방법 논문

면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

DOI:

10.3791/56606

⸱

2018년 2월 8일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산+ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.

초록

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면역 세포 종양 microenvironment의 중요 한 구성 요소 이며 발암의 모든 단계에서 종양 성장과 진화에 영향. 특히, 그것 지금 잘 설립 인간의 종양에 면역 침투 예 후와 치료에 응답을 상호 연결할 수 있습니다. 종양 microenvironment에 면역 침투의 분석은 환자와 치료에 대 한 응답의 분류에 대 한 주요 도전 되고있다.

억제 수용 체 프로그램 세포 죽음 단백질 1 (PD1; 일컬어 CD279), 세포 독성 T 림프 구 관련 4 (CTLA-4) 단백질, T 세포 면역 글로불린 및 Mucin 포함 단백질-3 (팀 3, 일컬어 CD366), 림프 구 등의 공동 식 활성화 유전자 3 (지연-3, 일컬어 CD223), T 세포 소모의 특징 이다. 우리는 multiparametric 제자리에 면역 형광 식별 하 고 이러한 억제 수용 체의 공동 식 세포 수준에서 계량 얼룩을 개발 했다. 신장 세포 carcinomas (RCC)의 냉동된 조직의 회고전 시리즈, 이미지 분석 소프트웨어와 결합 된 형광 multispectral 이미징 기술을 사용 하 여, 종양 CD8 침투에 PD 1 팀 3의 공동 식 찾아냈다+ T 세포 RCC에서 가난한 예 후와 상관 된다. 하 우리의 지식,이 대표가 자동 멀티플렉스 현장 기술 시연 첫 번째 연구는 몇 가지 임상 관련성 있을 수 있습니다.

서론

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지난 몇 년 동안, immunotherapy RCC를 포함 하 여 암의 많은 종류에 대 한 매우 유망 치료로 등장 했습니다. 특히, immunotherapy 금지 검사점의 억제에 따라 PD 1 좋아하고 CTLA-4은 임상적으로 효과적인1,2,3,,45, 것으로 보고 되었습니다. 6. 단일 클론 항 체 CTLA-4에 대 한 PD-1, 또는 프로그램 죽음 Ligand 1 (PD-L1) 이미 여러 암에 승인 되 고 오래 견 딘 임상 응답 환자7의 20% 이상으로 이어질. 그럼에도 불구 하 고, 모든 환자는 초 동 조치, 치료의 비용은 높다, 되며 이러한 치료 독성, 잠재적인 심각한 면역 같은 부작용을 선도. 따라서, 현재 도전 예측 마커 그 새로운 immunotherapies 식별 것입니다. 종양, PD-L1, 표현 또는+ T 세포 침투 intratumoral CD8의 수준에서 돌연변이의 속도와 임상 응답 상관 관계를 보고 되었습니다. 그러나,이 협회는 아직도 너무 약 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 환자8 에서에서 Pembrolizumab의 관리 전에 PD L1 동반자 테스트 제외 임상 연습에서 이러한 임상 생체의 사용을 권장 해 ,91011,12. 그것은 많은 금지 수용 체의 공동 식 같은 PD-1, 팀 3, 지연-3, 고 CTLA-4 유도 세포 소모 형 그리고 치료13,,1415저항 증명 되었습니다. 말 초 혈액 종양 microenvironment의 대표 이므로, 셀 제자리의 phenotypic 특징을 분석 하 고 관심입니다. PD-1 팀-3 공동 표현 T 세포 기능 장애가 여러 컨텍스트13,,1617셀 수 알려져 있습니다. 이 연구에서 두 금지 수용 체 PD 1의 공동 식과 CD8-3 팀의 전조 영향+ T 세포를 평가 했다.

종양 침투 림프 톨 (TILs)에 여러 마커의 공동 식 공부는 지금까지 최대 주로 신선한 종양 및 따라서 제외 회고전 분석에 작동 하는 데 필요한 만드는 흐름 cytometry 분석에 의해 수행 되었습니다. 기존의 현장에 얼룩, 한 번에 하나의 얼룩 수행할 수 있습니다와 공동 마커를 표현 하는 셀 형식의 특성은 불가능 하다. 예를 들어 PD L1 기존의 immunohistochemistry 분석 표현 PD L1 셀은 더 많은 상호 연구 관련 하 여 정의 하 고 어려운 종양 microenvironment의 많은 세포 유형으로 표현 됩니다. 이 작품에서는, 우리는 혁신적인 위치에 multiparametric 면역 형광 검사 방법을 개발 CD8 침투 종양에 의해 PD-1 팀-3의 공동 식 연결할 컴퓨터 계산+ T-세포 RCC에서 임상 결과. 이 기술은 여러 이점이 있다, 단일 셀 수준 및 여러 표식에 제한 된 간격을 캡처할 수 있는 multispectral 카메라를 사용 하 여 동시에 분석 하는 가능성을 포함 하 여 > 10 nm 액정을 통해 필터18. 또한, 절차는 자동 간 연산자 재현성 및 수동 기법19에 비해 단축된 분석 수 있습니다. 암 분야에서 여러 연구 보고에 메르켈 세포 암, 폐 암, 머리와 목 암20,,2122, 같은 PD-1, PD-L1, 및 CD8 면역 분자의 여러 stainings를 설득 23. 자동된 세포 수는 사용자 (형질 단계) 교육 가능 하다. 형광은 다른 세포 격실 (핵, 세포질, 막)에서 측정 됩니다.

여기, CD8 종양 침투의 다른 하위 집합+ T 세포 표현 PD-1 및 RCC의 대형 코 호트에서 팀-3 계산 했다 고 결과 임상 중력 점수 및 생존 매개 변수 연관 되었다. 그것은 또한 cytometry에 같은 의미 형광 강도 (MFI) 데이터는 셀룰러 해상도에서 막 형광 강도 분석 가능. 우리가 아는 첫 번째 연구 보고 전조 결과를이 multispectral 영상 기반된 수 기술을 사용 하 여 나타냅니다.

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프로토콜

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이 연구는 헬싱키의 선언에 따라 실시 되었다과 지역 윤리 위원회 (CPP Ile 드 프랑스 nr. 2012-05-04)에 의해 승인 되었다. 동의 동료에 포함 된 참가자 로부터 얻은 것입니다.

1. 조직 자료

  1. 수술 당일에 RCC 조직 샘플을 수집 합니다. 실 온 (병 리과)에서 외과 견본을 처리 합니다.
  2. 약 0.5 c m x 0.5 cm x 건조 관에 0.5 cm 크기의 종양 샘플을 수집 합니다. 스냅 액체 질소에서 냉동 고-80 ° c.에 저장
  3. 최적의 절삭 온도 화합물 샘플 코트. 4-6 µ m 두께 섹션으로-20 ° C에서 cryostat와 샘플 섹션. 12 h에 대 한 슬라이드에 건조 한 공기를 직접 건조를 피하기 위해-80 ° C에서 그들을 저장 하는 예제를 보자.
  4. 보고는 되며 샘플의 품질을 확인 하 고 오신 스테인드 섹션.

2. 제자리에서 TILs의 면역 형광 염색

  1. 절차 지침
    1. 실 온에서 모든 실험 단계를 수행 합니다.
    2. 모든 단계에 대 한 희석 Tris 버퍼 염 분 (TBS, 참조 테이블의 재료)를 수행 합니다.
    3. 1 차적인 항 체 외피 후 제외 하 고 모든 단계에 대 한 큰 술에 씻어를 수행 합니다. 후자에 대 한 사용 Tris 버퍼 염 Tween20 (TBST, 재료의 표참조). 버퍼 구성 및 재구성에 대 한 보충 표 1을 참조 하십시오.
    4. 습도 챔버를 사용 하 여 항 체 외피와 세척을 위한 착 색 병에 대 한.
    5. 섹션을 절차 동안 건조 하지 마십시오.
  2. 전처리
    1. 조직 샘플을 포함 하는 슬라이드를 해 동 하 고 신중 하 게 건조 종이 타월 견본 주위 슬라이드. 소수 성 장벽 펜 조직을 포함 하는 반응 지역 delimitate ( 재료의 표참조). 2 분 동안 건조입니다.
    2. 5 분, 2 분, 건조에 대 한 100% 아세톤에 샘플을 수정 하 고 10 분 TBS로 세척.
  3. 채도 봉쇄
    1. Avidin 0.1%의 3 방울과 10 분에 대 한 슬라이드를 pretreat, 탭 및/또는 영화는 avidin 배포 공기 방울을 제거 하 고 다음 biotin 0.01%의 3 방울과 10 분 동안 치료를 슬라이드 (참조 테이블의 자료), 탭, 및/또는 영화. 워시와 함께 tbs.
    2. Fc 수용 체 봉쇄를 수행 합니다. 100 µ L의 정상적인 혈 청에 tbs. 사용 레이블된 2 차 또는 3 차 항 체로 동일한 호스트 종에서 혈 청 희석의 5% 볼륨/볼륨 적용 ( 재료의 표참조). 여기, 당나귀 혈 청 사용 되었다. 30 분 동안 품 어.
    3. 부 화, 동안 안티 CD8, PD-1, 그리고 팀-3 항 체 (자료 테이블)을 스핀 짧게. 추가 표 2에 설명 된 대로 TBS에서 기본 항 체의 믹스를 준비 합니다.
  4. 면역 염색 법으로 CD8, PD-1, 그리고 팀-3
    1. 1 차적인 항 체 혼합물을 준비 합니다. 사용 하는 항 체에 대 한 테이블의 자료 와 보충 표 2 를 참조 하십시오 (안티 CD8, PD-1 팀-3, 그리고 그들의 해당 보조 항 체) 및 그들의 농도.
    2. 탭 및 나머지 당나귀 혈 청 (단계 2.3.2에서에서 추가) 영화. 100 µ L 1 h 습도 챔버에 대 한 1 차 항 체 라는 비 혼합의와 슬라이드를 품 어.
    3. 부 화, 동안 짧게 Cyanine 5 반대로 토끼, AF488-안티-염소, 그리고 biotinylated 반대로 마우스 항 체, 회전 하 고 보충 표 2에 설명 된 대로 2 차 항 체의 믹스를 준비.
    4. 워시 5 분 건조에 대 한 TBST에 슬라이드 슬라이드.
    5. 습도 상공에서 30 분 2 차 항 체의 100 µ L로 슬라이드를 품 어.
    6. 보충 표 2에 설명 된 대로 Cy3 streptavidin를 포함 하는 제 3 항 체의 혼합물을 준비 합니다.
    7. 씻고 10 분 건조에 대 한 TBS에 슬라이드 슬라이드.
    8. 30 분 동안 3 차 항 체 혼합물의 100 µ L로 슬라이드를 품 어.
    9. 씻고 10 분 건조에 대 한 TBS에 슬라이드 슬라이드.
  5. 셀 마운트
    1. 슬라이드 4'를 탑재, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride DAPI-포함 된 매체 (1.5 µ g/mL DAPI) 형광 현미경 검사 법에 대 한 호환 coverslip로 장착 (참조 테이블의 자료).
      참고: 각 실험에 대해 부정적인 컨트롤, 항 체 isotype 일치 한 슬라이드가 해당 항 체로 같은 농도에서 사용 되었다. 이 착 색 사용 마우스 IgG1, 토끼 IgG, 및 염소 IgG 부정적인 제어 항 체 ( 재료의 표참조). 긍정적인 통제로 우리는 각 실험에 대 한 테스트 표식에 대 한 긍정적인 것으로 알려져 인간 hyperplasic 편도 선 사용. 전형적인 얼룩 결과 (그림 1)에 설명 되어 있습니다. 모노-CD8의 얼룩, PD-1, 그리고 팀-3 수행 해야 개별적으로 (슬라이드 당 한 얼룩) 같은 전처리와 DAPI 없이. 어떤 항 체만 DAPI 장착 매체 없이 동일한 실험 조건에서 슬라이드도 수행 되어야 합니다. 슬라이드는 어떤 항 체와 DAPI 없이 동일한 실험 조건을 사용 하 여 몇 군데 한다.

3. 형광 분석 및 자동화 된 셀 수

  1. 자동 현미경 이미지 수집
    1. 프로토콜을 만듭니다.
      1. 자동된 현미경 소프트웨어 및 형광 조명 기를 켭니다.
      2. 메뉴 모음에서 "파일", "프로토콜을 만들기"를 클릭 선택 "DAPI," "FITC," 및 "TRITC"
      3. "다음," "조직 섹션," 클릭 하 고 클릭 합니다 "," "프로토콜 이름입니다." 선택한 이름, 예를 들어 "CD8-PD-1-팀-3," 클릭 "다음" "저장."
      4. 직접 무대에 슬라이드를 놓습니다.
      5. 메뉴 모음에서 "설정", "설정" 클릭 새 창에서 "홈 Z 설정"을 클릭 합니다.
      6. 노출 시간 조정 긍정적인 제어 즉 는 CD8 슬라이드, PD-1, 팀-3 트리플-스테인드 DAPI 샘플.
      7. 제어 막대에서 클릭 "설정 노출."
      8. 충분 하지만 포화 하지 신호를 얻을 때까지 각 필터에 대 한 노출 시간을 조정 합니다.
      9. 흑백 영상에 대 한 다음을 수행 합니다.
      10. 인수를 선택 하 고 '자동 초점'에서 DAPI 필터를 선택 합니다.
      11. "검색 지역 제한"에서 객관적인 상단 슬라이드의 상단 왼쪽된 모서리에 이동 합니다. "마크"를 클릭 합니다. 오른쪽 아래 모서리에 대 한 같은 마십시오.
        참고:이 단계 delimitates 저전력 (lp로 영상) 4 X; 이미징의 영역 시리즈의 모든 샘플을 서라운드로 잘 마크를 알고 있어야 합니다.
      12. 고 출력 (HP) 이미징에 대 한 다음을 수행 합니다.
      13. '자동 초점'에서 "DAPI"을 선택 합니다.
      14. '수집' 밴드에서 "DAPI", "FITC", "Cy3", 및 "Cy5"를 선택 합니다. "확인"을 클릭 합니다. 메뉴 모음에서 "프로토콜" 저장 "파일"을 클릭 합니다.
    2. 슬라이드를 검사 합니다.
      1. "파일" 메뉴 막대에서 "프로토콜 로드"를 클릭 하 여 프로토콜을 로드 합니다. "시작"을 클릭 합니다.
      2. ' 실험실 ID' (이미지 저장을 위한 폴더 위치)를 입력 합니다. 슬라이드 슬라이드를 식별 하기 위해 ID를 입력 합니다. "다음"을 클릭 합니다.
      3. "흑백 영상" (필드 밝은 빛 아래에서 전체 슬라이드를 스캔 4 x 목표를 사용 하 여 순차 이미지)를 클릭 합니다.
        참고:이 슬라이드의 회색조 개요를 생성합니다.
      4. "표본 찾기"를 클릭 합니다. 낮은 해상도 (4 배)에서 스캔을 조직 영역 선택: 'Ctrl' 키를 누른 클릭 필드는 커서를 사용 하 여 선택 하거나 선택 취소 필드 (그림 2A).
      5. 각 필드의 형광 레드 블루 그린 이미지 수집을 위한 "LP 이미징" (영상 x 4)을 클릭 합니다.
      6. HP 필드 선택 'Ctrl' 키 고 선택 하거나 선택 취소 (20 배)의 높은 해상도에서 스캔 될 조직의 영역에 해당 하는 필드는 커서를 사용 하 여 필드에 클릭 하십시오. 5 분야 (그림 2B)를 선택 합니다.
      7. 각 필드 (그림 2C)의 multispectral 이미지 수집을 위한 "HP 이미징" (영상 x 20)을 클릭 합니다.
      8. LabID에서 처음에 선택 된 폴더에 이미지를 저장 하려면 "데이터 저장"을 클릭 합니다.
        참고: 프로세스 요약 이며 그림2. (조직 감지, 필드 선택) 각 단계에 대 한 알고리즘 증가 고 전체 자동 검색 프로세스에 대 한 사용자에 의해 훈련 될 수 있습니다.
  2. 형광 이미지 분석 및 자동화 된 셀 결합된 분석 소프트웨어와 계산
    1. 스펙트럼 라이브러리를 빌드하십시오.
      1. 이미지 분석 소프트웨어를 엽니다.
      2. 왼쪽된 패널에서 "라이브러리"를 구축 엽니다. '이미지 로드', 아래 "찾아보기"를 클릭 하 고 하나의 모노-스테인드 이미지 (예를 들어, CD8/Cyanine 5)를 선택 합니다.
      3. (예를 들어, Cyanine 5) fluorophore를 선택 합니다. "추출"을 클릭 합니다. 라이브러리에 저장할 수 "저장" 클릭 합니다. "저장"을 클릭 합니다.
      4. PD-1, 같은 과정을 반복 팀-3, 그리고 DAPI 모노 스테인드 슬라이드의 각 fluorophore의 스펙트럼을 통합 하기 위하여.
        참고: 각 fluorophore (여기, 신장), 특정 조직에 대 한 사용에 대 한 스펙트럼 통합 스펙트럼 라이브러리를 구축 하지만 이미 존재 하는 "합성" 라이브러리를 사용할 수 있습니다. Autofluorescence 스펙트럼은 조직 기준으로 엄격 하 게, 그것은 하나의 자동 형광 스펙트럼 라이브러리 프로젝트를 수행 하는 것이 중요.
    2. 새 프로젝트를 만듭니다.
      1. 메뉴 모음에서 "파일", "새로운 프로젝트"를 클릭 합니다. '찾기 기능' 탭에서 "셀 분할"을 선택 합니다. '형질' 탭에서 "형질"을 선택 합니다. "생성"을 클릭 합니다.
      2. 통합 프로젝트에서 대표 이미지.
        1. '파일' 탭에서 "이미지 열기"를 클릭 합니다. 전체 시리즈의 10 ~ 30 대표 이미지를 선택 합니다. Autofluorescence 제거 하 비-얼룩진 슬라이드를 추가 합니다. 오른쪽 패널에서: 선택 라이브러리 소스. Fluorophore를 선택 하 고 이전 빌드 스펙트럼 라이브러리에 해당 하는 그를 선택.
      3. 조직 autofluorescence를 제거 하려면 "AF 버튼"을 클릭 하 고 빈 슬라이드에 autofluorescence의 영역을 선택 합니다.
      4. 이미지 처리와 합성 이미지 생성
        1. "모든" 형광 라이브러리와 복합 이미지 (그림 3)를 생성 하는 autofluorescence 스펙트럼 통합 준비를 클릭 합니다. '눈' 아이콘 '보기 편집기' 패널을 열고 표시 하는 데이터 선택을 클릭: 선택 마커 CD8, PD-1, 팀-3, 및 DAPI. autofluorescence를 제거 합니다. 소프트웨어에 의해 제시 하는 단계를 따릅니다.
      5. 세그먼트 셀.
        1. '칸'에 셀 세그먼트 "핵"과 "막"을 선택 합니다. "핵" 탭에 DAPI 핵 counterstain로 설정 합니다.
        2. '최대 및 최소 크기 (픽셀)' 탭에서 입력 "40"와 "176" 최소 및 최대 크기로 각각. '최소' 신호에 대 한 "0.13"을 설정 합니다. "분할" 탭에서 "2.60"을 설정 합니다. "핵" 탭에서 "0.81"을 설정 합니다. "막 신호 사용 하 여 분할을 지원"을 선택 합니다.
        3. "세그먼트 셀" 화면의 하단 부분을 클릭 합니다. 핵의 세분화 및 세포의 막을 확인 하 고 셀의 DAPI과 막 형광 일치 하지 않는 경우 다른 매개 변수와 함께 다시 시도.
          참고: 소프트웨어 핵 DAPI 얼룩 및 셀 크기를 기준으로 셀을 인식 합니다. 프로젝트에 따라 셀 매개 변수 (크기, 분할, 픽셀)를 조정 합니다.
      6. 형 셀.
        1. '표현 형' 탭에서 "추가"를 클릭 합니다. 셀 형 카테고리 생성: CD8 (블루 도트) / CD8-PD-1 (빨간 점) / CD8-PD-1-팀-3 (녹색 점) / 기타 (검은 점) (그림 4).
        2. 각 카테고리의 셀의 5 개 이상의 예제를 선택 합니다. "분류자 기차"를 클릭 합니다.
          참고:이 소프트웨어는 통계 분류 알고리즘을 생성합니다.
        3. "모든" 각 세포의 표현 형을 얻기 위해 형을 클릭 합니다.
          참고: 소프트웨어는 정확도의 신뢰 구간 (CI)와 함께 한 셀의 표현 형을 제공합니다.
        4. 눈 및 자동된 수의 차이 조화 된 때까지 소프트웨어를 학습 하 여 알고리즘을 개선 (오류 < 5%). 선택은 관심의 셀에 대 한 CI.
          참고: 우리는 허용으로 55 %CI 기초 훈련을 만들 하기로 결정 했습니다.
      7. 알고리즘 및 프로젝트를 저장 합니다.
      8. '파일' 아래에서 "프로젝트"를 선택 합니다. 이름을 지정 하 고 "저장"을 클릭 합니다.
    3. 일괄 처리는 일련의 분석을 수행 합니다.
      1. "일괄 분석"을 선택 합니다. 프로젝트를 선택 합니다. 분석 이미지를 추가 합니다. 데이터 저장소의 폴더를 선택 합니다. "실행"을 클릭 합니다. 복합 이미지의 품질을 확인 합니다. 시리즈의 모든 이미지에 대 한 형질을 확인 합니다.
        참고: 결합 된 이미지 분석 소프트웨어는 모든 셀 구획 (막/세포질/핵) 신호를 통합합니다. 형질 단계 알고리즘의 훈련 수 시간이 걸리는 단계 이기는 하지만 결정적 이다. 각 이미지의 모든 데이터는 한.txt 파일에 있습니다. 한 셀 (특히 그것의 표현 형의 CI와 주어진)의 모든 데이터는 한 줄에 있습니다. 각 슬라이드는 이미지 수집 및 후속 5 필드에 수행 했다.
  3. 원시 데이터와 자동된 세포 수의 세대의 통합
    1. 통계 프로그램을 사용 하 여 데이터를 계산 합니다.
      1. 1 환자에 대 한 분석 5 필드에 해당 하는 5 이미지에서 모든 데이터를 계산 합니다. 통계 플랫폼을 사용 하 고 경험된 통계, 데이터 관리자 또는 분석을 수행 하는 데이터 과학자. 자동으로 CI > 55%를 선택 하면, 그들의 표현 형에 따라 셀을 계산 하는 스크립트를 빌드하십시오.
      2. 시리즈의 모든.txt 파일을 같은 폴더에 넣어.
    2. 데이터를 압축을 풉니다.
      1. 한 폴더의 모든.txt 파일을 넣어. 3.3.1 단계에서 내장 자동 스크립트를 실행 합니다. R 스크립트에 의해 생성 된 출력.csv 파일을 엽니다. .Xl 형식으로 저장 합니다. 출력 각 환자에 대 한 (즉, CD8 혼자, CD8-PD-1, CD8-PD-1-팀-3) 각 표현 형에 대 한 셀의 수를 수집합니다.
      2. 필드 당 각 환자에 대 한 셀의 평균 수를 계산: 필드 각 환자에 대 한 셀의 수를 정규화 (즉, 5) 필드의 수는 셀 수를 나눕니다.
      3. 총 CD8 중 PD-1+ 세포의 비율을 계산+ T 세포, 및 총 CD8 중 PD-1+ 팀-3+ 셀+ T 세포. 이 단계의 요약 그림 5 를 참조 하십시오.
        참고: R 언어 (또는 선택의 다른 프로그래밍 소프트웨어) 제대로 작성 하 고, 명령을 실행 하는 데 필요한 이며 그래서 경험 많은 사용자 또는 통계/데이터 과학자 필수적 이다. R 프로그램 같은 환자 데이터를 계산할 수 있습니다 하지만 한 환자의 5.txt 파일의 이름을 고유한 환자 id에 해당 하는 동일한 시작 있어야 합니다.
  4. 통계 분석
    1. 통계 소프트웨어를 사용 하 여 결과의 통계 분석을 위해.
    2. 통계의 도움으로 적절 한 통계 분석을 수행 합니다.
      1. 사용 비패라메트릭 Wilcoxon 두 셀 고기 (그림 6) 경찰-1 MFI의 비교에 대 한 순위 테스트 서명. Pearson의 카이 제곱 테스트 covariate 및 조직학 특성 상관.
      2. 진행 성 자유로운 생존, 그리고 콕스 회귀 모델 등 전반적인 생존과 질병-무료 생존 시간 이벤트 결과에 covariate 효과 추정을 추정 하는 카 플 란-마이어 메서드를 사용 합니다.
      3. 고려 하십시오 p-값은 중요 한로 0.05 보다 낮은.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위에서 설명한 일반적인 프로토콜을 사용 하 여, 우리 intratumoral CD8 계량을 목적으로+ T 세포 금지 수용 체 PD-1, 팀-3와 상관 관계를 결과 임상 결과25RCC, 환자에서 냉동된 조직에 공동 표현.

CD8/PD-1/팀-3 얼룩의 최적화:

종 항 체 (마우스, 토끼, 염소, 재료의 표참조)의 다른 항 체 간의 교차 반응을 피하기 위하여 선택 되었다. 프로토콜은 편도 선, 인 조직된 림프 조직에 확인 했다. PD-1 얼룩에서 찾을 수 본 원 센터 (그림 1), 반면...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수정 및 문제 해결:

조직의 품질은 중요 한 매개 변수; 그것은 쉽게 되며 고 오신 채색에 의해 확인할 수 있습니다.

기술의 장점 중 하나는 다중화 된 stainings의 가능성 하지만 10 nm 최소의 델타 방출 파장을 선택 하는 것 권장 fluorophore 넘침을 방지 하려면. 여기, 우리가 4 stainings DAPI를 포함 하기 때문에, 우리는 하기로 파장 밖으로 확산 (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, Cyanine 3: 570 nm, Cyanine 5: 670 nm). 자동된 이미지 분석을 함께 혼합된 방출 신호에서 fluorophore의 순수한 스펙트럼을 계산 하는 소프트웨어를 사용 하 여 다양 한 fluorophores에서 신호를 중복의 위험을 피 한다. 모노 스테인드 슬라이드는 또한 스펙트럼 라이브러리 덕분에 보상으로 fluorophores 행위 사이 오버랩의 부...

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공개 사항

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모든 저자는 선언에 충돌의 관심 있다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 인 국가 뒤 암 (잉카) (동부 표준시), 리그 죄수 르 암 (동부 표준시), 대학교 소 르 본 파리 시 테 (동부 표준시), ANR (Selectimmunco) (동부 표준시), Labex 면역-종양학 (동부), SIRIC CARPEM (CG, 동부 표준시)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. EdG은 Fondation 아크의 친교에 의해 투자 되었다. EV 및 CD APHP (증권 거래소 검색 대회)의 친교에 의해 투자 되었다. 조흥은 대학교 소 르 본 파리 시 테 (성립 박사)의 친교에 의해 자금이 다. 저자는이 프로젝트에 그들의 자금에 대 한 브리스톨 마이어스 스 퀴 브를 감사 합니다. 저자는 병원 Européen 조르주 퐁피두의 병 리 및 Necker (Laurianne 챔 블, 엘 로디 미셸 Gisèle Legall)의 부를 감사합니다. 저자는 PARCC, 병원 Européen 조르쥬 퐁피두 (코 린 Lesaffre)의 조직학 플랫폼을 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Vectra 3 자동 정량적 병리학 이미징 Perkin ElmerCLS142338
inForm 세포 분석 2.1.Perkin ElmerCLS135781
R 소프트https://www.r-project.org
Dakopen 구분 펜DakoS2002
Tris Buffer Salin TBS 정제Takara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7.6 100
트리스 버퍼 살린 트윈 20 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142Z pH 7.6 100
비오틴 차단 시스템DakoX0590Avidin 0.1% 및 비오틴 0.01%
일반 당나귀 혈청Jackson Immunoresearch017-000-0015% vol./vol. 농도
Fluoroshield with DAPISigma-aldrichF60571.5 µ g/mL 농도
Knittel 유리 커버슬립Knittel Glä ser,10003924x60 mm 100 커버 슬립
토끼 안티 CD8 클론 P17-VnovusNBP1-790554 µ에서 사용; g/mL
마우스 anti-PD-1 Clone NATabcamab525872 µ에서 사용; g/mL
염소 안티 Tim-3R& DAF23653 µ에서 사용합니다. g / mL
토끼 안티 PD-L1 클론 SP142Roche73094570011 µ에서 사용; g/mL
마우스 AF647 표지 pan- Keratin Clone C11Cell Signalling45280.5 µ에서 사용; g/mL
염소 안티 휴먼 gal9R& DAF20450.3 & 마이크로에서 사용합니다. g/mL
시안 5 활용 당나귀 안티 토끼Jackson Immunoresearch711-175-1525 µ에서 사용; g/mL
비오틴화 F(ab' 2) 당나귀 안티 마우스 IgG잭슨 Immunoresearch715-066-1503 µ에서 사용; g/mL
Alexa Fluor488 활용 당나귀 안티 염소 IgGabcamab1501335 µ에서 사용; g/mL
Cy3 표지된 streptavidinAmershamPA430013 &마이크로에서 사용; g/mL
음성 대조군 마우스 IgG1DakoX09312 µ에서 사용;
염소 혈청Sigma-aldrichI5256는 3 µ에서 사용합니다.
토끼 혈청시그마 알드리치I50064µ에 사용합니다; g/mL
정 정 는 는 에서 추출한 g/mL IgG에서 g/mL IgG는

참고문헌

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Multiplexed ImmunofluorescencePD 1 Tim 3 Co expressionTumor Infiltrating CD8 T CellsFluorescence Multispectral ImagingCell Segmentation AnalysisPhenotyping AlgorithmAutofluorescence RemovalRenal Cell CarcinomaImmune Checkpoint MarkersClinical Prognosis Correlation

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