관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

요약

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

초록

이 프로토콜의 목표를 포진 심 플렉스 바이러스 타입-1 (HSV-1)의 식별에 감염 된 세포에서 DNA 관련 바이러스 이며 여 세포질 단백질 질량 분석. 바이러스 성 유전자와 상호 작용 하는 단백질 감염의 결과 결정에 있는 주요 역할 비록 바이러스 성 게놈 관련 단백질의 포괄적인 분석 이전 가능 되지 않았습니다. 여기 감염 된 세포에서 HSV-1 유전자의 직접 정화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다. 바이러스 성 DNA 복제 alkyne 기능 그룹을 포함 하는 수정 된 세포핵으로 선택적으로 표시 됩니다. 레이블이 지정 된 DNA는 다음 구체적으로 그리고 돌이킬 수 태그 biotin 통해 구리 (I) 아 지 드의 공유 첨부 파일을 통해-아 지 드 alkyne cycloaddition 또는 클릭 반응 촉매. Biotin 태그 DNA streptavidin 입히는 구슬에 정화와 관련 된 단백질은 eluted 질량 분석에 의해 확인 된. 이 메서드는 선택적 대상 지정 및 HSV-1 복제 포크 또는 복잡 한 생물 학적 환경에서 전체 게놈의 격리 수 있습니다. 또한,이 방법의 적응은 herpesviral 감염의 다양 한 측면의 다른 DNA 바이러스의 유전자 검사의 수사 허용 하 고 있습니다.

서론

바이러스는 필수적인 기능을 수행 하 고 따라서 감염 바이러스 성 유전자 발현, 복제, 복구, 재결합, 전송 등의 중요 한 측면을 촉진 하기 위하여 호스트 요소에 따라 제한 된 용량을가지고. 이러한 호스트 요인의 활동은 종종 virally 인코딩된 단백질에 의해 증강 된다. 또한, 바이러스 성 감염에 세포질 응답에 의해 바이러스 탐지 및 방해를 피해 야 한다. 따라서, 바이러스 호스트 상호 작용은 감염의 결과 지정합니다. 파라마운트의 중요성 이해 어떻게 바이러스 바이러스 성 프로세스를 촉진 하기 위하여 세포질 기계에 맞게 셀룰러 환경 변경. 특히 관심의 어떤 요소와 프로세스 행동 전염 성 주기에 걸쳐 바이러스 성 게놈에 식별 됩니다.

헤 르 페 스의 단순 바이러스 타입 1 (HSV-1)는 더블 좌초 인간의 인구의 상당한 비율을 감염 하는 DNA 바이러스입니다. 감염의 첫 번째 시간, 바이러스 성 게놈은 핵, 바이러스 성 유전자 발현의 순서 캐스케이드 바이러스 DNA (vDNA) 복제¹조정에서 ensues 들어간다. 핵에서 게놈 epigenetic 규정이 적용, 수리 및 재결합, 받을 있으며 첫 번째 자손 virions 6 시간 미만 생산 되도록 capsids,으로 패키징 됩니다. 감염의 과정을 통해 관....

프로토콜

1. 세포 배양, 바이러스 성 감염 및 EdC 라벨 ( 그림 1)

다음 프로토콜 작업 바이러스를 포함. 학교를 참조 하십시오 ' 바이러스 및 다른 생물 학적 에이전트의 안전한 취급에 관한 s 바이오 안전 프로토콜. 이 프로토콜의 피츠버그 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.

1. MRC-5 셀 confluent 150 cm ² 조직 배양 플라스 크를 trypsinize 하 고 600 cm ² 조직 문화 접시 100ml DMEM 플러스 10%를 포함 하는 셀 전송 FBS. Confluency 및 고정 단계를 도달 하기 위하여 3-4 일의 5% CO ₂의 37 ° C에서 품 어. Confluent 600 cm ² 접시 7을 ~ 10 ⁷ 셀에 포함 되어 있습니다. 각 조건에 대해 1 접시와 각 해당 부정적인 컨트롤 1 접시 준비.
   참고: 셀 그 유일한 vDNA를 분류 하 고 이후 단계에서 정화 되도록 세포 DNA 복제를 억제 하는 고정 단계에 도달 해야 합니다.
   참고: 각 샘플 필요 합니다 무료로 동일한 감염 조건 및 EdC의 추가 없이 시간 ....

결과

세포에서 DNA의 정화에 대 한 클릭 화학을 사용 하 여 먼저 iPOND 메서드²¹에 의해 달성 되었다. IPOND의 목적은 정화 관련된 단백질의 id에 대 한 세포 복제 포크입니다. 우리는 특별히 감염 시 vDNA 단백질 상호 작용 연구에이 기술을 적응 시켰다. EdC (그림 1)와 함께 동기화 된 감염, 바이러스 성 게놈을 접근의 조작 선택적 분리와 vDNA의 별도 인구 조사에 대 한 허용 했다. HSV-1 DNA 이미징 fluorophore 또는 biotin 정화 (그림 2)에 대 한 공유 첨부 파일을 촉진 하기 위하여 EdC (그림 1)으로 표시 됩니다. 바이러스 들어오는 게놈 (그림 1A)와 관련 된 단백질의.......

토론

이 프로토콜에는 여러 단계를 신중 하 게 따르지 않으면 크게 감소 단백질 수확량 또는 세포질 DNA로 오염 될 수 있습니다 포함 되어 있습니다. 그것은 중요 한 세포질 DNA는 하지 표시 하 고 정화 고정 셀 모든 실험을 위해 사용 됩니다. 이것은 단백질 견본에 세포질 DNA polymerases의 부재에 의해 HSV-1 게놈 종합을 위한 세포질 DNA 중 합 효소를 사용 하지 않습니다 때문에 확인할 수 있습니다. EdC 라벨 및 수확 단계 핵, 샘플은 각각 동등 하 게 처리 되도록 정열 한다. 정화 단계 하지 너무 많이 pipetting으로 핵을 조작에 배려를가지고 한다. 이 핵, 피펫으로 팁의 측면에 집착으로 샘플 손실의 조 lysis로 이어질 수 있습니다. 또한, 쥡니다 단계 개별 sonicators에 대 한 최적화 되어야 합니다 및 biotin 바인딩에 사용 되는 streptavidin 입히는 구슬의 양을 최적의 단백질 생산량에 대 한 적정 한다.

몇 가지 수정이이 프로토.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
MRC-5 세포	ATCC	CCL-171
태아 소 세럼 (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM 로 대체; (플라스크 내 성장용) 또는 30mM(접시 내 성장용) 나트륨-중카르비네이
600cm2 조직 배양 접시	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris 완충 식염수(TBS), pH 7.4			137mM NaCl, 5mM KCl, 491mM MgCl, 680mM CaCl, 25.1mM Tricine
HSV-1 스톡			역가가 1x109 PFU/mL보다 큰 스톡이 가장 적합합니다
.세파덱스 G-25  컬럼 (PD-10 탈염 컬럼)	GE 헬스케어	17085101
디메틸 설폭사이드(DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	DMSO에 용해하여 40mM 재고, 분취 및 -20°C에 보관합니다. 씨
2´-deoxycytidine (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	물에 용해시켜 40mM 재고, 분취 및 -20°C에 보관합니다. 씨
핵 추출 완충액(NEB)			신선한(20mM Hepes pH 7.2, 50mM NaCl, 3mM MgCl2, 300mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraper	Bellco glass	7731-22000	사용 전 오토클레이브
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7.2 (10x)			1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (사용 전에 멸균수에서 1x로 희석)
구리(II) 황산염 5수화물(CuSO4-5H2O)	Fisher Scientific	C489	100mM 재고를 준비하고 4°C에서 보관합니다. C 최대 1개월
동안(+) 나트륨 L-아스코르브산	염 시그마-알드리치	A4034	100 mM 재고를 신선하게 준비하고 얼음에 보관
비오틴 아지드	인비트로젠	B10184	DMSO에 10 mM 재고를 준비하고, 분취량, -20°C에서 보관; C 최대 1년
반응 혼합			준비를 클릭하십시오 (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)
완전한 프로테아제 억제제 칵테일	로슈	11697498001	1 mL 물에 용해시켜 50x 재고를 준비하고, 4 °에서 저장할 수 있습니다; C 최대 1 주일 동안 또는 직접 50 mL 버퍼에 1 알약을 추가
동결 버퍼			신선한 준비 (7 mL 100 % 글리세롤, 3 mL NEB, 200 μ L 50x 프로테아제 억제제)
버퍼 B1			신선한 준비 (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x 프로테아제 억제제)
버퍼 B2			신선한 준비 (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x 프로테아제 억제제)
버퍼 B3			신선한 준비 (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x 프로테아제 억제제)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer 3mm 마이크로팁 프로브	Sonics	VCX 130
Cell strainer	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Mini-Tube Rotator	Fisher Scientific	260750F
2x Laemmli 샘플 버퍼			400mL 물에 SDS 400mg, 100% 글리세롤 2mL, 1M 트리스(pH 6.8) 1.25mL 및 브로모페놀 블루 10mg을 혼합합니다. 4 에 매장 &데그; C는 최대 6개월 동안 사용할 수 있습니다. 사용하기 전에 1M DTT를 최종 농도 200mM에 첨가하십시오.
1.5 mL 튜브용 캡 잠금 장치	, Fisher Scientific	NC9679153
표준 웨스턴 블로팅 시약
, NOVEX 콜로이드 블루 염색 키트,	Invitrogen	LC6025
12웰 조직 배양 접시	Corning	3513
커버슬립,	Fisher Scientific	12-545-100	사용
전 오토클레이브현미경 슬라이드	Fisher Scientific	12-552-5
16% 파라포름알데히드	전자 현미경 과학	15710	사용 전 1x PBS에서 3.7%로 희석
소 혈청 알부민(BSA)	Fisher Scientific	BP1605	1x PBS
투과 완충액(0.5% Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	1x PBS
에서 0.5% Triton-X 100 준비클릭 반응 칵테일 - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 이미징 키트	분자 프로브	C10337	제조사 프로토콜에 따라 준비
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	물에 10 mg/mL 준비, 4°C에서 저장 가능; 최대 1년
동안 마우스 anti-ICP8 1차 항체	Abcam	ab20194	1x PBS
마우스 anti-UL42 1차 항체(2H4)	Abcam	ab19311	1:200 희석 사용 1x
PBS Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody	Life Technologies	a11005	1:500 희석 사용
2x SDS-bicarb 용액			2% SDS, 200 mM NaHCO3
페놀:클로로포름:이소아밀 알코올			믹스 25:24:1 사용 최소 1일 전, 4°C에서 보관하십시오. 어두운
클로로포름의 C : 이소 아밀 알코올			24 : 1 사용 최소 1 일 전에 실온에서 보관하십시오
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (사용 전 1x로 희석)
Qiaquick PCR 정제 키트	Qiagen	28104
3 M 아세트산 나트륨 pH 5.2
Qubit 2.0 형광계	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS 어세이 키트	, Invitrogen	Q32851
Qubit 어세이 튜브	이미징 소프트웨어가
형광 현미경
문화 인큐베이터
생물 안전 캐비닛
열 블록			65 ° C 및 95 ° 씨

트 합니다. 표시된 순서로 시약을 추가하여 사용 직전에 는 , )에서 3% 준비 에 1x PBS Immu-mount Thermo Fisher Scientific 9990402에 , 장착된 Invitrogen Q32856 , 1.5mL 튜브용 마이크로 원심분리기, 15mL 및 50mL 튜브용 테이블탑 원심분리기, 세포