살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

요약

계량 misfolded 단백질의 집계 하는 방법을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 세부 사항을 lentiviral 안정적인 셀 라인 생성, 자동된 confocal 영상, 및 단백질의 이미지 분석을 유도 한다. 설명 응용 프로그램으로 우리는 SOD1 집계 시간 복용량에 따라 방식에서 홍보에 작은 분자의 효과 공부 했습니다.

초록

루 경화 증 (ALS) 유전자 인코딩 구리-아연 superoxide dismutase 1 (SOD1)에서 상속 된 돌연변이 의해 발생할 수 있는 치명적인 신경 질환 이다. SOD1의 구조적 불안정 및 가족 ALS 환자에 SOD1 긍정적인 포함 검색 misfolded 또는 집계 SOD1 ALS 병 리에 대 한 잠재적인 원인 역할을 지원합니다. 이 연구에서 우리는 높은 콘텐츠 접근을 차단 하 여 살아있는 세포에 SOD1 집계의 역학을 계량 하도록 세포 기반 분석 결과의 개발을 설명 합니다. 안정적인 셀 라인 표현 야생-타입 및 돌연변이 A4V SOD1 태그로 노란 형광 성 단백질 및 두 단백질 집단의 흔적 없이 cytosol에 표현 되었다 발견 lentiviral 벡터를 사용 하 여 생성 되었습니다. 흥미롭게도,만 SOD1 A4V HEK 293 안정적으로 표현 하지만 하지 U2OS 또는 SH SY5Y 셀 라인에 프로테아좀 억제제 처리 시 집계를 형성 했다. 우리는 다양 한 프로테아좀 억제제의 복용량 응답 분석을 기반으로 집계를 계량 하 고 시간 경과 현미경 검사 법에 의해 집계 형성 속도 론을 추적 가능 하다는 것을 보여줍니다. 우리의 접근 ALS 돌연변이의 역할에 SOD1 집계 형성에 효과 측정 SOD1 A4V 집계를 방지 하는 작은 분자에 대 한 심사의 가능성을 소개 합니다.

서론

단백질 집계는 생물학 과정을 단백질 그룹을 misfolded 및 신경 퇴행 성 질환 (amyloidosis)에 원인이 되는 에이전트 역할을 할 수는 있습니다. 단백질 집계 특성화 촉진은 병의 발병에 영향을 주는 새로운 요인의 발견에서 세포 장애 뿐만 집계의 역할 이해에 필수적 이다. 살아있는 세포에 형광 태그 단백질의 시각화 높은 콘텐츠 심사 (HCS)^1,2,,34에 적용 가능한 분석 실험의 개발에 도움이 수 있는 강력한 방법입니다.

루 경화 증 (ALS) 집계 가족 ALS (fALS)에 산발적 ALS (염)^{5,6 모터 신경에서 축적 하는 성향으로 misfolded 단백질의 존재로 인 한 proteopathic 질병으로 간주 됩니다.} . FALS 경우의 ~ 20%의 하위 집합 관련 된 인코딩 cytosolic 항 산화 효소 유전자에 지배적인 돌연변이와 구리-아연 superoxide dismutase 입력 1 (SOD1)^7,8. SOD1 변형, 탈 선 안정성, 증가 전개 속도, 집계^{9, 성향 등의 기능과 구조에 변화를 포함 하 여이 유전자 파생된 전에 대 한 몇 가지 잠재적인 원인 제안 되었습니다. 10}. 특히, 두 ALS 연결 된 SOD1 이체에 의해 공유 하는 유일한 확인 하 고 잠재적으로 유독한 속성 이며 야생-타입 (WT) SOD1 compartmentalized 단백질 집계 또는 배치할 포함^{11,12 형태로 증가 성향} . Misfolded 돌연변이 체 SOD1, 지속적으로 polyubiquitinated 이며, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 타락. 그 결과, 프로테아좀의 활동의 억제의 저수준 SOD1 집계^13,14, 수용 성 돌연변이 체 SOD1와 교환할 수 있는 수용 성 구성 요소 형태로 비정 질 구조를 구성 하는 돌연변이의 축적에 리드 cytosol¹⁵. 특히, SOD1 돌연변이 A4V에서 (알라닌 codon 4에서 valine 변경) 가장 일반적인 ALS를 일으키는 돌연변이 이며 2 년 미만 질병 발병¹⁶후의 평균 생존 시간 빠른 neurodegeneration을 리드. 화학적, SOD1 A4V monomerize, 집계, 녹말 체 모;를 형성 하는 증가 경향이 있다 그것의 기 공 같은 집계 다른 질병에 연결 된 돌연변이 형태, α-synuclein와 β 아 밀 로이드 단백질¹⁷등의 녹말 체 모와 비슷합니다. SOD1 집계 축적의 역학 연구, 가용성과 불용 성 SOD1 집계 형태를 모니터링 하기 위한 방법 개발 유지.

우리는 이전, 라이브 셀 이미징 사용 하 여 및 HEK 293 세포 형광 단백질 태그 SOD1, ALS 관련 돌연변이 SOD1 이합체 화 및 집계¹¹손상으로 뚜렷이 페. 과도 식 시스템 단기 유전자 overexpression의 생물 학적 결과 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다, 방법 원하는 유전자의 안정적인 통합을 제공 하는 분석 결과 개발에 대 한 선호 있을 수 있습니다. 따라서, lentiviral 벡터 포유류 세포 ¹⁸에 장기 및 규제 유전자 발현을 부여 하는 기능을 제공 합니다. 이 연구에서 우리가 재조합 lentivirus WT 베어링으로 불리고 안정적인 셀 라인의 세대에 집중 하 고 돌연변이 체 SOD1 태그 노란 형광 성 단백질 (YFP)와. 라이브 셀 이미징 현미경 SOD1 집계의 자동화 된 정량화에 사용 하 여, 우리는 실행 하 고 SOD1 집계 이벤트는 프로테아좀의 억제 시 계량.

프로토콜

1. lentivirus 생산

참고: 생산과 lentiviral 벡터의 조작 재조합 관련 된 연구를 위한 국가 학회 (NIH) 지침에 따라 실시 DNA입니다. 플라스 미드는 야생 형 및 A4V 돌연변이 체 SOD1 (SOD1WT-YFP 및 SOD1A4V YFP) 향상 된 YFP 태그로 인코딩 김 외에 설명 되어 있습니다. ¹¹ 두 유전자 융합 제품 PCR 뇌관 쌍 5를 사용 하 여 증폭 했다 ′-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3 ′ 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ pTRIP 델타 U3 CMV에 삽입 플라스 미드 ¹⁹ XhoI 및 BsrGI 금지 사이트를 사용 하 여. 이전 실험에서 HEK 293T 세포는 매 2 일 1:6 1: 4의 비율로 분할 했다. 20 개 이상의 통로 적은 60 %confluency 하는 데 도움이 좋은 transfection 효율 보장에서 세포의 유지 보수의 회피.

1. 에 1 일, 바이러스 생산을 위한 세포 배양 매체 (10 %FBS 4 m L-글루타민 m 높은 포도 당 DMEM) 10 mL에 10 cm 직경 조직 문화 접시 (3 x 10 ⁶ 셀/접시)에 30-40% 합류에서 HEK 293T 세포 분할.
2. 유지 10 cm 직경 조직 문화는 CO ₂ 배양 기 (37 ° C, 5% CO ₂)에서 하룻밤 접시.
3. 주 2에 준비 lentiviral 벡터 10 µ g를 포함 하는 DNA transfection 솔루션 (pTRIP-델타 U3 CMV-SOD1WT-YFP 또는-SOD1A4V-YFP)는 lentiviral 함께 플라스 미드 (5 µ g의 pVSVg, pCMV dR8.71의 10 µ g) (포장 그림 2A) ²⁰. 1 M CaCl ₂ 125 µ L을 추가 하 고 증류수를 사용 하 여 500 µ L에 양을 맞추십시오. 부드럽게 혼합물에 0.05 M HEPES의 500 µ L을 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
4. 바꾸기 HEK 293T 세포 10 mL가 미리 데워 진 신선한 문화 매체 항생제 무료 매체 1 mL DNA transfection 솔루션 혼합 하 고 37 ° C, 5% CO ₂에서 밤새 품 어.
5. 3 일에서 신선한 문화 매체와 셀 표면에 뜨는 바꿉니다.
6. 에 4 일, 수확 15 mL 튜브와 죽은 세포와 파편 제거 하 x 500g에 5 분 동안 원심 분리기에 상쾌한. 더 큰 60 mL 주사기를 사용 하 여 0.45 μ m 필터를 통해 그것을 전달 하 여는 상쾌한 정화. 즉시 단일 사용 aliquots (300 µ L)으로 분배 하 고-80 ° c.에 저장 최대 제품 활동을 유지 하기 위해 피하 동결-해 동 주기.

2. Lentiviral 변환

1. 분할 셀 라인 60% 합류에 감염 (HEK 293 세포와 SH-SY5Y; 잘 당 5 x 10 ⁵ 셀 및 U2OS; 잘 당 1 x 10 ⁵ 셀) 보충 DMEM 미디어의 2 mL에는 6 잘 조직 문화 접시 10 %FBS.
2. 6 잘 조직 배양 플레이트 37 ° C 배양 기에서 5% CO ₂에서 하룻밤 유지.
3. -80 ° C 냉장고에서 냉동된 lentivirus를 제거 하 고 각 사용 하기 전에 얼음에 약 수를 녹여; refreeze 하지.
4. 동안 바이러스 녹고 따뜻한 세포 배양 포함 하는 혈 청의 셀 라인와 호환. 일단 바이러스가 완전히 해 동 준비 희석의 범위 (1:3, 1:10, 1:30, 그리고 1: 100) 1.5 mL 신선한 microfuge 관에서 DMEM에.
5. 감소 된 혈 청 매체 1 ml 튜브에 볼륨을 키울.
6. 바이러스/미디어의 1 ml (4 µ g / µ L의 재고)에서 Polybrene의 추가 2 µ L. Pipetting으로 잘 혼합 하 고 셀에 혼합물의 1 mL를 추가 합니다. 24 헤에 대 한 바이러스 세포를 품 어
7. 바이러스 미디어를 제거 하 고 정상적인 DMEM 미디어 10% 보충 바꿉니다 FBS. 37 ° C, 5% CO ₂에서 셀 유지.
8. 셀의 성장 모니터링 하 고 변경 문화 미디어 매 2 일. 에 합류, 10 cm 직경 조직 문화 접시로 6-잘 접시 확장.
9. 일단 셀 충분히 확장 되었으며, 384-잘 분석 결과 접시는 YFP 식 수준 확인 하기에 DMEM 미디어의 50 µ L에 잘 당 씨 1.5 x 10 ⁴ 셀 현미경 검사 법에 의해 단백질을 태그. 신호 대 잡음 비율 표시는 YFP 태그 단백질 셀 식 ≥ 3, 해당 셀 라인 셀 재고 준비.

3. 시간 프로테아좀 억제제의 단백질 집계에 종속 효과

참고: 자동된 현미경을 사용 하 여 이미지 수집을 수행 (자료 참조).

1. 특 면 100 %DMSO (ALLN, 2 mM)에 녹아 있는 384-잘 플랫 바닥 접시에 DMSO 또는 프로테아좀 억제제의 0.25 µ L.
2. DMEM의 50 µ L에 잘 당 수동으로 씨 1.5 x 10 ⁴ 셀 미디어 같은에 시험 접시. 프로테아좀 억제제 (ALLN) 최종 농도 10 µ M 이어야 합니다.
3. 37 ° C, 5% CO ₂ 현미경 시스템 환경 제어 장치를 설정합니다. 실험적인 체제의 화면 그림 3에 표시 됩니다.
4. 운영 소프트웨어를 사용 하 여 다음 설정을 가진 넓은 필드 형광 모드로 현미경: 시간 캡처 간격 목표, 비 confocal 모드, 4 필드/글쎄, LWD 20. 각 실행의 끝에, 캡처된 이미지는 서버에 자동으로 업로드 한다.

4. 시간 경과 영상 살아있는 세포에 YFP 식에 대 한 및 이미지 분석 (단일 채널)

참고: 다음 단계에서는 응용 프로그램 (예를 들어, 콜럼버스) 소프트웨어의 설명.

기본 개체 (cytosol 및 집계) 세그먼트

1. 선택 적절 한 알고리즘입니다. 필요한 경우 조정 배경 임계값 및 대비 매개 변수 ( 그림 4).
2. 계산 셀을 사용 하 여 ' 셀을 찾을 ' 0.1 YFP 강도 채널에 대 한 개별 임계값. 집계를 사용 하 여 결정 한 ' 장소를 찾을 ' 상대 YFP 자리 강도 알고리즘 > 0.2와 1.0의 분할 계수.

5. 복용량 응답의 효과 프로테아좀 억제제 단백질 집계에 살아있는 세포의 핵 (2 채널)에 대 한 스테인드

참고: 자동된 현미경을 사용 하 여 이미지 수집을 수행. 최적의 곡선 적합 되도록 예상된 IC ₅₀ 값에 따라 프로테아좀 억제제 (ALLN, Epoxomicin, 및 MG132)의 농도 범위 결정.

384 잘 저장 폴 리 프로필 렌에 화합물의

1. 준비 직렬 희석 1:3 희석 시리즈 표준 접시. 복합 희석 혼합 확인 잘 되도록 화합물 농도 정확.
2. 빈 플랫-하단 검은 384-잘 시험 접시에 프로테아좀 억제제의 0.25 µ L 분배. 384-모 세관 머리 볼륨을 전송할 수를 갖춘 액체 처리기 사용.
50에 잘 당 10 ⁴ 셀 x
3. 씨 1.5 µ L DMEM 미디어의 분석 결과 접시에. 분석 결과 접시 24 h. 위해 37 ° C, 5% CO ₂를 품 어
4. 솔루션 (10 mg/mL의 재고에 Hoechst 33342) 얼룩과 DMEM 미디어 (37 ° C에서 미리 예 열)의 10 µ L을 추가 하 고 10 분에 대 한 실 온에서 품 어
5. 발사는 마이크로운영 소프트웨어 대처. 실험 설정의 화면 캡처는 그림 6에 표시 됩니다. 선택은 " 구성 " 탭 하 고 객관적이 고 정확한 판형 X 20을 선택 합니다. 확인 " 칼라 " 다른 접시 종류와 적절 한 초점을 수 있도록 하는 목적에 올바른 값으로 설정 됩니다.
6. 선택은 " 현미경 " 탭 정의 노출 YFP로 1 (488 레이저) 및 노출 2 Hoechst (405 레이저). 모두 노출에 필터를 활성화 하 고 카메라 1 카메라 2 노출 2 노출 1을 할당 합니다. 노출 1 ~ 800 ms 노출 시간 설정 노출 2 ~ 40 ms.
7. 선택 노출 1입니다. 0 µ m. 선택 초점 높이 설정 " 초점 ". 일단 초점, 노출 카메라 1. 최적화 노출 평면을 클릭 초점 높이 조정 " 높이 걸릴 ". 노출 시간을 변경 하 고 ~ 3, 000의 최대 픽셀 강도 게 전원 레이저. 노출 매개 변수를 저장 합니다. 반복 노출 2.
8. 선택 " 실험 정의 " 탭 만들기 레이아웃 및 sublayout. 드래그 앤 드롭 관련 레이아웃, 노출, 참조 이미지, skewcrop 파일 및 sublayout. 실험 저장.
9. 선택 " 자동 실험 " 탭 및 이미지. 각 실행의 끝에, 캡처된 이미지는 서버에 자동으로 업로드 한다.

6. 두 이미지의 분석 이미지

1. 세그먼트는 기본 개체 (핵, cytosol, 및 집계) 소프트웨어 알고리즘을 선택 합니다 ( 그림 7).
2. 세그먼트 개체의 검사에 의해 정확 하 게 핵을 세그먼트 방법을 선택 합니다. Hoechst 스테인드 개체 1 채널에서 (Ch1) 셀의 수를 결정 하기 위해 사용 됩니다. 돌연변이 체 SOD1-채널 2 (Ch2) A4V의 양을 결정 하는 데 사용 됩니다에서 YFP 얼룩.
3. 계산 셀을 사용 하는 ' 핵을 찾을 ' 알고리즘 Hoechst 얼룩 영역으로 > 20 µ m ², 7.0, 0.40, 그리고 대조의 개별 임계값의 분할 계수와 > 0.10.
4. 데이터 테이블을 만들고 사용 하 여 화합물의 각각에 대 한 EC ₅₀를 결정는 ' 비 선형 회귀 ' 방정식 그래프 소프트웨어에서.

결과

Lentivirus를 사용 하 여 생성 안정적인 셀 라인: SOD1 단백질 집계 모니터링에 대 한 전반적인 전략은 그림 1에 나와 있습니다. 첫 번째 단계에서 셀 라인 (1 단계)에 SOD1 안정적인 유전자 배달에 대 한 식 lentiviral 벡터를 생성 했습니다. 인코딩 SOD1 WT YFP 태그 및 SOD1 A4V 두 lentiviral 벡터 (SOD1WT-YFP 및 SOD1A4V-YFP, 각각) 포장 및 봉투 플라스 미드 (그림 2A)을 준비 했다. Lentiviral 변환 (단계 2) 셀에 선 테스트 (HEK 293, U2OS, 및 SH-SY5Y) 남아 있었다 (그림 2B), 건강, 보였다 높은 식 수준 및 장기 YFP 라벨 SOD1 형태에 관계 없이. 흥미롭게도, WT도 ...

토론

안정적인 세포를 생성 하기 위한 두 가지 주요 방법 있다. 처음 몇 주를 소요 하며 게놈 통합된 플라스 미드 DNA 벡터의 과도 transfection 및 저항 선택. 두 번째는 제한 노력으로 여러 셀 라인에서이 프로토콜을 대상 단백질의 효과적인 표현 의무가 만들기 lentivirus, 사용 시간의 문제를 걸립니다. 여행-CMV 벡터¹⁹ 지속적인된 벡터 보존된 변환 효율과 안정적인 transgene 식 사용 했다. 놀랍게도, 생성 된 3 셀 라인 과도 식에 따라 실험 프로토콜 달리, SOD1 돌연변이의 아무 표시 집계 설명 이전¹¹보였다. 그것은 시간의 상대적으로 짧은 기간에 높은 단백질 식 생산으로 일시적인 식 단백질 집계를 선호입니다. 일시적인 transfection 시 단백질의 대부분을 저하, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 저하 집계 하기 쉬운 단백질을 완벽 하 게 활용 되는 포화 지점에 도달 합니다. 그러나, 우리는 안정적인 라인 더 단백질...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ALLN (C20H37N3O4)	Millipore	208719
MG132 (C26H41N3O5)	Sigma-Aldrich	C2211
에폭소마이신(C 28H50N4O7)	Sigma-Aldrich	E3652
Hoechst 33342	Invitrogen	H-3570
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Opera EvoShell 소프트웨어	Perkin Elmer	Ver 1.8.1
Operetta	Perkin Elmer	OPRT1288
Harmony 이미징 소프트웨어	Perkin Elmer	Ver 3.0.0
Columbus 이미지 분석 소프트웨어	Perkin Elmer	Ver 2.3.2
CyBi Hummingwell 액체 처리	CyBio AG	OL 3387 3 0110