에스 케리 치아 (Escherichia )로부터의 비 변성 조건 하에서 코돈 최적화 된 인간 시스 - 프레 닐 전이 효소의 과발현 및 정제를위한 간단한 프로토콜 콜라이 (coli )는 효소 활성 분석과 함께 기술된다. 이 프로토콜은 기계적 연구에 적합한 양 및 품질의 다른 시스 플 닐 트랜스퍼 라제 단백질의 생산을 위해 일반화 될 수 있습니다.
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방법 논문
인간의 과발현과 정제 시스 - 프레 닐 트랜스퍼 라제 대장균
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Prenyltransferases (PT)는 다중 응축 반응을 통한 isopentenyl diphosphate (IPP) 를 사용하여 알릴이 인산의 사슬 연신을 촉매하는 효소 군입니다. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase)는 ispenetenyl diphosphate (IPP)와의 다중 축합을 통한 farnesyl diphosphate (FPP, allylic diphosphate)의 사슬 연신을 촉매하는 진핵 장쇄 cis -PT (축합 반응으로부터 cis 이중 결합을 형성 함)이다. DHDDS는 효소의 비 보존 적 돌연변이 (K42E)가 망막염 색소 침착 으로 이어 지므로 궁극적으로 실명으로 이끄는 생물 의학적으로 중요합니다. 따라서, 본 프로토콜은 역학적 연구에 적합한 대량의 정제 된 DHDDS를 얻기 위해 개발되었다. 여기에서, 단백질 융합, 최적화 된 배양 조건 및 코돈 최적화의 사용은 기능적으로 활성 인 DHDDS의 과발현 및 정제를 허용하기 위해 사용되었다. cis -PT의 상 동성은이 프로토콜이 천연 고무 합성에 관여하는 것과 같은 다른 진핵 cis- PT에도 적용될 수 있음을 시사한다.
서론
Prenyltransferases 다중 축합 반응 1을 통해 아이소 펜 테닐 다이 포스페이트 (IPP)를 사용하여 알릴 포스페이트, 2 쇄 신장을 촉매하는 효소 군이다. E 형 효소 트랜스 이중 결합의 형성을 촉진하는 반면 3 Z 형 효소, 축합 반응, 시스 이중 결합의 형성을 촉매. -Prenyltransferases 시스 (시스 -PT, Z 형 효소) 고전 단 체인 (C 15), 중쇄 (C 50-55)에 자신의 제품의 사슬 길이에 따라 분류되며, 장쇄 (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase)는 이소 펜 테닐 디 포스페이트 (IPP) 1을 이용한 다중 응축을 통해 farnesyl diphosphate (FPP, allylic diphosphate)의 사슬 신장을 촉매하는 진핵 장쇄 cis<....
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프로토콜
1 . E. coli 에서의 과발현을위한 cis -PT의 클로닝
- 109aa thioredoxin (TRX) 단백질 17 과 융합 된 단백질 서열의 클로닝 및 고수준 발현을 위해 설계된 pET-32b 발현 벡터 및 대장균 코돈 최적화 된 전장 cis -PT 18 코딩 서열을 수득한다.
- TEV 프로테아제 짧은가요 성 링커 하였다 (담배 식각 바이러스 단백질 분해 효소) 절단 부위 ( "/"는 절단 점을 나타내는 ENLYFQ / G) 9 갖도록주의 시스의 상류 (SGSGSG을 절단 부위의 접근성을 향상시키기) -PT 서열 ( 도 1A ). 또한, 복제에 적합한 5 '및 3'제한 사이트를 추가하십시오.
- 표준 ligation 기술을 사용하여 합성 DNA 구조를 pET-32b 벡터에 클로닝하십시오 10 .
2. 지나치게 높은E. coli....
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결과
여기에 사용 된 구조 및 정제 과정에 대한 일반적인 개요가 그림 1에 나와 있습니다. 각 정제 단계에서 얻은 샘플을 그림 2 에 나타냈다 . 이 SDS-PAGE 분석은 DHDDS의 단계적 정제를 보여줌으로써 매우 정제 된 제품을 생성합니다. 도 3 은 정제 된 효소의 SEC 분석 결과로서, 단백질이 동종이 량체로만 관찰된다는 것을 나타낸다. 그림 4 는 대표적인 시간 의존 활성 분석을 보여줍니다. 14 C-IPP 혼입은 6 시간 이상 명확하게 상승하여 정제 된 효소가 기능적임을 입증한다.
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토론
E. coli 세포에서 기능성 인간 DHDDS를 정제하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 간단하고 효율적이어서 적절한 구조가 사용 가능 해지면 3-4 일 내에 단백질을 과발현하고 정제 할 수 있습니다. 단백질 정제를위한 그러한 프로토콜은 많은 질병 18 의 유전학에 관한 정보의 과다한 정보를 제공하는 게놈 시퀀싱의 돌파구를 고려할 때 특별한 의미가 있습니다. 따라서 단백질 수준 19 에서 병원성 메커니즘을 특성화하기위한 높은 처리량 방법의 개발이 필요합니다.
이종 단백질의 과발현과 정제에서 흔히 나타나는 함정을 극복하기 위해 여기에 몇 가지 조치가 취해졌으며, 이는 수용성 단백질과 기능성 단백질을 성공적으로 얻는 데 중요합니다. 첫째, DHDDS는 TRX 융합체로서 과발현되었다. TRX는 융합 단백질 폴딩을 촉진하고 융합 단백질 용해도를 증가 시켜서 포유 동물 b조형물
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 이스라엘 과학 재단 재단 연구 센터 (I-CORE)의 구조 세포 생물학 (1775/12)과 이스라엘 과학 재단 보조금 (1721/16과 2338/16) (YH)과 825/14 (DK ). DK에 대한 Fields Estate Foundation의 지원은 높이 평가됩니다. 이 연구는 Ilan Edri와 Michal Goldenberg가 Tel Aviv University의 Sackler 의학부의 MD 논문 요구 사항을 부분적으로 이행함으로써 수행되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pET-32b | 노바젠 | 69016-3 | |
| T7 익스프레스 리스Y 유능한 E. 대장균 (고효율) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow 수지 | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 탈염 컬럼 | GE 헬스케어 | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE 헬스케어 | 28989335 | |
| superdex-200 증가 5/150 GL | GE 헬스케어 | 28990945 | |
| 14C-이소펜테닐 피로인산 | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| 트랜스, 트랜스 파르네실 피로 인산 | 시그마 | 44270-10MG |
참고문헌
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., K....
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재인쇄 및 허가
