과 해 여는 기판 소독.
  2. 섬유 아 세포 접착 실험의 제어 기판
    1. Au(111) 기판 불꽃 단련 부정적인 컨트롤로 사용 합니다. 골드 안티 셀 접착제 속성28수 여 하는 잘 알려진 단백질 변성 효과가 있다. 모든 솔루션을 sonicate 고 기판 부 화 하기 전에 필터링 합니다.
    2. 긍정적인 컨트롤에 대 한 몰두 RGD 수정 못 thiol Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene 글리콜 모노-11-mercaptoundecanamide (RGD-말뚝-SH)30 , triethylene 글리콜의 해결책에 Au(111) 기판 불꽃 단련 모노-11-mercaptoundecyl 에테르 (못-SH) 실시간에 16 h에 대 한 96% 에탄올에 어 금 니 비율 1: 100
    3. 에탄올에 기판을 철저 하 게 세척 하 고 아르곤과 그들을 건조. 4 ° c.에 게 기판
  3. Chondrogenesis의 제어 기판
    1. 깨끗 한 PLLA 기판 부정적인 컨트롤로 사용 합니다. 어떤 표면 처리 없이 PLLA는 살아있는 세포와 가난한 인터페이스를 보여줍니다. 31
    2. 긍정적인 컨트롤에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 0.1 mg/mL fibronectin의 5 mL을 준비 하 고 품 어 실시간에서 1 h fibronectin 솔루션의 1.6 mL와 함께 각 PLLA 기판
    3. 제거 및 fibronectin 솔루션을 삭제 하 고 PBS와 기판 세척. 4 ° c.에 게 기판

4. 표면 특성

  1. AFM 화상 진 찰
    1. 거칠기 분석 PLLA 기판의 AFM 이미지를 수행 합니다. 이후 dendrimers 거칠기 값 1의 4-5 nm의 직경을가지고 nm는 nanopatterns의 적절 한 시각화를 위한 얻을 수 있어야. 또한,는 nanopatterns의 AFM 이미지를 수행 합니다. 두 경우에서 모드 공기에 도청에서 AFM을 수행 합니다.
    2. 실리콘 캔틸레버를 선택 스프링 상수 k = 40 N/m 및 공 진 주파수 ν = 300 kHz 및 AFM 장비에 탑재.
    3. 원자 힘 현미경의 스테이지에는 샘플을 탑재 합니다. 장치 설정에 따라 튜닝 및 이미징 규격은 달라질 수 있습니다. 제조 업체의 수첩을 참조 하십시오.
    4. 연락처까지 현미경의 팁과 샘플을 접근 한다.
    5. PLLA 거칠기 분석에 대 한 이미지, 3 개의 독립적인 기판에서 기판 당 20 x 20 µ m의 적어도 4 개의 대표적인 영역을 선택 합니다. Dendrimer nanopatterns 이미지를 조건 (솔루션에서 초기 dendrimer 농도) 당 3 개의 독립적인 기판에서 기판 당 5 × 5 µ m의 적어도 3 개의 대표 이미지를 선택. 이미징 동안 dendrimer 층의 손상을 방지 하려면 최소한 힘을 유지 하는 세트 포인트를 조정 합니다.
      참고: 이미지 영역의 선택은 또한 압 전 스캐너의 작업 범위에 따라 다릅니다. 이 점에서 악기 매뉴얼을 참조 하십시오.
    6. AFM 높이 피팅 하 여 이미지 프로세스 각 다항식 평준화 AFM 장치 제조업체의 독점 소프트웨어를 사용 하 여 기능을 검사 하 고 PLLA 표면 거칠기 계산 하에서 그 분석. 루트-평균 제곱 (RMS) 분석은 적절 한 옵션을 제공할 수 있습니다.
  2. 로컬 RGD 표면 밀도 측정입니다.
    1. 표면에 dendrimers 선택 처리 AFM 높이 이미지의 이미지 임계값을 가져옵니다.
    2. 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 입자 위치를 확인 하 고 최소 interparticle 거리 (dmin)를 그들을 사용 하 여.
    3. D분확률 등고선 지도를 해당 입자 위치 z dmin 값을 플롯 합니다. 높은 로컬 RGD 표면 밀도 (d분 < 70 nm)의 영역을 시각화 하기 위한 음모의 색조를 조정 합니다.
    4. 최고의 로컬 RGD 표면 밀도 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 영역의 영역을 계량. 계산에 dendrimer의 영역을 포함 합니다.
  3. STM 이미지입니다.
    참고: STM 이미지 전도성 Au(111) 기판에 nanopatterns에 대해서만 수행할 수 있습니다. 측정은 공기에서 수행 됩니다.
    1. 장소에 STM 장비의 샘플 홀더 nanopatterned 기판. 테스터와 샘플 홀더 사이 전기 연결을 확인 합니다.
    2. 팁 선택한 조사 자료 (즉엣지. Pt 0.8: Ir 0.2) STM 장비의 머리에 적절 한 피팅을 보장 하는 직경. 에칭 수동 절단 또는 전기 화학 에칭에 의해 수행할 수 있습니다. 32
      참고: 전기 화학 에칭 더 많은 대칭 팁 렌더링합니다.
    3. STM 장비의 머리에 팁을 탑재 하 고 샘플을 연결.
    4. "현재" 피드백 채널 설정 (이 유형의 측정, 전류 피드백 조정 일정 될 것입니다). 바이어스 전압 및 전류 설정 포인트 팁 종사 일단 잘 해결된 이미지를 스캔 크기를 조정 합니다.
      참고: 이미지 영역의 선택은 또한 압 전 스캐너의 작업 범위에 따라 다릅니다. 이 점에서 악기 매뉴얼을 참조 하십시오.
    5. 각 스캐닝선 다항식 평준화를 피팅 하 여 STM 지형 이미지 기능 STM 장치 제조업체의 독점 소프트웨어를 사용 하 여 처리 합니다.
  4. CA 측량입니다.
    1. 측정 조건 (솔루션에서 초기 dendrimer 농도)는 광학 CA 시스템 당 3 개의 독립적인 기판에 세 가지 다른 위치에서 무 드롭 방법으로 nanopatterned 기판에 CA입니다.
    2. 이온된 수로는 microsyringe와 1 µ L의 상품을 생산 하기 위해 CA 소프트웨어에서 매개 변수를 설정.
    3. 샘플의 표면 영상에 대 한 컴퓨터에 명확 하 게 표시 되도록 스테이지의 샘플을 놓습니다.
    4. 그것은 표면에 가까운 때까지 micromanipulator와 주사기를 이동 하 고 표면에 드롭 분배. 드롭릿 안정화 후 즉시 이미지를 기록 합니다.
      참고: CA 측정에서는 매우 재현 가능한 결과 달성 하기 위해 습도 제어 하는 것이 중요입니다.
    5. Ca의 CA 기구 제조업체의 독점 소프트웨어와 측정을 분석 합니다. 사용자 요구 사항에 맞는 메서드를 조정할 수 있습니다. 타원 피팅 방법 옵션 될 수 있습니다.

5. 세포 배양

참고: 조직 문화 후드, 그리고 메 마른 재료만 솔루션에서 모든 단계를 수행 했다 고 기술 사용 되었다.

  1. 섬유 아 세포 점착 실험입니다.
    1. NIH 3T3 마우스 미 발달 섬유 아 세포 초기 구절 (< 10) 37 ° C와 기저 매체에 4.6% CO2 분위기에서에서 높은 포도 당 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 문화 1 %L-글루타민, 1% 페니실린-스와 1% 나트륨 pyruvate (성장 매체)입니다. 성장 매체의 10 mL 플라스 크 당 500000 셀의 총 시드의 T75 플라스 크는 것이 좋습니다.
    2. 2 일 마다 10 mL 피 펫과 오래 된 매체를 제거 하 고 갓된 성장 매체의 10 mL를 바꿉니다.
    3. 그들은 80% 합류, 다음 제거 매체 주위에 도달 될 때까지 플라스 크 당 trypsin의 5 mL을 추가 성장 매체에 문화 세포. 플라스 크의 아래쪽에서 적절 한 셀 분리를 보장 하기 위해, 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀 접촉 trypsin 솔루션 유지
    4. 플라스 크 당 성장 매체의 5 mL을 추가 하 고 원심 분리기 튜브에 세포를 수집 합니다. 원심 470 x g 5 분 제거에서 세포는 상쾌한 고 성장 매체의 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀의 농도 결정 합니다.
    5. 번호판 없는 조직 문화 (비 점착)에 대 한 치료를 잘 기판 전송.
    6. 성장 매체에서 4000 셀/c m2 의 조밀도에 기판에 셀 씨 하 고 37 ° C와 10%의 CO2 분위기에서 4.5 h에 대 한 그들을 품 어.
  2. MSCs의 Chondrogenic 감 응 작용입니다.
    1. 초기 구절에서 인간의 MSCs 문화 (< 5) MSC 성장 매체에서 37 ° C와 4.6% CO2 분위기에. 성장 매체의 10 mL 플라스 크 당 500000 셀의 총 시드의 T75 플라스 크는 것이 좋습니다.
    2. (5.1.2에서 설명한) 대로 모든 3 일 매체를 변경 합니다.
    3. Trypsinize 셀 전에 80% 합류에 도달 하면, 그리고 원심 (5.1.3에서와 같이) MSC 성장 매체에서 그들을 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀의 농도 결정 합니다.
    4. 셀을 다시 원심 하 고 유도 하는 chondrogenesis 매체의 10 ml에서 그들을 resuspend.
    5. 새로운 잘 번호판 없는 조직 문화 (비 점착)에 대 한 치료는 기판 격판덮개에서 전송. 3, 000 셀/c m2의 조밀도에 기판에 셀 씨
    6. 변경 chondrogenic 매체 3 일 마다 (5.1.2에서 설명).

6. 세포 고정 및 Immunostaining

참고: 다음 단계는 비 살 균 조건에서 수행할 수 있습니다.

  1. 미디어를 제거 하 고 부드럽게 PBS로 세포 세척. 실시간에서 20 분 동안 10% 포 르 말린 솔루션을 추가 하 여 수정
  2. 포 르 말린을 제거 하 고 PBS로 세포 세척.
  3. PBS에서 염화 암모늄 (NH4Cl)의 50mm 솔루션을 추가 하 여 무료로 알데하이드 그룹을 차단 합니다. 실시간 제거 NH4Cl 솔루션에서 20 분에 대 한 셀을 두고 PBS로 세포 세척.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 4 ° c.에 PBS에 샘플을 저장
  4. PBS를 제거 하 고 추가 하 여 사포닌의 0.1% 솔루션 차단 솔루션 (PBS에 1% 민) 10 분에에서 실시간 세척에 PBS 가진 세포 세포를 permeabilize 새로운 잘 플레이트에 샘플을 전송.
  5. 실시간에서 1 h 차단 솔루션 (표 3)에 1 차 항 체의 솔루션 셀을 품 어 그런 다음 기본 항 체 솔루션을 제거 하 고 PBS로 세포 세척.
  6. 실시간에서 1 시간에 대 한 차단 솔루션 (표 3)에서 2 차 항 체와 세포를 품 어
    참고: 방지 빛 노출.
  7. 이차 항 체 솔루션을 제거 하 고 세포를 PBS와 건조를 씻어.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 어둠 속에서 4 ° C에서 PBS에 샘플을 저장 합니다.
  8. 현미경 관찰에 대 한 샘플 장착: 다이아몬드 팁 커터를 사용 하 여 coverslips 샘플에 매체를 장착 하는 현미경의 1.25 cm x 1.25 cm. 적용 50 µ L로 자르고 부드럽게 컷된 coverslips와 함께 그들을 커버.
  9. 편리한 받는 사람에 게 샘플을 전송, 관찰까지 알루미늄 호 일 및 4 ° C에서 어둠 속에서 그것을 커버.

7. 세포 이미징 및 데이터 분석

참고: 불투명 한 Au(111) 및 두꺼운 microslide 기반 기판, 직 립 현미경 사용 해야 합니다.

  1. 섬유 아 세포 점착 실험입니다.
    1. 사용 epifluorescence 현미경 장비는 디지털 카메라 및 낮은 (즉, 10 배)와 높은 (즉 40 X) 확대 목표. 공기에서 측정을 수행 합니다.
    2. 10 X 목표는 자외선 여기, Hoechst/DAPI 얼룩 시각화 longpass 방출 필터를 사용 하 여 무대와 이미지 세포 핵에 샘플을 놓습니다.
    3. 이미지 셀 골격 및 해당 항 체 형광 색소 명세와 일치 하는 현미경 필터를 선택 하면 40 X 목표 초점 유착 (FAs).
    4. FA 정량화에 대 한 8 비트 파일에 이미지를 변환 하는 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 합니다. 임계값을 설정 하 여 이진 변환 및 배경 이미지를 제거 합니다. 샘플 당 적어도 30 이미지를 계산 하 고 1 µ m2 계산에서 FAs를 고려 하십시오.
  2. MSCs의 Chondrogenic 감 응 작용입니다.
    1. 똑바로 epifluorescence 현미경 디지털 카메라 및 낮은 (즉, 10 배)으로 셀 condensates chondrogenic 유도 (< 5 일)의 초기 단계에서 이미지 확대 목표. 자외선 여기 및 longpass 방출 필터를 사용 하 여 시각화 Hoechst/DAPI 얼룩.
    2. 응축 영역을 측정 하기 위한 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 하 이미지를 8 비트 파일 변환 배경 제거 하 고 집계 윤곽선을 강조 하는 임계값을 선택 합니다. 입자의 위치를 계산 합니다.
    3. FAs, 골격 말라 섬유, 및 높은 확대율 (즉, 40-60 X)에서 직 립 confocal 현미경으로 특정 연골 콜라겐 유형 II 알파 1 (COL2A1)에 대 한 이미지 immunostained 샘플. (즉, 0.5-1 µ m) 대표 간격 섹션을 수집 합니다.
    4. 스택 처리, 이미지 처리 소프트웨어를 사용 합니다. 8 비트 파일에 이미지를 변환, 배경, 제거 그리고 이진 임계값을 설정 합니다. 최소 3 개의 독립적인 샘플의 조건 당 3 셀 condensates 취급.
    5. 스테인드 지역의 condensates 셀의 기초 영역에서 FA 단백질을 계량 하 고 해당 지역 이미지에 세포 핵의 수로 나눈 비율으로 그들을 표현.
    6. COL2A1 얼룩 측정, confocal z-계획을 사용 하 고 예상된 지역 (샘플 당 최대 COL2A1 영역)의 합 계량. 해당 응축의 지역에 대 한 가져온 지역 값을 정상화.

8. 양적 역 전사-중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석

참고: 오염을 방지 하기 위해 RNase, 일회용, 살 균 플라스틱 도자기를 사용 하 고 시 약 및 RNA를 처리 하는 동안 일회용 장갑을 착용. 항상 적절 한 미생물 무 균 기술을 사용 하 고 적절 한 오염 제거 솔루션을 사용 하 여 작업 및 원심 분리기, 펫 등 비 일회용 항목에서 RNase 오염 제거.

  1. 총 RNA를 분리 하 고 RNA disrupter에 그것을 격파. RNA 샘플 DNase 처리 하 고 cDNA cDNA 합성 키트를 사용 하 여 그들을 변환.
  2. QRT-PCR 수행 녹음 방송 요인 SOX9에 대 한 프라이 머를 사용 하 여. 베타-2-microglobulin (B2M) 및 ribosomal 단백질 L13a (RPL13a)는 내부 관리 유전자로 사용할 수 있습니다.
  3. 식 수준을 계산 하 고 부정적인 제어 (PLLA)에 대 한 그들을 정상화.

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결과

표면 접착 력 나노 (그림 1)에서 해결할 수 있도록 nanopatterning 메서드는 선물이. RGD Cys D1의 화학 구조는 그림 1A에 표시 됩니다. Dendrimers는 고해상도 STM 특성화를 위한 전기 전도성 Au(111) 표면에 모방 했다. 솔루션 (최대 10-5% w/w)에서 낮은 dendrimer 농도 높은 포장된 dendrimer 집계 높은 농도 (그림 1C) 형성 하는 동안 (그림 1B), 직경에서 4-5 nm의 격리 dendrimers 렌더링. AFM 표면 특성 (그림 1의 D-G, 위 행) 밝혔다 RGD Cys D1 dendrimers의 표면 배포 솔루션에서 초기 de...

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토론

설명된 프로토콜의 개발 하는 동안 몇 가지 중요 한 단계를 고려해 야 합니다. 첫 번째 검사 조사 현미경 검사 법 기술을 가진 nanopattern 특성을 말합니다. nanopatterns를 시각화 하려면 모방 생산은 표면 거칠기 값 주위 dendrimers의 평균 직경 아래 있어야 STM (그림 1B)에 의해 측정 된 4-5 nm. 또한, 그것은 높은 해상도 STM 이미징이 경우 Au(111) 전도성 기판에 제한 된 계정으로 취해야 한다. 어떤 스핀 코팅 후 슬라이드의 모서리에서 폴리머의 리프팅은 생체 접착제를 사용 하 여 조정 될 수 있습니다.

Dendrimer nanopatterning 달성 하는 프로세스 제어는 nanoscale에 로컬 셀 접착 력 이다. 에 따라는 자기 조립 dendrimers 흡착에 의해 표면에,의이 기술은 장비가 필요 하지 않습니다 모든 복잡 한 nanopatterning, 이전와 따라서 대조 설명 리소 그래피 기반 방법...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자에에서 대 한 그들의 도움 d분 정량화 악천후로 글꼴-바흐와 앨버트 G. Castaño 인정합니다. 그들은 또한 고급 디지털 현미경 단위 의학 작가 그들의 전제에 동영상을 기록 하도록 (IRB 바르셀로나)에서 연구를 위한 연구소에서 인정 합니다. 이 작품으로는 네트워킹 생물 의학 연구 센터 (CIBER), 스페인을 지원 했다. CIBER 유럽 지역 개발 기금의 지원으로 건배 카를로스 III, VI 국가 R & D & 계획 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider 프로그램, CIBER 작업 및 Instituto de에 의해 자금 이니셔티브 이다. 이 작품 대학과 학과의 혁신, 대학 및 기업 Generalitat 드 Catalunya의의 연구에 대 한 위원회에 의해 지원 되었습니다 (2014 SGR 1442). 그것은 또한 OLIGOCODES (제 프로젝트에 의해 투자 되었다 MAT2012-38573-C02)와 CTQ2013-41339-P, INTERREG V-A 스페인-포르투갈 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E)에 또한 스페인 경제와 경쟁력에 의해 수 여. C.R.P. 스페인 경제와 경쟁력 부여 (제 로부터 재정 지원을 인정합니다 IFI15/00151).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
운모에 골드 (111). 1.4x1.1 cm Spi 공급466PS-AB
유리 마이크로 슬라이드, 일반Corning2947-75x25
탈 이온수Millipore18M & Omega; cm
에탄올 96 %PanReac131085.1212
L-Lactide / DL- 락타이드 공중 합체Corbion95/05 몰 비율
1,4 - 디 옥산Sigma-Aldrich296309-1L
실리콘 오일, 고온Acros 유기물174665000
SpinnerLaurellWS-650MZ-23NPP/Lite
조직 문화 층류 후드TelstarBio II AdvanceClass II 생물학적 안전 캐비닛
필터 유닛Millex-GPSLGP033RB0.22 &마이크로; m
주사기 10 mLDiscardit309110
원자력 현미경Veeco 기기치수 3000 AFM 기기
실리콘 AFM 프로브예산 센서Tap300AI-G공진 주파수 300 kHz, k = 40 N / m
스캐닝 터널링 현미경분자 이미징PicoSPM 현미경
Pt0.8 : Ir0.2 와이어출현PT671012직경 0.25mm
WSxM 4.0 소프트웨어Nanotec electronica
광학 접촉각(CA) 시스템데이터 물리학
SCA20 소프트웨어데이터 물리학
X선 광전자 분광계물리 전자Perkin-Elmer PHI 5500 다중 기술 시스템
소 플라즈마의 피브로넥틴Sigma-AldrichF1141-1MG1.0mL 용액
Dulbecco의 인산염 완충액 식염수(DPBS)Gibco21600-10분말
마우스 배아 섬유아세포,ATCCATCC CRL-1658NIH/3T3
Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 액체 고포도Gibco11960044액체 고포도당, 글루타민 없음, 500mL
소 태아 혈청(FBS)Gibco16000044500 mL
L-글루타민인비트로겐25030200 mM (100X)
페니실린-스트렙토마이신인비트로겐15140
소듐 피루베이트인비트로겐11360039 100 mL
T75 배양 플라스크Nunclon156499
TrypsinLife Technologies25200072 0,25% EDTA
원심분리기Hermle LabortechnikZ 206 A
비조직 배양 처리 플레이트, 12Falcon351143비접착성
지방 유래 hMSCATCCATCC PCS-500-011세포 바이알 1mL
MSC 기초 배지ATCCATCC PCS-500-030
MSC 성장 키트ATCCATCC PCS-500-040저혈청
연골 세포 분화 도구ATCCATCC PCS-500-051
포르말린 용액시그마-알드리치HT5011-15ML중성 완충, 10%
염화암모늄시그마-알드리치A9434-500G분자 생물학, 세포 배양에 적합, ≥ 99.5%
SaponinSigma-Aldrich47036-50G-F는 비이온 계면활성제로 사용되며,
보조 소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-AldrichA3059-50G
토끼 단클론 [Y113] 항-파실린 항체Abcamab32084희석 1:200
마우스 단클론 [1F5] 항-콜라겐 알파-1 XX 체인 Acris 항체AM00212PU-N희석: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) 2차 항체InvitrogenA106672 mg/mL. 희석된 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) 2차 항체InvitrogenA110362 mg/mL. 희석 1:1000
Hoechst 33342Thermo FisherH3570 10ML10 mg/mL. 희석 된 1 : 1000
커버 유리 24x24 mmDeltalabD102424
FluoromountSigma-AldrichF4680-25ML
Epifluorescence MicroscopeNikonEclipse E1000 직립 현미경(CCD 카메라
포함) 컨 포칼 현미경Leica MicrosystemsLeica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g 프리웨어
MATLAB 소프트웨어The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 소프트웨어 OriginLab 협력
, 당 웰 http://imgej.nih.gov/ij

참고문헌

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