방법 논문

전체 셀 전류 두뇌 분할 영역에서 GABA의 퍼프 응용 프로그램에 의해 유도 된

DOI:

10.3791/56387

⸱

2017년 10월 12일

 ,  ,  , 
1School of Psychology, South China Normal University, 2School of Life Sciences, South China Normal University, 3Brain Science Institute, South China Normal University, 4Center for Studies of Psychological Application, South China Normal University, 5Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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우리는 약리 시 약 전체 셀 패치 클램프 기록 하는 동안 관리 될 수 및 그것의 성공에 대 한 중요 한 기능의 다양 한 측면을 강조 퍼프 기술을 설명 합니다.

초록

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약리학 관리 전체 셀 패치 클램프 두뇌 조각에서 녹화를 할 때 주로 사용 됩니다. Electrophysiological 녹음 중 약물 응용 프로그램의 가장 좋은 방법 중 하나는 두뇌 조각에서 신경 활동에 약리 시 약의 효과 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 퍼프 기술입니다. 퍼프 응용 프로그램의 가장 큰 장점은 그 녹음 사이트 약물 농도 증가, 따라서 방지 막 수용 체의 둔감. 퍼프 응용 프로그램의 성공적인 사용 주의 다음과 같은 요소를 포함: 약물의 농도, 퍼프 micropipette, 퍼프 micropipette 기록, 신경의 끝 및 기간 사이의 거리의 매개 변수 및 퍼프는 운전 압력 (평방 인치 당 파운드 psi). 이 문서에서는 피 감마-aminobutyric 산 (GABA) 전 두 엽 피 질 조각의 뉴런에 의해 유도 된 전체 셀 전류를 기록 하기 위한 단계별 절차를 설명 합니다. 특히, 마가, 등 다른 두뇌 지역 그리고 다른 준비, 세포 배양 등 사소한 수정 같은 절차를 적용할 수 있습니다.

서론

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패치 클램프 기술, 뉴런의 전기 신호를 조사 하기 위한 기본 도구는 1970 년대1,2에서 개발 되었다. 이 기술의 주요 장점은 어떻게 특정 치료에 지식을 제공 한다는 것입니다 (예를 들어, 약리) 신경 기능 또는 실시간으로3채널을 변경할 수 있습니다. 전체 셀 두뇌 조각에서 녹음 하는 동안 신경 기능 약리학 평가 기록 되 고 신경에 촉진제 또는 특정 수용 체의 길 항 제와 같은 약물의 응용 프로그램을 필요 합니다. 이 메서드는4신경 생리 적 및 병 적인 속성을 더 잘 이해 하는 특정 약물의 응용 프로그램에 따라 발생 하는 신경 변경 식별 수 있습니다. 약리학 관리 중 관류5 또는 퍼프6을 통해 수행할 수 있습니다, 비록 후자의 우수한 기술입니다. 특히: (i) 응용 프로그램을 빠르게 퍼프 증가 약물 농도 수준으로 기록 된 신경 주위를 막 수용 체의 탈 감 작 예방; (ii) 부풀어 약물의 볼륨이 매우 낮은, 따라서 뇌 조각;에 관리 화학 물질의 어떤 바람직하지 않은 효과 감소 시키는 목욕 솔루션에는 효과가 거의 되도록 (iii) 퍼프 프로토콜 수 설정 하 고 저장, 실험을 매우 정확 하 게 재현할 수; 만들기 (iv) 퍼프 응용 촉진제/길 항 근, 특히 어디 이러한 시 약 인지 비싼 얻기 어려운의 경제적인 사용을 나타냅니다.

여기, 우리는 심하게 준비 뇌 조각, 상대적으로 잘 보존 된 두뇌 회로의 장점이 준비에에서 GABA를 피에 의해 유도 된 전체 셀 전류 기록에 집중할 것 이다. 우리가 퍼프 유발 억제 전류7 을 수행 하는 방법이 문서에서 설명 합니다. 세 슘 (Cs+)를 사용 하 여-기반 내부 솔루션, 그리고 0에서 신경 세포를 들고 mV, GABA-퍼프 갖는 소개 합니다 적절 한 기술적 세부 사항 가진 금지 postsynaptic 전류 (eIPSCs). 우리는 eIPSC 보여 lipopolysaccharide (LPS) 주입8에 의해 유도 된 우울증의 마우스 모델을 사용 하 여 GABA 퍼프에 의해 갖는 진폭 차량 컨트롤에 비해 LPS-주입 마우스의 조각에 상당히 절감 됩니다. 우리의 의도이 문서가 어떻게 퍼프 기술 두뇌 조각에서 신경 활동에 어떤 화학 물질, 화합물 또는 약의 효과 평가 하기 위한 연구에 널리 적용 되는 표시 한다.

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프로토콜

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동물 주택 및 모든 동물 실험 동물 관리의 국립 연구소에 의해 설립에 대 한 지침에 따라 남 중국 사범 대학에서 동물 연구에 대 한 윤리 위원회에 의해 승인 절차에 따라 실시 했다 건강.

1. 준비의 솔루션

  1. 표준 인공 뇌 척추 액체의 (실제) 우리의 출판된 작업 7에서 설명 하는 표 1에 나열 된 구성 요소가 포함 된 준비 500 mL. 신선한 실제 솔루션을 준비 하는 이온된 수로
    1. 사용 깨끗 한 유리 비 커. 이온된 수와 주걱을 청소 하 고 NaCl, KCl, NaH를 추가 하려면 사용 하기 전에 건조 2 포 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-포도 당, CaCl 2 95% O 2 / 5% 솔루션 부풀어 데 후 추가 공동 2 ~ 20 분 (에 표 1)으로 500 mL 이온된 수의 혼합물. 완전히 녹아 때까지 저 어.
    2. 확인은 실제는 완전 하 게 어떤 강 수 없이 취소 합니다. PH 7.2-7.4로 조정 합니다. 95% O 2와 5% CO 2 ~ 20 분에 대 한 가스 혼합물으로 거품
  2. 슬라이스 절단 솔루션 포함 하는 표 2에 설명 된 화학 7의 250 mL를 준비.
    1. KCl, MgCl 2, NaH 2 포 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-포도 당을 추가 하 고 1.1.1, 이온된 물 250 mL에에서 표시 된 마지막 CaCl 2를 추가 하 고 1.1.1와 1.1.2에 설명 된 대로 분해.
    2. 후 버블링 95% O 2 / 5% CO 2, 배치 솔루션 15-20 분 동안 냉장고에서 절단 솔루션은 차가운 하 고 부분적으로 냉동.
      참고: 우리가 사용 하 여이 절단 솔루션 1-2 달에서 분할 영역을 만들 때-오래 된 쥐; 수식을 마우스 2 개월 이상에 대 한 다를 수 있습니다.
    3. 살 균도 무료 isotonic 식 염 수에 용 해 하 여 준비 LPS 솔루션 (0.9 %NaCl). LPS는 intraperitoneally 관리 (0.5 mg/kg) 2 h 나중 녹음 시작.

2. 전 두 엽 피 질 조각의 준비

  1. 절단 솔루션 냉동 실에서 하 고 있는 비 자금을 얻기 위해 균질. 얼음에 솔루션을 놓고 거품 지속적으로 95% O 2 / 5% CO 2.
  2. 크고, 날카로운가 위를 사용 하 여 신속 하 게 설명 9 마우스를 목을 벨 고 즉시 머리 가득한 비 커에 얼음 (0-4 ° C) 절단 솔루션.
  3. 좋은 위 코 꼬리 방향으로 중간 선 따라 두개골의 상단을 잘라 고 측면 두개골 부분을 제거. 얼음 처럼 차가운 절단 솔루션으로 잘 주걱와 드롭 뇌 제거.
    주: 단계 2.2-2.3 빠르게 수행 되어야 합니다 (이상적으로 < 1 분).
  4. 얼음으로 채워진 9 cm 배양 접시의 뚜껑에는 두뇌를 놓습니다. 린스 차가운 절단 솔루션 두뇌. 소 뇌 및 후 각 전구는 면도날으로 잘라.
  5. 적용 cyanoacrylate 접착제는 견본에는 vibratome의 홀더. 조심 스럽게 뇌 블록에 접착제, rostral 쪽, 방울 놓고 즉시 얼음 절단 솔루션에 몰입할.
  6. 수평 비행기에 관하여 15 °의 각도를 vibratome의 블레이드 홀더를 조정 하 고 준비 350 µ m 코로나 뇌 조각 (블레이드 진동 주파수 = 85 Hz, 속도 = 0.1 m m/s).
  7. 95% O 2 / 5% 상수 버블링 (RT)에 1 시간에 대 한 품 어 전송 복구 챔버로 조각을 가득 실제, 한 피 펫을 사용 하 여, CO 2.

3. 전체 셀 패치 녹음

  1. 확인 유리 붕 규 산 micropipettes에 대 한 기록 전극으로 사용 하거나 끌어당기는 작동 설명서에는 특정 지침에 따라 micropipettes 퍼프. 전극, 기록에 대 한 팁 저항 범위 4-6 M에에서는 Ω, 퍼프 micropipettes 있는 팁 직경 범위 2-5 µ m.
  2. 블록 빠른 Na + 채널을 따라서 실제를 활동 전위 나 + 채널 차단 (TTX, 1 µ M)를 추가 하 고 챔버로 연동 펌프에 의해 녹음 실에서 2-3 mL/min이 솔루션의 일정 유량을 유지 그리고 그것의 포부입니다. 거품 실제 95% O 2 / 5% CO 2 조각의 생존 능력을 보장 하기 위해 지속적으로.
  3. 그 좋은 팁 조각 크기에 맞게 잘라 했다 수정 된 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 녹음 실로 두뇌 슬라이스를 전송 합니다. 백 금 조각 앵커와 슬라이스 병렬 나일론 스레드 간격 커버 ≥ 플랫폼에는 슬라이스를 2mm 떨어져.
  4. 내부 솔루션 7 (표 3), 녹음 micropipette 작성 및 10 µ M, 50 µ M, 100 µ M (실제에 녹아 있는), 또는 차량 제어로 실제에서 GABA와 퍼프 micropipettes를 작성.
  5. 파편과 막힘을 방지 하기 위해 가벼운 긍정적인 압력에는 실제 기록 전극 immersing 전에 1 mL 주사기를 사용 하 여 적용 됩니다. 팁 ( 그림 1 A) 모니터에 비디오 이미지의 중심에 표시 되도록 기록 전극과 퍼프 micropipette 위치 micromanipulator (4 x 렌즈), 현미경을 사용 하 여.
  6. 퍼프 micropipette 점차 줄이면서 현미경 초점 (40 x 렌즈)를 조정 하 고 45 °의 각도에서 녹음 신경 위에 그것을 배치. 퍼프 micropipette의 끝 및 20-40 µ m ( 그림 1 B) 기록 하는 뉴런 사이의 거리를 유지. 천천히, 그리고 신중 하 게 접근 기록 전극과 신경 하 고 긍정적인 압력 다음 놓습니다. 전극 홀더 기가 옴 씰을 만들에 연결 하는 튜브를 통해 약하고 짧은 흡입 적용.
  7. 유지 0 전압 mV입니다. 기가 옴 씰의 형성, 후 빠른 보상 하 고 수동 또는 자동으로 커패시턴스를 속도. 그런 다음 전체 셀 모드에 들어가 위에서 언급 한 튜브를 통해 짧고 강한 흡입을 적용.
  8. 전압 클램프에 기록 eIPSC 모드입니다. 퍼프 micropipette 퍼프 ( 그림 2) 단일 또는 짝 GABA를 제공 하는 마스터 8 전압 단계 발전기에 의해 제어 하는 Picospritzer를 사용 하 여 낮은 가스 압력 (질소, 4-6 psi) 적용.
  9. 최고의 eIPSC 결과 ( 그림 3) 우울증 LPS 유발 모델 ( 그림 4)에서 eIPSC를 측정 하는 퍼프 기간 변경.

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결과

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퍼프 기술은 특정된 뉴런의 표면에 특정 수용 체에 약물의 효과 연구 하는 연구자를 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 GABA 수용 체에 의해 중재 전류에 초점. 그림 1 에서는 퍼프와 녹음 micropipettes. 퍼프, 실제에 의해 생성 된 실제 압력의 기록 된 신경 세포에 어떤 영향을 제거 하 고 자당 퍼프 (그림 2A) 컨트롤로 사용 됩니다. GABA 퍼프 (블랙)에 의해 유도 된 응답 그림 2B와 같이 실제 워시 아웃 (블루)으로 초기 상태를 복구할 수 있습니다 하는 동안 보고 된10, picrotoxin와 같은 GABA 수용 체 억제제에 의해 막힐 수 있다. 특히,는 실제도 자당 퍼프 유도 응답,...

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토론

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퍼프 응용 프로그램은 널리 postsynaptic 수용 체 기능3,,47, 평가 하는 데 사용 됩니다 하지만 각 실험에 정확한 컨트롤을 요구 한다. 여기에 나온 전 두 엽 피 질 뇌 조각에서 Ipsc (즉, eIPSCs)을 유도 하는 GABA 퍼프 전체 셀 패치 클램핑 관련 절차를 설명 합니다. 기록 전극의 저항은 약 5 m ω, 퍼프 micropipettes의 팁 직경에 대해 2-5 µ m. 퍼프 압력은 4-6 psi 사이:이 범위는 중요 한, 높은 압력 낮은 압력 귀 착될 수 있다 하는 동안 신경 손상 발생할 수 있습니다로 postsynaptic GABA 수용 체의 활성화 부족입니다. 에 대 한 기록 하는 뉴런에 퍼프 micropipette의 끝에서 수평 거리는 20-40 µ m (1-2 신경의 직경), 그리고 퍼프 micropipette 슬라이스 표면 사이의...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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저자는 다음 단체를 감사 하 고 싶습니다: 국가 자연 과학 재단의 중국 (31171018, 31171355), 과학 및 기술 부의 광 (2013KJCX0054), 자연 과학 재단의 광 동성 ( 2014A030313418, 2014A030313440), 광저우 과학 및 기술 관리국 (201607010320).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
유리 붕규산 마이크로 피펫셔터 기기BF150-86-10외경 1.50mm; 내경 0.86mm
마이크로 피펫 풀러셔터 기기모델 P-97 플레밍/브로우 마이크로피펫 풀러
Micromanipulators셔터 악기MP-285
컴퓨터 제어 증폭기     분자 장치Multiclamp 700B
디지털 수집 시스템 Molecular DevicesDigidata 1440A
이미징 카메라Nikon 2115001검사 장비
현미경 니콘 이클립스 FN1 
마스터 8A.M.P.I.Master-8 펄스 자극기
Vibratome SlicerLeicaVT 1000S
면도날질레트74-SFLYING EAGLE
비디오 모니터PanasonicWV-BM 1410
502 GlueDeli7146Cyanoacrylate Glue
연동 펌프Shanghai JIA PENG CorporationBT100-1F
비디오 카메라올림푸스 아메리카 의료OLY-150
전사 피펫Biologix30-0138A1

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
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  5. Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33(2012).
  6. Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
  7. Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
  8. Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
  9. Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
  11. Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
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  13. Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).

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GABAIPSC

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