여기, 우리는 간단, 신속 하 고 효율적인 프리온 증폭 기술, 실시간 떨게 유발 변환 (RT-QuIC) 메서드를 설명 하는 프로토콜을 제시.
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방법 논문
실시간 떨게 유발 CWD Prions 지저분한 자료의 검색을 위한 변환 분석 결과
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
RT QuIC 기술은 민감한 생체 외에서 셀 무료 프리온 증폭 분석 결과 기반으로 주로 시드 misfolding 및 변환에 대 한 템플릿으로 프리온 씨앗을 사용 하 여 재조합 프리온 단백질 (PrP) 기판의 집계입니다. RT QuIC는 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)는 소설 높은 처리 기술입니다. 녹말 체 fibril 성장의 감지 염료 ᵦ 시트 풍부한 단백질의 특정 상호 작용에 따라 fluoresces Thioflavin T를 기반으로 합니다. 따라서, 녹말 체 형성을 실시간으로 검색할 수 있습니다. 우리는 지저분한 추출 만성 낭비 질병 (CWD) prions를 검출 하기 위하여 신뢰할 수 있는 비-침략 적 선별 검사를 개발 하려고 결정 했습니다. 여기, 우리가 구체적으로 PrPSc 시드 CWD의 배설물에는 활동 감염 cervids 공개 RT QuIC 기술을 적응 시켰다. 처음에, 우리가 준비 배설물 추출의 시드 활동 상대적으로 낮은 RT QuIC 배설물 소재에 잠재적인 분석 결과 억제제 때문에 가능 하 게 했다. 대변 추출의 시드 활동 향상과 잠재력 분석 결과 억제제를 제거, 우리는 세제와 프로 테아 제 억제제를 포함 하는 버퍼에 배설물 샘플 무 균. 우리는 또한 PrP 단백질 강 수 나트륨 phosphotungstic 산, 및 원심력을 사용 하 여 기준Sc 집중 다른 방법론에 샘플을 제출. 마지막으로, 배설물 추출 최적화 된 RT-QuIC 탐지의 감도 향상 시키기 위해 프로토콜에 기판 교체를 포함 하 여 테스트 되었습니다. 따라서, 우리는 시드 여 RT-QuIC, 비-침략 적 CWD 진단에 대 한 실용적인 도구가 될 수 있는 전 임상 및 임상 cervids의 배설물에서 활동 하는 CWD 프리온의 민감한 감지에 대 한 프로토콜을 설립.
서론
프리온 질병 또는 전송 가능 해 encephalopathies (TSE) 인간, 소 면 뇌 질환 (BSE) 가축, 양, 염소, 그리고 만성 낭비 scrapie에에서 크로이츠펠트-야콥 병 (CJD)를 포함 한 신경 퇴행 성 장애는 질병 (CWD) cervids 1,2. TSEs 독특한 면 모양 및 두뇌에서 뉴런의 손실에 의해 특징. "단백질만" 가설에 따르면 prions PrPSc ('Sc' scrapie에 대 한) 3, 호스트 인코딩 세포 프리온 단백질, PrPC의 misfolded isoform의 주로 구성 됩니다. PrPSc 구조 바인딩할 다른 PrPC 분자를 변환 하는 씨앗 역할을 할 수 있는 ᵦ 시트 4,,56 농축에 PrPC 의 변환에서 유래한 다. 새로 생성 된 PrPSc 분자는 성장 폴리머 7,
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프로토콜
1. RT QuIC 사용 하 여 배설물 소재
배설물의 10 mL를 분 변 물질의 1 g를 추가 하 여- 확인 cervid 배설물의 준비 추출
- 지저분한 homogenate 추출 버퍼 (20 m m 인산 나트륨, pH 7.1, 130 m m NaCl, 0.05% 트윈 20, 1 밀리미터 PMSF 및 1 x 완료 protease 억제제, EDTA 무료) 10% (w/v)의 최종 농도 주고. 균질 버퍼의 이용 전에 준비 하 고-20에 저장 수 있다 ° c.
- Homogenize 찌 끼 펠 릿 (1 g) 그리고 실내 온도에서 1 분에 대 한 단백질에 대 한 제조 업체에서 미리 설정된 프로그램으로는 dissociator를 사용 하 여 (예를 들어, gentleMACS M 튜브) 튜브에 버퍼 (10 mL). 2 ~ 3 배 배설물 샘플은 버퍼에 완전히 무 균 때까지이 단계를 반복.
- Parafilm 튜브를 밀봉 하 고 상 온에서 1 h 보육에 대 한 플랫폼 또는 로타리 락 통에 넣어.
- 실 온에서 5 분에 대 한 18000 x g에서 튜브 원심.
- 수집 supernatants 단백질을 포함 하는 추출 하 고 aliquot 그들로 1.5 mL 튜브. Aliquots는 추가 응....
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결과
CWD 지저분한 추출 물 10% (w/v)에서 RT-QuIC 반응, 씨앗 수 있었다 아직 검출의 감도 낮은 27. RT QuIC 반응에 수 반하는 사용에 마우스 rPrP 기판의 높은 배경 형광을 피하기 위해 중요 한 단계는 지저분한 균질에 대 한 특정 버퍼를 사용 하는 보다 더 구체적인 수 사슴 rPrP 결과 27. NaPTA 강 수의 추가 반응 (그림 2)의 시드 활동의 확대를 억제 하지 않고 rPrP RT QuIC (그림 1)에서 자발적인 변환 감소. 더 나은 증폭 NaPTA 치료 시 관찰 되었다, CWD 긍정적인 배설물 샘플의 결과 형광 신호 (그림 1) 여전히 낮은 있었다. 또한, 일부 샘플의 프리온 증폭 낮은 형광 수준.......
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토론
RT QuIC 이전 고용 되었다 소변 및 배설물 추출 물 구두로 감염 된 흰 꼬리 사슴, 뮬 사슴 38의 CWD prions를 검출 하기 위하여. 이 원고에 표시 된 시스템 RT QuIC 분석 결과의 적응된 방법입니다. 추가 단계는 검색 및 CWD prions 감염된 동물의 분 변 물질에 대 한 분석 결과의 감도 향상 시키기 위해 "클래식" RT QuIC 분석 결과에 통합 했다.
배설물 추출 물에서 낮은 감도 RT QuIC 프로토콜의 개선에 우리를 이끌었다. 배설물에 prions의 민감한 생체 외에서 탐지를 위해 중요 한 단계는 프리온 변환 및 전파 방해와 탐지의 감도 향상 구성 요소를 제거 하려면 샘플 준비에 대 한 추가 되었습니다. 전 임상 및 임상 CWD 감염 된 엘크, 시드 활동을 감지 하 고 배설물 추출 물에서 프리온 변환의 검출 한계 향상 중요 했다 RT QuIC 및 NaPTA/sarkosyl 치료의 프로토콜에.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 제공 하는 교육 및 cervid PrP 세균성 식 플라스 미드 박사 바이런 Caughey (NIH 록 키 마운틴 연구소)에 감사입니다. SG는 캐나다 연구의 자 프로그램에 의해 지원 됩니다. 우리는이 연구에 대 한 자금 게놈 캐나다, 앨버타 프리온 연구소와 앨버타 농업 게놈 알버타, 캘거리 대학이이 작품 지원 통해 임업에서 SG을 인정 합니다. 우리는 동물 연구에 대 한 마가렛 Gunn 재단에서 연구 보조금을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| Acrodisc seringe 필터 | PALL | 4652 | |
| amicon Ultra-15 원심 필터 Unit | Millipore | UCF901024 | |
| BD 10 ml seringe | VWR | CA75846-842 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Corning bottle-top 진공 필터 | 시그마-알드리치 | 431118 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | 시그마-알드리치 | E4884 | |
| 젠틀맥스 M 튜브 | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| 구아니딘 염산염 | 시그마-알드리치 | G4505 | |
| 이미다졸 | 시그마-알드리치 | I5513 | |
| 이소프로판올 | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Luria-Bertani (LB) 육수 | ThermoFisher Scientific | 12780029 | |
| 염화마그네슘 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| N2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 15502048 | |
| N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | ML9150 | |
| PALL | OD100C34 | 가 있는 나노셉 원심 장치 | |
| ThermoFisher Scientific | 232702 | ||
| Parafilm M | VWR | 52858-000 | |
| 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| 프로테아제 억제제 정제 | Roche | ||
| 염화나트륨 | 시그마-알드리치 | S3014 | |
| 소듐 데옥시콜레이트 | 시그마-알드리치 | D6750 | |
| 소듐 도데실설페이트(SDS) | 칼바이오켐 | 7910-OP | |
| 소듐 포스페이 | 트 시그마-알드리치 | 342483 | |
| 소듐포스페이트 이염기성 무수 | 시그마-알드리치 | S9763 | |
| 인산 나트륨 일 염기성 일 수화물 | 시그마 -알드리치 | S9638 | |
| 인산 텅스텐 산 나트륨 수화물 (NaPTA) | 시그마 -알드리치 | 496626 | |
| 티오플라빈 T | 시그마 알드리치 | T3516 | |
| 트리스 - 하이드 록시 - 메틸 - 아미노 - 메탄 (트리스) | 시그마 - 알드리치 | T6066 | |
| 트리톤 -100 | Calbiochem | 9410-OP | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
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| FLUOstar 오메가 마이크로플레이트 리더 | BMG Labtech | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Sofware | |||
| MARS 데이터 분석 | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism6 | GraphPad 소프트웨어 |
참고문헌
- Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
- Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
- Prusiner, S. B.
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