방법 논문

관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

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⸱

DOI:

10.3791/56374

⸱

2017년 8월 31일

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

초록

이 프로토콜의 목표를 포진 심 플렉스 바이러스 타입-1 (HSV-1)의 식별에 감염 된 세포에서 DNA 관련 바이러스 이며 여 세포질 단백질 질량 분석. 바이러스 성 유전자와 상호 작용 하는 단백질 감염의 결과 결정에 있는 주요 역할 비록 바이러스 성 게놈 관련 단백질의 포괄적인 분석 이전 가능 되지 않았습니다. 여기 감염 된 세포에서 HSV-1 유전자의 직접 정화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다. 바이러스 성 DNA 복제 alkyne 기능 그룹을 포함 하는 수정 된 세포핵으로 선택적으로 표시 됩니다. 레이블이 지정 된 DNA는 다음 구체적으로 그리고 돌이킬 수 태그 biotin 통해 구리 (I) 아 지 드의 공유 첨부 파일을 통해-아 지 드 alkyne cycloaddition 또는 클릭 반응 촉매. Biotin 태그 DNA streptavidin 입히는 구슬에 정화와 관련 된 단백질은 eluted 질량 분석에 의해 확인 된. 이 메서드는 선택적 대상 지정 및 HSV-1 복제 포크 또는 복잡 한 생물 학적 환경에서 전체 게놈의 격리 수 있습니다. 또한,이 방법의 적응은 herpesviral 감염의 다양 한 측면의 다른 DNA 바이러스의 유전자 검사의 수사 허용 하 고 있습니다.

서론

바이러스는 필수적인 기능을 수행 하 고 따라서 감염 바이러스 성 유전자 발현, 복제, 복구, 재결합, 전송 등의 중요 한 측면을 촉진 하기 위하여 호스트 요소에 따라 제한 된 용량을가지고. 이러한 호스트 요인의 활동은 종종 virally 인코딩된 단백질에 의해 증강 된다. 또한, 바이러스 성 감염에 세포질 응답에 의해 바이러스 탐지 및 방해를 피해 야 한다. 따라서, 바이러스 호스트 상호 작용은 감염의 결과 지정합니다. 파라마운트의 중요성 이해 어떻게 바이러스 바이러스 성 프로세스를 촉진 하기 위하여 세포질 기계에 맞게 셀룰러 환경 변경. 특히 관심의 어떤 요소와 프로세스 행동 전염 성 주기에 걸쳐 바이러스 성 게놈에 식별 됩니다.

헤 르 페 스의 단순 바이러스 타입 1 (HSV-1)는 더블 좌초 인간의 인구의 상당한 비율을 감염 하는 DNA 바이러스입니다. 감염의 첫 번째 시간, 바이러스 성 게놈은 핵, 바이러스 성 유전자 발현의 순서 캐스케이드 바이러스 DNA (vDNA) 복제1조정에서 ensues 들어간다. 핵에서 게놈 epigenetic 규정이 적용, 수리 및 재결합, 받을 있으며 첫 번째 자손 virions 6 시간 미만 생산 되도록 capsids,으로 패키징 됩니다. 감염의 과정을 통해 관련 된 바이러스 성 게놈 단백질의 종합 평가 하는 바이러스 성 게놈에 행동 하 고 있는 바이러스 및 세포질 요인에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다. 프로세스의 분자 세부 조사를 기초 누워 것입니다. 감염의 다양 한 단계에 포함 된다입니다.

바이러스 성 감염에 관련 된 호스트 요인의 조사에 대 한 이전 방법 포함 관련된 세포 단백질2,3,,45 의 분석에 대 한 바이러스 성 단백질의 친 화력 정화 , 6 , 7 , 8 , 9. 이러한 분석 수단이 포함 된 세포질 요인의 식별에 대 한 호스트 항 바이러스 응답 뿐만 아니라 바이러스 chromatin 수정, 유전자 발현 및 DNA 복구. 그러나, 그것은 상호 작용 vDNA, 연관에 따라 달라 집니다 그리고 proteomics 특정 바이러스 성 요인의 기능으로 발생 하는 상호 작용에 대 한 통찰력을 제공 여부를 확인 하기가 어렵습니다. Chromatin immunoprecipitation (칩) 특정 바이러스 및 세포질 단백질 바이러스 성 게놈10,11,12,,1314 바인딩할 식별 하는 데 사용 되었습니다. , 15 그리고 형광 성 제자리 교 잡 (물고기) immunocytochemistry와 함께 vDNA16,,1718, 와 colocalize 세포 요소의 시각화 수 있게 되었습니다. 19 , 20.이 분석 실험 공간 및 시간 분석에 대 한 허용. 그러나, 한계는 매우 구체적인 항 체, 제한 된 감도 및 이전 통찰력 바이러스 호스트 상호 작용에 대 한 필요성에 대 한 필요성을 포함합니다. 우리는 따라서 iPOND (초기 DNA에 단백질의 격리)21 에 따라 방법을 개발 및 선택적으로 레이블을 지정 하 고 정화에서 vDNA aniPOND (가속된 네이티브 iPOND)22 감염 바이러스 성 게놈의 편견된 식별에 대 한 셀 관련된 단백질 질량 분석에 의해입니다. iPOND 세포 복제 포크 역학 조사에 대 한 수단이 되었습니다.

감염 된 세포에서 바이러스 성 게놈의 선택적 정화에 대 한 수정 ethynyl nucleosides, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (듀) 또는 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (그림 1), 다음 화학식으로 표시 됩니다 vDNA 복제 통해 biotin 아 지 드를 활용 한 단계 바이러스 성 게놈 및 streptavidin 입히는 구슬 (그림 2B)에 관련 된 단백질의 정화를 촉진 하기 위하여 화학을 클릭 합니다. 중요 한 것은, 감염 vDNA의 특정 라벨 수 있도록 세포 DNA 복제에 종사 하지 않습니다 고정 된 셀에서 수행 됩니다. 또한, HSV-1 감염 세포 주기 검거 원인과 세포 DNA 복제23,24를 억제 합니다. 바이러스를 들어오는 바이러스 성 게놈 (그림 1A)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 감염 전에 prelabeled 또는 새로 합성된 vDNA (그림 1B)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 DNA 복제 하는 동안 표시 수 있습니다. 25. 또한, 펄스 체이스 분석 바이러스 성 복제 포크 (그림 1C)26와 관련 된 단백질의 특성을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, ethynyl 수정 vDNA 단백질 역동성 (그림 2A 및 그림 3)의 공간을 위해 fluorophore를 covalently 활용 될 수 있습니다. 이미징은 vDNA의 직접적인 시각화에 대 한 허용 및 vDNA-단백질 상호 작용의 유효성 검사에 대 한 무료 접근 이며 감염을 통해 바이러스 성 게놈을 추적 하기 위해 적용할 수 있습니다. 우리 예상 대기 시간 및 재 조직를 포함 하 여 herpesviral 감염의 어떤 양상 든 지 공부 하 고 다른 DNA 바이러스 연구를 이러한 접근 더 수정 될 수 있습니다. 또한, 5-ethynyl uridine로 (EU) RNA 바이러스 성 게놈의 분석에 대 한 허용할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 세포 배양, 바이러스 성 감염 및 EdC 라벨 ( 그림 1)

다음 프로토콜 작업 바이러스를 포함. 학교를 참조 하십시오 ' 바이러스 및 다른 생물 학적 에이전트의 안전한 취급에 관한 s 바이오 안전 프로토콜. 이 프로토콜의 피츠버그 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.

  1. MRC-5 셀 confluent 150 cm 2 조직 배양 플라스 크를 trypsinize 하 고 600 cm 2 조직 문화 접시 100ml DMEM 플러스 10%를 포함 하는 셀 전송 FBS. Confluency 및 고정 단계를 도달 하기 위하여 3-4 일의 5% CO 2의 37 ° C에서 품 어. Confluent 600 cm 2 접시 7을 ~ 10 7 셀에 포함 되어 있습니다. 각 조건에 대해 1 접시와 각 해당 부정적인 컨트롤 1 접시 준비.
    참고: 셀 그 유일한 vDNA를 분류 하 고 이후 단계에서 정화 되도록 세포 DNA 복제를 억제 하는 고정 단계에 도달 해야 합니다.
    참고: 각 샘플 필요 합니다 무료로 동일한 감염 조건 및 EdC의 추가 없이 시간 포인트를 사용 하 여 준비 하는 부정적인 컨트롤 레이블 없음.
    참고:이 실험의 버전을 축소 하는 A 실행 되어야 한다 유사한 세포 성장, 감염, EdC 조건, 라벨을 사용 하 여 이미징에 의해 세포 DNA의 라벨에 대 한 테스트 및 포인트를 시간에 (단계 2 참조).
  2. 7 x 10 8 PFU HSV-1 7 mL에 희석 찬 Tris-Buffered 염 분 (TBS). 성장 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 저장 감염, MRC-5 셀을 실 온에서 1 h 바위 7 mL 희석된 바이러스를 추가 합니다. 흡착, 다음 inoculum을 제거 하 고 50 mL 실내 온도 TBS, 린스 원래 성장 매체를 대체. 5% CO 2의 37 ° C에서 품 어. 각 실험 조건 및 부정적인 제어를 위해이 단계를 실시 한다.
    참고: 증가 EdC 라벨 얻을 수 바이러스 성 dUTPase (UL50 유전자) uracil glycosylase (UL2 유전자)의 표현에 대 한 결함이 HSV-1 돌연변이 사용 하 여. HSV-1 dUTPase는 낮은 기질 특이성 및 여러 nucleoside 아날로그 25 , 27의 활성화를 줄일 수 있다.
  3. 레이블 EdC와 바이러스 성 게놈입니다. 들어오는 게놈 (1.3.1.), 유전자 (1.3.2.), 또는 바이러스 성 복제 포크 (1.3.3) 복제를 지시를 따릅니다.
    참고: 유일한 단계 1.3.1, 1.3.2, 또는 1.3.3 실행 되어야 한다 있는지 여부에 따라 들어오는 게놈, 복제 된 유전자, 또는 복제 포크 후속 단계에 각각 분석.
    참고: 듀 또는 f-아 듀 EdC에 교체하실 수 있습니다. Nucleoside 아날로그의 독성 모니터링 하 고 최소화 해야 합니다.
  4. 사용
      prelabeled 감염 단계 1.2에서 수행 하 고 2 단계로 진행 하는 주식 또는 3 4 h 이내 게시물 감염 (hpi) 복제 되지 않은 vDNA ( 그림 1A)를 조사 하.
      참고: 앞에서 설명한 프로토콜 25를 사용 하 여 주식 prelabeled 바이러스를 준비 합니다. 바이러스 주식 어떤 잔여 EdC를 제거 하려면 G-25 열을 통과 해야 합니다.
    1. 5-25 µ M를 추가 하 여 복제 vDNA 라벨 2-4 h ( 그림 1B)에 감염 된 세포의 세포 배양에 EdC. 추가 하기 전에, 성장 매체의 1 mL에 EdC 희석.
    2. VDNA 복제의 발병 후 바이러스 성 복제 포크를 (≥ 4 hpi), 5-25 µ M와 vDNA 복제 펄스 레이블 EdC 5-20 분. 추격, 체이스 매체 포함 하는 25-100 µ M 2´deoxycytidine와 3 배를 씻어 (deoxyC), 및 다음 추가 20-40 분 ( 그림 1C) 체이스 매체의 품 어.
      참고: 펄스와 체이스 매체를 사용 하기 전에 37 ° C, 5% CO 2 equilibrated 한다.
      참고: 펄스 추적 실험, 그것은 입력 하는 셀 고 DNA 복제에 포함 될 수 있습니다 전에 phosphorylated nucleosides 하는 데 걸리는 시간을 고려 하는 것이 중요. 이 실험적으로 결정 되어야 합니다.
      참고: 펄스 체이스 실험의 해상도 확인 하려면 사용 하는 실험 조건 하에서 바이러스 성 복제 속도 계산 합니다. 이는 한 단계 성장 시간 코스 26 동안 바이러스 성 게놈의 양이 많은 PCR에 의해 결정 될 수 있다.
      참고: 바이러스 성 게놈을 이미징에 대 한 2 단계를 진행 하 고 바이러스 성 게놈의 정화에 대 한 3 단계를 진행.

2. EdC의 영상 DNA ( 그림 2A) 라는

참고: 그것은 영상에에서 세포질 DNA 실험에 표시 되지 않는 확인 하려면 바이러스 성 게놈 정화 방법으로 수행 하는 데 유용. 영상 또한 레이블된 vDNA의 특성을 시각화 하 고 proteomics 데이터 유효성 검사를 사용할 수 있습니다. 패턴을 얼룩이 지는 세포와 바이러스 성 DNA의 예는 그림 3에 나와 있습니다.

  1. 감염 수행 및 성장 매체의 1 mL를 포함 하는 12 음 조직 문화 접시에 coverslips에 조건 EdC 라벨을 사용 하 여 제외 하 고 1 단계에서에서 표시 된 대로 축소.
  2. 1 mL 3.7%와 수정 셀 paraformaldehyde 실시간에 15 분 동안 1 x PBS에서 고정, 후 린스 세포를 PBS에서 1 mL 3 %BSA 2 x.
    주의: Paraformaldehyde 심각한 또는 영구적인 부상을 일으킬 수 있습니다. 안전 예방 조치를 따르십시오.
    참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 및 coverslips 두 번째 세척에 4 ° C에서 최대 3 일 동안 저장할 수 있습니다.
  3. 1 mL permeabilization 버퍼와 세포를 permeabilize [참조 테이블의 자료] 락을 하는 동안 실 온에서 20 분.
  4. 흔들어 3 %BSA 한 다음 실 온에서 30 분 PBS에 1 mL 3 %BSA 블록 1 mL로 씻어.
  5. 칵테일 클릭 반응의 1 개 mL를 추가 [참조 테이블의 자료] covalently 알 렉 사 Fluor 488 켤레를 coverslips에 EdC에 아 지 드 라는 DNA. 락을 하는 동안 30 분 동안 실 온에서 품 어. 발음 및 1 mL의 PBS로 두 번 씻어.
  6. 락을 하는 동안 실 온에서 30 분 PBS에 Hoechst의 1:2,000 희석의 1 mL와 함께 얼룩 세포질 DNA. 발음 및 1 mL의 PBS로 두 번 씻어.
  7. 얼룩 표준 차 및 2 차 항 체와 간접 면역 형광 검사 프로토콜 25.
    참고: 레이블된 vDNA colocalizes ICP8, ICP4, 또는 UL42 및 세포 라는 DNA Hoechst 얼룩과 colocalizes.
  8. 슬라이드에 coverslips를 탑재 하 고 형광 현미경을 사용 하 여 셀을 이미지.
    참고: 슬라이드 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 동안.

3. VDNA와 관련 된 단백질의 정화

참고:이 프로토콜의 몇 가지 측면에서 양조위 외 적응 되었습니다 22
참고: 모든 버퍼 및 시 약은 사용 하기 전에 얼음에 냉장 해야 하 고 모든 단계 실행 되어야 한다 얼음에 달리 명시 하지 않는 한.

  1. 핵 수확.
    참고: 핵의 격리, 하기 전에 포름알데히드 crosslink 단백질 DNA 사용할 수 있습니다. 더 엄격한 세척 조건 다음 streptavidin 입히는 구슬에 DNA 정화 하는 동안 사용할 수 있습니다. Cr에 대 한osslinking와 세척 조건 참조 Sirbu 외. 21.
    1. 20 mL 핵 추출 버퍼 (코)와 성장 매체를 대체 하 고 가끔 락 4 ° C에서 20 분 동안 품 어. 핵 현미경에 표시 될 것입니다.
    2. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시에서 핵을 긁 고 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 작은 핵, 삭제는 상쾌한 하 4 ° C에서 2500 x g에서 10 분 원심 분리기.
      참고: Trypan 푸른 얼룩 세포에서 핵의 절연을 확인을 사용할 수 있습니다.
    3. 부드럽게 10 ml PBS, 15 mL 원뿔 튜브에 핵 펠 릿을 꺼내 려 하 고 4 ° C. 완전히 제거 PBS에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 의해 펠 렛.
      참고: 핵 얼 수 있다 고 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다. 이렇게 하려면 부드럽게 500에서 핵 펠 릿을 resuspend µ L 고정 버퍼 및 에탄올/드라이 아이스 목욕 튜브를 품 어. -80 ° c.에 언된 핵 저장 사용 하기 전에, 핵 실 온에서 해 동 하 고 신속 하 게 얼음, 10 mL PBS, 혼합, 4 ° C에서 2500 x g에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 펠 렛을 부드럽게 록 추가 전송 완전히 PBS를 제거 합니다. 감소 된 수확량 귀 착될 지도 모른다 핵 동결.
  2. 아 지 biotin-covalently 어원이 드 EdC 표시 vDNA.
  3. 10 mL 클릭 반응에서 핵 펠 릿 혼합 [참조 테이블의 자료] 부드럽게 위아래로 pipetting으로 5 번 10ml 피펫으로 resuspend
      .
      참고: 그것은 중요 한 클릭 반응 혼합에 포함 시 약 표시 된 순서로 추가 됩니다.
    1. 1 h 4 ° c.에 대 한 회전 회전 하는 동안 준비 하 고 버퍼 B1, B2 및 B3 [재료의 표 참조] 진정.
    2. 4 ° C. 완전히 제거에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 여 펠 릿 핵 반응 혼합을 클릭 하 고 부드럽게 10 mL PBS에에서 resuspending 및 4에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 펠 릿을 세척 ° c.
    3. 부드럽게 1 mL PBS에서에서 핵 펠 릿과 큰 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 1.5 mL microfuge 관에 resuspend. 2500 x 4 ° C. 완전히 제거 PBS에서 g와 플래시 동결 액체 질소에에서 10 분 동안 centrifuging 여 핵을 펠 렛.
      참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다이 시점에서 하 고 얼어붙은 핵 핵 될 플래시 단계 3.3 같은 날에 진행 하는 경우에 동결 하는 것이 좋습니다 그래서-80 ° c. 동결 해 동 수 후속 세포에 저장 될 수 있다.
  4. Lyse 핵과 DNA 조각.
    1. 얼음에 핵을 녹여 고 아래로 pipetting으로 버퍼 B1 500 µ L에서 resuspend. 45 분에 대 한 얼음에 품 어
    2. Sonicate 샘플 6 회 30 s 각 40% 진폭 3mm microtip 프로브를 사용 하 여. 30 대 한 얼음에 견본을 두 펄스 사이 s. 쥡니다, 샘플 표시 명확 하 고, 아니 흐린.
      참고: 쥡니다 조건 개별 sonicators에 대 한 최적화 되어야 합니다. 쥡니다 조건을 최적화 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 참조 렁 외. 22.
    3. centrifuging 14000 x g 4 ° c.에서 10 분에 의해 세포 파편을 펠 렛 펠 릿 크기는 크게 감소 한다. 100 µ M 셀 스 트레이너를 통해는 상쾌한을 필터링 하 고 유지를 통해 흐름.
    4. 추가 500 µ L이이 샘플의 필터링 된 상쾌한. 900 µ L 버퍼 B2 단계 3.4.2에서에서 사용 됩니다.
    5. DNA 절연 (50 µ L 또는 1/20 볼륨)에 대 한 각 상태의 약 수 고 추가 SDS-중 탄산 솔루션 x 50 µ L 2 [재료의 표 참조]. DNA 격리 프로토콜 (단계 3.6) 진행.
    6. 입력된 단백질 (50 µ L 또는 1/20 볼륨)에 대 한 각 상태의 약 수 Laemmli 샘플 버퍼 x 50 µ L 2를 추가, 액체 질소에서 냉동 고-80에서 저장 ° C. 사용 단계 3.5.6에서에서.
  5. Streptavidin 바인딩 biotinylated DNA 코팅 구슬.
  6. 1.5 mL microfuge 관에 구슬 슬러리의 300 µ L를 전송 하 여 준비 Streptavidin T1 자석 구슬
      . 샘플 당 구슬의 1 개의 관을 준비 합니다. 워시 비즈 1 mL 버퍼 B2 resuspend에 vortexing, 자석 구슬, 분리를 적용 하 고 발음 워시 버퍼와 함께 3 x.
      참고: 최적화 조건 결과 최대화 항복에 최소한의 배경 바인딩 바인딩. 그것은 실험적으로 Streptavidin T1 자석 구슬 agarose 구슬, 뿐만 아니라 다른 Streptavidin 구슬 보다 갈수록 배경 바인딩 Streptavidin C1 비즈 보다 상당히 큰 바인딩 능력을가지고 결정 했다 ( 그림 4A ).
    1. 단계 3.3.4에서에서 샘플의 추가 900 µ L. 씻어 구슬 하 고 회전 4에서 하룻밤 ° c.
      참고: 샘플은 그들에 게 추가 되 면 소용돌이 구슬 하지 마십시오.
      참고: 경우 상당한 양의 DNA 또는 단백질 레이블이 없는 부정적인 제어에 격리 되어,이 단계에서에서 줄일 수 있습니다 하룻밤을 줄이기 위해 배경 바인딩 4 h.
  7. 구슬 세척 하 고 vDNA와 관련 된 단백질을 elute.
    참고:이 좋습니다 나머지 단계에 대 한 필터 팁을 사용 하 여.
  8. 마그네틱 microfuge 관 랙, 제거 상쾌한 장소 샘플 부드럽게 1 ml 버퍼 B2, 회전 4 ° C에서 5 분에 대 한 resuspend
    1. 반복 단계 3.5.1 세 번.
    2. 마그네틱 microfuge 관 랙 샘플, 상쾌한 제거, 부드럽게 1 ml 버퍼 B3, resuspend 놓고 5 분의 4 ° C에서 회전
    3. 전송 100 µ L 혼합물 (1/10 번째 볼륨) 바인딩된 DNA 분리에 대 한 새로운 튜브 구슬. 자석에이 튜브를 적용, 상쾌한 제거, SDS-중 탄산 솔루션 x 100 µ L 1에에서 구슬 resuspend 및 DNA 격리 프로토콜 (단계 3.6) 진행.
    4. 단계 3.5.3에서에서 나머지 900 µ L 비드 혼합물을 포함 하는 튜브 적용. 자석, 상쾌한, 제거 및 단백질 및 DNA 단백질 복합물을 elute Laemmli 샘플 버퍼 x 50 µ L 2에에서 구슬 resuspend.
    5. 종 샘플에서 95 ° C 15 분, 소용돌이, 빠르고 microfuge에 회전 자석 적용. 새로운 튜브, 플래시 동결, 그리고-80에 게 eluate 전송 ° c.
      참고: 사용 모자 자물쇠 튜브 팝업 하지 않습니다 보장 하기 위해 끓는 동안 열.
      참고: 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다 및 샘플 몇 주 동안-80 ° C에 저장 될 수 있습니다.
    6. Coomassie 파란 얼룩, 부 럽, 또는 표준 절차 25 질량 분석 분석 단백질 견본. 대표 결과 그림 4 및 그림 5에 표시 됩니다.
      참고: 단백질 수율 질량 분석에 대 한 충분 한 인지를 확인 하려면 각 샘플의 7.5 µ L은 분석 Coomassie 블루 얼룩 및 사용 대표적인 바이러스 성 게놈의 서 부 럽 대 7.5 µ L 관련 단백질 (ICP4, ICP8, 또는 UL42). 단계의 3.3.6 lysates의 같은 볼륨. 입력된 단백질 수준에 대 한 제어와 함께 실행 됩니다. 나머지 샘플 (35 µ L) 질량 분석 후 분석 앞에서 설명한 25.
  9. DNA 격리
    1. 단계 3.3.5에서에서 샘플을 품 어. 및 3.5.4. 필요한 경우 4-16 h. 제거 65 ° C에서 자석 구슬에서 샘플.
    2. 150 µ L 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (PCI)와 샘플을 추출 하 고 새 튜브를 수성 단계 전송.
    3. 100 µ L와 나머지 PCI 추출 트리 스-EDTA (테) 새로운 튜브에 수성 단계 추가.
    4. 200 µ L 클로 프롬: isoamyl 알콜 (24:1)와 샘플 추출.
    5. 정화 수성 단계 제조 업체에 따라 PCR 정화 키트를 사용 하 여 ' s 프로토콜.
      참고: 버퍼 샌드위치에 pH 표시기 샘플에 추가 될 때 자주색 돌 것 이다. 추가 10 & #181. L 3 M NaOAc pH 5.0 샘플의 pH 감소.
    6. 결정 DNA 농도 fluorometer를 사용 하 여.
      참고:이 프로토콜은 일반적으로 100-400 ng 비드 바인딩된 DNA 생성합니다. 아니 DNA는 EdC 1.3 단계에서에서 추가 되지 않은 부정적인 컨트롤의 eluate에서 감지 해야 합니다.
    7. DNA 낮은 DNA 바인딩에 저장할 수 있습니다 4 또는-20 ° C에서 튜브와 실시간 PCR 또는 높은 처리량 시퀀싱 분석에 사용할 수 있습니다.

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결과

세포에서 DNA의 정화에 대 한 클릭 화학을 사용 하 여 먼저 iPOND 메서드21에 의해 달성 되었다. IPOND의 목적은 정화 관련된 단백질의 id에 대 한 세포 복제 포크입니다. 우리는 특별히 감염 시 vDNA 단백질 상호 작용 연구에이 기술을 적응 시켰다. EdC (그림 1)와 함께 동기화 된 감염, 바이러스 성 게놈을 접근의 조작 선택적 분리와 vDNA의 별도 인구 조사에 대 한 허용 했다. HSV-1 DNA 이미징 fluorophore 또는 biotin 정화 (그림 2)에 대 한 공유 첨부 파일을 촉진 하기 위하여 EdC (그림 1)으로 표시 됩니다. 바이러스 들어오는 게놈 (그림 1A)와 관련 된 단백질의...

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토론

이 프로토콜에는 여러 단계를 신중 하 게 따르지 않으면 크게 감소 단백질 수확량 또는 세포질 DNA로 오염 될 수 있습니다 포함 되어 있습니다. 그것은 중요 한 세포질 DNA는 하지 표시 하 고 정화 고정 셀 모든 실험을 위해 사용 됩니다. 이것은 단백질 견본에 세포질 DNA polymerases의 부재에 의해 HSV-1 게놈 종합을 위한 세포질 DNA 중 합 효소를 사용 하지 않습니다 때문에 확인할 수 있습니다. EdC 라벨 및 수확 단계 핵, 샘플은 각각 동등 하 게 처리 되도록 정열 한다. 정화 단계 하지 너무 많이 pipetting으로 핵을 조작에 배려를가지고 한다. 이 핵, 피펫으로 팁의 측면에 집착으로 샘플 손실의 조 lysis로 이어질 수 있습니다. 또한, 쥡니다 단계 개별 sonicators에 대 한 최적화 되어야 합니다 및 biotin 바인딩에 사용 되는 streptavidin 입히는 구슬의 양을 최적의 단백질 생산량에 대 한 적정 한다.

몇 가지 수정이이 프로토...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는이 원고 준비에 대 한 도움 한 나 폭스를 인정합니다. 이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01AI030612를 부여.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MRC-5 세포ATCCCCL-171
태아 소 세럼 (FBS)Gibco26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-08210% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM 로 대체; (플라스크 내 성장용) 또는 30mM(접시 내 성장용) 나트륨-중카르비네이
600cm2 조직 배양 접시Thermo Fisher Scientific166508
Tris 완충 식염수(TBS), pH 7.4137mM NaCl, 5mM KCl, 491mM MgCl, 680mM CaCl, 25.1mM Tricine
HSV-1 스톡역가가 1x109 PFU/mL보다 큰 스톡이 가장 적합합니다
.세파덱스 G-25  컬럼 (PD-10 탈염 컬럼)GE 헬스케어17085101
디메틸 설폭사이드(DMSO)Fisher ScientificD128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC)Sigma-AldrichT511307DMSO에 용해하여 40mM 재고, 분취 및 -20°C에 보관합니다. 씨 
2´-deoxycytidine (deoxyC)Sigma-AldrichD3897물에 용해시켜 40mM 재고, 분취 및 -20°C에 보관합니다. 씨 
핵 추출 완충액(NEB)신선한(20mM Hepes pH 7.2, 50mM NaCl, 3mM MgCl2, 300mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraperBellco glass7731-22000사용 전 오토클레이브
Trypan blue solutionSigma-AldrichT8154
PBS, pH 7.2 (10x)1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (사용 전에 멸균수에서 1x로 희석)
구리(II) 황산염 5수화물(CuSO4-5H2O)Fisher ScientificC489100mM 재고를 준비하고 4°C에서 보관합니다. C 최대 1개월
동안(+) 나트륨 L-아스코르브산염 시그마-알드리치A4034100 mM 재고를 신선하게 준비하고 얼음에 보관
비오틴 아지드인비트로젠B10184DMSO에 10 mM 재고를 준비하고, 분취량, -20°C에서 보관; C 최대 1년 
반응 혼합준비를 클릭하십시오 (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)   
완전한 프로테아제 억제제 칵테일로슈116974980011 mL 물에 용해시켜 50x 재고를 준비하고, 4 °에서 저장할 수 있습니다; C 최대 1 주일 동안 또는 직접 50 mL 버퍼에 1 알약을 추가
동결 버퍼신선한 준비 (7 mL 100 % 글리세롤, 3 mL NEB, 200 μ L 50x 프로테아제 억제제)
버퍼 B1신선한 준비 (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x 프로테아제 억제제)
버퍼 B2신선한 준비 (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x 프로테아제 억제제)
버퍼 B3신선한 준비 (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x 프로테아제 억제제)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer 3mm 마이크로팁 프로브SonicsVCX 130
Cell strainerFalcon352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65601
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Mini-Tube RotatorFisher Scientific260750F
2x Laemmli 샘플 버퍼400mL 물에 SDS 400mg, 100% 글리세롤 2mL, 1M 트리스(pH 6.8) 1.25mL 및 브로모페놀 블루 10mg을 혼합합니다. 4 에 매장 &데그; C는 최대 6개월 동안 사용할 수 있습니다. 사용하기 전에 1M DTT를 최종 농도 200mM에 첨가하십시오.
1.5 mL 튜브용 캡 잠금 장치, Fisher ScientificNC9679153
표준 웨스턴 블로팅 시약
, NOVEX 콜로이드 블루 염색 키트,InvitrogenLC6025
12웰 조직 배양 접시Corning3513
커버슬립,Fisher Scientific12-545-100사용
전 오토클레이브현미경 슬라이드Fisher Scientific12-552-5
16% 파라포름알데히드전자 현미경 과학15710사용 전 1x PBS에서 3.7%로 희석
소 혈청 알부민(BSA)Fisher ScientificBP16051x PBS
투과 완충액(0.5% Triton-X 100Sigma-AldrichT87871x PBS
에서 0.5% Triton-X 100 준비클릭 반응 칵테일 - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 이미징 키트분자 프로브C10337제조사 프로토콜에 따라 준비
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399물에 10 mg/mL 준비, 4°C에서 저장 가능; 최대 1년
동안 마우스 anti-ICP8 1차 항체Abcamab201941x PBS
마우스 anti-UL42 1차 항체(2H4)Abcamab193111:200 희석 사용 1x
PBS Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibodyLife Technologiesa110051:500 희석 사용
2x SDS-bicarb 용액2% SDS, 200 mM NaHCO3
페놀:클로로포름:이소아밀 알코올믹스 25:24:1 사용 최소 1일 전, 4°C에서 보관하십시오. 어두운
클로로포름의 C : 이소 아밀 알코올24 : 1 사용 최소 1 일 전에 실온에서 보관하십시오
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0100 mM Tris, 10 mM EDTA (사용 전 1x로 희석)
Qiaquick PCR 정제 키트Qiagen28104
3 M 아세트산 나트륨 pH 5.2
Qubit 2.0 형광계InvitrogenQ32866
Qubit dsDNA HS 어세이 키트, InvitrogenQ32851
Qubit 어세이 튜브이미징 소프트웨어가
형광 현미경
문화 인큐베이터
생물 안전 캐비닛
열 블록65 ° C 및 95 ° 씨
트 합니다. 표시된 순서로 시약을 추가하여 사용 직전에 는 , )에서 3% 준비 에 1x PBS Immu-mount Thermo Fisher Scientific 9990402에 , 장착된 Invitrogen Q32856 , 1.5mL 튜브용 마이크로 원심분리기, 15mL 및 50mL 튜브용 테이블탑 원심분리기, 세포

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