최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

Summary

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

Abstract

Zebrafish 대규모 유전과 화학 스크린을 통해 기본적인 발달 생물학에 걸친 다양 한 인간 질병 및 실험 연구의 증가 범위에 대 한 유용한 도구 강력한 모델로 떠오르고 있다. 그러나, 많은 실험, 특히 감염 및이 종이 식 모델에 관련 된 microinjection와 배아와 힘 드는 기법 기술 및 전문 지식이 필요로 하는 애벌레의 이미지에 의존 합니다. 정밀도 현재 microinjection 기법의 처리량을 개선 하기 위해, 우리는 이전에 복 부, 등, 또는 측면 방향 동양 zebrafish 태아 2 일 게시물 수정 (dpf)에 안정화를 microstructured 장치의 시리즈를 개발 합니다 절차입니다. 배아의 이미징에 도움, 우리는 또한 채널 4 zebrafish 유리 커버 슬립에 대 한 동시에 옆 방향으로 간단한 장치 설계. 함께, 우리가 여기 제시 도구 zebrafish 기술의 최적화를 위한 유용한 장치를 생성 하기 위해 photolithographic 접근의 효과 보여 줍니다.

Introduction

Zebrafish의 기본적인 발달 생물학 대규모 유전 연구에서 다양 한 분야에 대 한 강력한 모델로 등장 하 고 화학 스크린^1,2. 일상적인 유전자 조작, 유전자 overexpression, 최저, CRISPR/Cas9 mutagenesis, transgenesis 등 상업적으로 간단한, 쉬운--사용의 개발을 주도하 고 있다 단일 셀 zygote에 유전 물질의 microinjection에 의존 방향을 사출³계란 안정화를 사용할 수 있는 도구. 감염, 이식 등 다른 접근으로 나중 단계 태아 그리고 애벌레 더 큰 게이지 모 세관 바늘⁴를 사용 하 여 microinjection을 해야 하는 경우가 많습니다. 그러나, 더 큰 계기 바늘의 사용으로 밀거나 태아 롤링 없이 표적 조직에 침투 하기 어려운 중요 한 기술적 과제, 선물. 이러한 조건에서 절차 동안 건조를 방지 하는 것은 어렵다, 하는 동안 태아를 안정화 하는 데 필요한 적절 한 물 긴장 및 배아 수 있습니다 이상적으로 표적 조직에 주입에 대 한 지향.

Microinjection, 다음 그것이 주입된 태아....

Protocol

애벌레의 microinjection 프로토콜 2011N000127에서 매사 추세 츠 종합 병원 분과 연구 동물 관리에 의해 승인 되었다.

1. 장치 제조

참고: 모든 컴퓨터 보조 그리기 (CAD) 파일 여기에서 설명 하는 사진 평판 마스크를 디자인 하는 데 사용 (그림 1) 다운로드를 위해 사용할 수 있습니다. 링크 테이블의 자료를 참조 하십시오.

1. 표준 photolithographic 기법⁷를 사용 하 여 클래스 1000 클린 룸에 마스터 형 웨이퍼를 조작. 미세 배열 및 채널에 대 한 제조업체의 지침에 따라 순차적으로 3 별도 마스크를 사용 하 여 3 계층에 에폭시 기반 부정적인 감광 제 패턴: 얕은 기능에 대 한 100 µ m, 중간 기능에 대 한 200 µ m 및 400 µ m에 대 한 깊은 기능. 이미징 장치에 대 한 두 가지 패턴 레이어 얕은 기능과 깊은 기능에 대 한 600 µ m에 대 한 400 µ m를 사용 하 여 경우
2. 15 cm (그림 2)을 주조에 대 한 페 트리 접시의 기초를 완성 된 웨이퍼....

Results

여기서 설명 하는 접근은 (그림 1)의 설계 및 제조 2 dpf zebrafish, photolithographic (그림 2)와 소프트 리소 그래피 (그림 3) 기법을 사용 하 여 함께 사용 하기 위해 장치를 보여 줍니다. 이 방법을 사용 하면 많은 설계 반복 및 수정, 빠른 테스트 하 고 변경 및 개발의 다른 단계에서 제 브라와 함께 사용 하기 위해 미세 크기의 최적화 응용 프로그램을 확장할 수 있습니다.

우리 도전 microinjection 기술과 편리한 이미징이이 소자의 사용을 보여 줍니다. Otic 소포 (그림 4D, 흰색 파선된 윤곽선) ze.......

Discussion

여기, 우리는 사용 설명 장치 우리는 최근 2 dpf zebrafish microinjection의⁵, 촉진 하기 위하여 소개 하는 배아의 편리한 이미징에 대 한 간단한 agarose 무료 장착 장치 개발. 이러한 도구는 zebrafish 기법에 대 한 유용한 장치 제조를 위한 photolithographic 기술의 유틸리티를 강조 표시합니다.

우리는 발견 MSA 장치 특히 유용 세포 또는 입자의 주입을 위해 microinjection 바늘 같은 곰 팡이 conidia 또는 배달에 대 한 더 큰 구멍 바늘의 사용을 요구 하는 인간의 암 세포 내에서 집계 하는 경향이 있다. Otic 소포 (그림 4)에 주입 배아 자주 바늘과 접촉 시 롤로 특정 도전을 선물 한다. 우리 동양 하는 측면에서 zebrafish 안정화 microstructured 채널의 사용 하 여 찾을 방향 처리량 및 우리.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
다우 코닝 실가드 184 폴리디메틸실록산(PDMS)	엘스워스 애드시브	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	장치 주조용. 키트에는 PDMS 단량체 및 개시제가 포함되어 있습니다
저겔화 온도, 아가로스	Sigma, Aldrich	A9414-10G	아가로스 장치 주조용
PFDTS 실란	, Sigma Aldrich	448931-10G	, 네거티브 PDMS 주형용
트리카인(MS-222)	시그마 Aldrich	E10521-10G	제브라피시 마취용
, Rhodamine Dextran, 70,000 Da	ThermoFisher	D1818	미세 주입을 추적하려면
Leukotriene B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	호중구 화학 유인제
N- 포르 밀 메티오닌 - 류실 - 페닐알라닌 (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	호중구 화학 유인 물질
15cm 페트리 접시	Fisher scientific	08-757-148	마스터 웨이퍼에서 주조
유리 바닥 6 웰 플레이트	MatTek	P06G-0-20-F	이미징 장치
용 붕규산 유리 미세 모세관	World Scientific Instruments	TW-100-4	미세 주입 바늘
이송 피펫	Sigma Aldrich	Z350796	제브라 피쉬 배아 이송 용
마이크로 로더 팁	Fisher Scientific	E5242956003	미세 주입 바늘 로딩 용
Harris Uni-Core 1.5mm 펀치	테드 펠라 Inc.	15111-15	PDMS 이미징 장치
No. 11 메스	Fine Science Tools	10011-00	PDMS 절단용
Dumont No. 5 집게	Fine Science Tools	11252-10	배아 제거 및 미세 주입 바늘 팁 절단용
Marzhauser Micromanipulator	ASI	MM33-R	미세 주입 바늘 조작용
마그네틱 스탠드	MSC	SPI - 87242624	micromanipulator
MPPI-3 Picopump controller	ASI	MPPI-3	microinjection volume and timing 제어용
EVOS 도립 형광 현미경	ThermoFisher	EVOS FL	주입된 배아를 이미지화하기 위해
해부 현미경	Nikon	SMZ745	microinjecion
AutoCAD 소프트웨어	Autodesk 시각화		AutoCAD 파일 다운로드: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 및 ZFIN 커뮤니티 프로토콜 위키 페이지: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki