면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

Summary

종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산⁺ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.

Abstract

면역 세포 종양 microenvironment의 중요 한 구성 요소 이며 발암의 모든 단계에서 종양 성장과 진화에 영향. 특히, 그것 지금 잘 설립 인간의 종양에 면역 침투 예 후와 치료에 응답을 상호 연결할 수 있습니다. 종양 microenvironment에 면역 침투의 분석은 환자와 치료에 대 한 응답의 분류에 대 한 주요 도전 되고있다.

억제 수용 체 프로그램 세포 죽음 단백질 1 (PD1; 일컬어 CD279), 세포 독성 T 림프 구 관련 4 (CTLA-4) 단백질, T 세포 면역 글로불린 및 Mucin 포함 단백질-3 (팀 3, 일컬어 CD366), 림프 구 등의 공동 식 활성화 유전자 3 (지연-3, 일컬어 CD223), T 세포 소모의 특징 이다. 우리는 multiparametric 제자리에 면역 형광 식별 하 고 이러한 억제 수용 체의 공동 식 세포 수준에서 계량 얼룩을 개발 했다. 신장 세포 carcinomas (RCC)의 냉동된 조직의 회고전 시리즈, 이미지 분석 소프트웨어와 결합 된 형광 multispectral 이미징 기술을 사용 하 여, 종양 CD8 침투에 PD 1 팀 3의 공동 식 찾아냈다⁺ T 세포 RCC에서 가난한 예 후와 상관 된다. 하 우리의 지식,이 대표가 자동 멀티플렉스 현장 기술 시연 첫 번째 연구는 몇 가지 임상 관련성 있을 수 있습니다.

Introduction

지난 몇 년 동안, immunotherapy RCC를 포함 하 여 암의 많은 종류에 대 한 매우 유망 치료로 등장 했습니다. 특히, immunotherapy 금지 검사점의 억제에 따라 PD 1 좋아하고 CTLA-4은 임상적으로 효과적인^1,2,3,,45, 것으로 보고 되었습니다. ⁶. 단일 클론 항 체 CTLA-4에 대 한 PD-1, 또는 프로그램 죽음 Ligand 1 (PD-L1) 이미 여러 암에 승인 되 고 오래 견 딘 임상 응답 환자⁷의 20% 이상으로 이어질. 그럼에도 불구 하 고, 모든 환자는 초 동 조치, 치료의 비용은 높다, 되며 이러한 치료 독성, 잠재적인 심각한 면역 같은 부작용을 선도. 따라서, 현재 도전 예측 마커 그 새로운 immunotherapies 식별 것입니다. 종양, PD-L1, 표현 또는⁺ T 세포 침투 intratumoral CD8의 수준에서 돌연변이....

Protocol

이 연구는 헬싱키의 선언에 따라 실시 되었다과 지역 윤리 위원회 (CPP Ile 드 프랑스 nr. 2012-05-04)에 의해 승인 되었다. 동의 동료에 포함 된 참가자 로부터 얻은 것입니다.

1. 조직 자료

1. 수술 당일에 RCC 조직 샘플을 수집 합니다. 실 온 (병 리과)에서 외과 견본을 처리 합니다.
2. 약 0.5 c m x 0.5 cm x 건조 관에 0.5 cm 크기의 종양 샘플을 수집 합니다. 스냅 액체 질소에서 냉동 고-80 ° c.에 저장
3. 최적의 절삭 온도 화합물 샘플 코트. 4-6 µ m 두께 섹션으로-20 ° C에서 cryostat와 샘플 섹션. 12 h에 대 한 슬라이드에 건조 한 공기를 직접 건조를 피하기 위해-80 ° C에서 그들을 저장 하는 예제를 보자.
4. 보고는 되며 샘플의 품질을 확인 하 고 오신 스테인드 섹션.

2. 제자리에서 TILs의 면역 형광 염색

1. 절차 지침
   1. 실 온에서 모든 실험 단계를 수행 합니다.
   2. 모든 단계에 대 한 희석 Tris 버퍼 염 분 (TBS, 참조 테이블의....

Results

위에서 설명한 일반적인 프로토콜을 사용 하 여, 우리 intratumoral CD8 계량을 목적으로⁺ T 세포 금지 수용 체 PD-1, 팀-3와 상관 관계를 결과 임상 결과²⁵RCC, 환자에서 냉동된 조직에 공동 표현.

CD8/PD-1/팀-3 얼룩의 최적화:

종 항 체 (마우스, 토끼, 염소, 재료의 표참조)의 다른 항 체 간의 교차 반응을 피하기 위하여 선택 되었다. 프로토콜은 편도 선, 인 조직된 림프 조직에 확인 했다. PD-1 얼룩에서 찾을 수 본 원 센터 (그림 1), 반면.......

Discussion

수정 및 문제 해결:

조직의 품질은 중요 한 매개 변수; 그것은 쉽게 되며 고 오신 채색에 의해 확인할 수 있습니다.

기술의 장점 중 하나는 다중화 된 stainings의 가능성 하지만 10 nm 최소의 델타 방출 파장을 선택 하는 것 권장 fluorophore 넘침을 방지 하려면. 여기, 우리가 4 stainings DAPI를 포함 하기 때문에, 우리는 하기로 파장 밖으로 확산 (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, Cyanine 3: 570 nm, Cyanine 5: 670 nm). 자동된 이미지 분석을 함께 혼합된 방출 신호에서 fluorophore의 순수한 스펙트럼을 계산 하는 소프트웨어를 사용 하 여 다양 한 fluorophores에서 신호를 중복의 위험을 피 한다. 모노 스테인드 슬라이드는 또한 스펙트럼 라이브러리 덕분에 보상으로 fluorophores 행위 사이 오버랩의 부.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vectra 3 자동 정량적 병리학 이미징	Perkin Elmer	CLS142338
inForm 세포 분석 2.1.	Perkin Elmer	CLS135781
R 소프트	https://www.r-project.org
Dakopen 구분 펜	Dako	S2002
Tris Buffer Salin TBS 정제	Takara, Bio Inc.	TAKT9141Z	pH7.6 100
트리스 버퍼 살린 트윈 20 TBS(+Tween20)	Takara, Bio Inc.		TAKT9142Z pH 7.6 100
비오틴 차단 시스템	Dako	X0590	Avidin 0.1% 및 비오틴 0.01%
일반 당나귀 혈청	Jackson Immunoresearch	017-000-001	5% vol./vol. 농도
Fluoroshield with DAPI	Sigma-aldrich	F6057	1.5 µ g/mL 농도
Knittel 유리 커버슬립	Knittel Glä ser,	100039	24x60 mm 100 커버 슬립
토끼 안티 CD8 클론 P17-V	novus	NBP1-79055	4 µ에서 사용; g/mL
마우스 anti-PD-1 Clone NAT	abcam	ab52587	2 µ에서 사용; g/mL
염소 안티 Tim-3	R& D	AF2365	3 µ에서 사용합니다. g / mL
토끼 안티 PD-L1 클론 SP142	Roche	7309457001	1 µ에서 사용; g/mL
마우스 AF647 표지 pan- Keratin Clone C11	Cell Signalling	4528	0.5 µ에서 사용; g/mL
염소 안티 휴먼 gal9	R& D	AF2045	0.3 & 마이크로에서 사용합니다. g/mL
시안 5 활용 당나귀 안티 토끼	Jackson Immunoresearch	711-175-152	5 µ에서 사용; g/mL
비오틴화 F(ab' 2) 당나귀 안티 마우스 IgG	잭슨 Immunoresearch	715-066-150	3 µ에서 사용; g/mL
Alexa Fluor488 활용 당나귀 안티 염소 IgG	abcam	ab150133	5 µ에서 사용; g/mL
Cy3 표지된 streptavidin	Amersham	PA43001	3 &마이크로에서 사용; g/mL
음성 대조군 마우스 IgG1	Dako	X0931	2 µ에서 사용;
염소 혈청	Sigma-aldrich	I5256	는 3 µ에서 사용합니다.
토끼 혈청	시그마 알드리치	I5006	4µ에 사용합니다; g/mL