Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

요약

현재 연구 신 부유한 반복 키 2 Rab10 인 산화의 내 생 레벨을 탐지 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

초록

신 부유한 반복 키 2 (LRRK2)에 돌연변이 가족성 파 킨 슨 병 (FPD) 연결 될 표시 되었습니다. LRRK2의 키 니 아 제 활동의 비정상적인 활성화 PD의 병 인에 연루 되어, 이후 LRRK2의 키 니 아 제 활동의 생리 적인 수준을 평가 하는 방법을 확립 필수적입니다. 최근 연구는 LRRK2 랩 GTPase 가족, Rab10를 포함 하 여 생리 적 조건 하에서 phosphorylates 밝혔다. Immunoblotting에 대 한 현재 사용할 수 있는 인 산화 특정 항 체의 불 쌍 한 감도 때문에 의해 그것을 감지 하기 어려운 되었습니다 LRRK2 경작된 한 세포에 의해 내 생 Rab10의 인 산화는 질량 분석에 의해 검출 될 수, 있지만 Rab10입니다. 여기, 우리는 간단한 설명 LRRK2 여 Rab10 인 산화의 내 생 수준 감지 방식의 immunoblotting 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 인산 염-바인딩 태그 (태그 P)를 함께 활용 하 여 기반을 N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N',N'-트리 스 (pyridin-2-yl-메 틸)-1, 3-diaminopropan-2-올. 현재 프로토콜 P 태그를 활용 하는 방법의 예제를 제공 뿐만 아니라 또한 어떻게 돌연변이 억제 물 치료/관리 또는 어떤 다른 요인 든 지의 세포와 조직에 LRRK2 하류 신호을 변경의 평가 가능 하 게 .

서론

PD 주로 영향을 미치는 dopaminergic 신경은 midbrain에 노인¹모터 시스템의 장애에서 발생 하는 가장 흔한 신경 퇴행 성 질환 중 하나입니다. 대부분의 환자는 산발적으로 PD를 개발, 질병을 상속 하는 가족이 있습니다. FPD²연결 될 몇몇 유전자에 돌연변이 발견 되었습니다. FPD에 대 한 원인 유전자 중 하나입니다 LRRK2, 8 개의 missense 돌연변이 (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S, 및 I2020T) 라는 PARK8 지배적 상속된 FPD에 연결 보고^3,,45를 지금까지 있다. 여러 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS) 산발적 PD 환자 또한 식별 LRRK2 로커 스에서 게놈 변이 위험 요인으로 PD, 제안 LRRK2의 기능에 이상이 모두 산발적 neurodegeneration의 일반적인 원인에 대 한 그리고 PARK8 FPD^6,,78.

LRRK2 신 부유한 반복 도메인, 복잡 한 단백질 (ROC) 도메인, ROC (오호) 도메인, 떠들고/트레오닌 단백질 키 니 아 제 도메인 및 WD40 반복 도메인⁹의 C-터미널의 GTP 바인딩 Ras 구성 된 큰 단백질 (2,527 아미노산) 이다. 8 FPD 돌연변이 찾을 이러한 기능 도메인; N1437H 그리고 R1441C/G/H/S ROC 도메인, 오호 도메인, G2019S 및 I2020T 키 도메인에서 Y1699C. 가정 했다 이후로 PD 환자^10,,1112에 돌연변이 발견 가장 자주, G2019S 돌연변이 체 외에서2-3 배¹³LRRK2의 키 니 아 제 활동 증가, LRRK2 substrate(s)의 인 산화의 비정상적인 증가 신경에 독성입니다. 그러나, 그것은 되었습니다 하지 순수 관련 LRRK2 기판의 인 산화 환자 파생된 샘플에서 평가 하는 방법의 부족으로 인해 가족/산발적 PD 환자에서 변경 여부를 공부 하.

단백질 인 산화는 일반적으로 immunoblotting 또는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 특히 대량 spectrometric 분석 하거나 단백질의 phosphorylated 상태를 인식 하는 항 체를 사용 하 여 검색 됩니다. 그러나, 전 전략 때로는 적용할 수 없습니다 인 산화 특정 항 체를 만드는 어려움 때문에. 방사성 인산 염 세포의 신진 대사 라벨 인 산화 특정 항 체는 쉽게 사용할 수 때 인 산화의 생리 적 수준 검사 다른 옵션입니다. 그러나, 그것은 많은 양의 방사성 물질을 필요로 하 고 따라서 radioprotection¹⁴에 대 한 몇 가지 특수 장비를 포함 한다. 대량 spectrometric 분석은 더 민감한이 토론 방법에 비해 고 단백질 인 산화 분석에서 대중적 되었다. 그러나, 샘플 준비 시간 이다-소모, 그리고 비싼 악기는 분석을 위해 필요 합니다.

직접적인 생리 기판 LRRK2 대규모 phosphoproteomic 분석¹⁵의 결과에 따라 Rab10와 Rab8를 포함 하 여 랩 GTPase 가족의 부분 집합 최근에 알려졌다. 우리는 다음 Rab10 인 산화 FPD 돌연변이 마우스¹⁶를 쫓 고의 폐와 마우스 미 발달 섬유 아 세포에 의해 증가 되었다 설명 했다. 이 보고서에서 우리는 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)을 선택-P 태그 분자는 SDS 페이지 젤 (P 태그 SDS 페이지) 검색 Rab10 인 산화의 내 생 수준으로 공동 polymerized 메서드를 기반으로 때문에 phosphorylated Rab10에 대 한 특정 높게 과민 한 항 체는 여전히 부족 했다. 우리는 총 Rab8에 대 한 현재 사용할 수 있는 항 체의 가난한 선택으로 인해 생 Rab8의 인 산화를 감지 하지 못했습니다. 따라서, 우리는 Rab10 인 산화에 집중 하기로 결정 했다. LRRK2는 Thr73 높은 보존 "스위치" II 영역의 중간 위치에서 Rab10를 phosphorylates. Rab 단백질 중 인 산화 위치의 높은 보존 별개 Rab 단백질을 인식 하는 phosphospecific 항 체 확인 하기 어려운 이유 중 하나를 수 있습니다.

LRRK2에 의해 Rab8A의 인 산화 Rabin8, 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인 (GEF) GTP¹⁵바인딩된 GDP를 교환 하 여 Rab8A를 활성화의 바인딩을 억제. Rab10 및 Rab8A LRRK2에 의해의 인 산화는 또한 GDP 분리 억제제 (GDIs),이 Rab 단백질의 활성화에 필수적인 막¹⁵에서 GDP 바인딩된 Rab 단백질을 추출 하 여 바인딩을 억제. 그 랩으로 LRRK2 단백질의 인 산화에서에서 그들을 방지 활성화는 정확한 분자 메커니즘 및 생리 적인 결과 인 산화의 불분명 남아 있지만 가정은 했다.

P 태그 SDS 페이지 기노시타 외. 2006 년에 발명 했다:이 방법에서는, 아크릴은 covalently와 결합 하 여 P 태그, 캡처 SDS 페이지에 copolymerized 높은 선호도와 인산 염 분자 젤¹⁷. SDS 페이지 젤에서 P 태그 분자는 선택적으로 phosphorylated 단백질 전기 이동 기동성을 지체, 때문에 P 태그 SDS 페이지 phosphorylated 아닌 것 들 로부터 phosphorylated 단백질을 분리할 수 있습니다 (그림 1). 관심의 단백질은 여러 잔류물에 phosphorylated, 차동 phosphorylated 모양에 해당 하는 밴드의 사다리 관찰 됩니다. Rab10의 경우 우리는 Rab10 Thr73에만 phosphorylated는 나타내는 하나만 이동된 밴드를 관찰 합니다. 인 산화 특정 항 체와 immunoblotting P 태그 SDS 페이지의 주요 장점은 phosphorylated Rab10 immunoblotting 비 인 산화 특정 항 체 (즉, 인식 총 Rab10)와 의해 검출 될 수 있다 세포 막에 전송 되 고, 후는 일반적으로 더 민감한, 구체적이 고 사용할 수 있는 상업/학술 소스에서. P 태그 SDS 페이지를 사용 하 여의 또 다른 장점은 이다 그 하나 얻을 수 있다 인 산화를의 산출할의 대략적인 추정 인 산화 특정 항 체와 immunoblotting 또는 방사성을 가진 세포의 신진 대사 라벨는 불가능 인산 염입니다.

저렴 한 P 태그 아크릴 및 그것에 관련 된 몇 가지 사소한 수정 사용 떨어져 LRRK2 여 Rab10 인 산화의 검출에 대 한 현재 메서드 immunoblotting의 일반 프로토콜을 다음과 같습니다.따라서, 간단 하 고 쉽게 실행 immunoblotting은 평소 연습, 순화 된 단백질, 세포 lysates 조직 homogenates를 포함 하는 샘플의 어떤 종류와 어떤 실험실에서 이어야 한다.

프로토콜

1. P-태그 SDS-페이지에 대 한 샘플 준비

1. 제거 있는 세포는 흡입을 사용 하 여 재배는 10 cm에서에서 미디어를 삭제와 셀 셀 레이어를 방해 하지 않도록 하는 접시의 측면에 처음 추가 DPBS 여 Dulbecco 5 mL의 인산 염 버퍼 염 (DPBS)을 씻어 하 고 수동으로 다시 요리를 바위 그리고 앞뒤로 여러 번.
2. 제거 하 고 DPBS는 흡입을 사용 하 여 삭제 하 고 0.25% (w/v) trypsin DPBS에 희석의 2 개 mL를 추가 셀 레이어 커버에 요리를 부드럽게 바위. 요리는 CO₂ 배양 기 (37 ° C, 습도 공기, 5% CO₂) 5 분 동안 넣어.
3. 분리 된 셀 헤어 일회용 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting 후 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 하 고 현미경¹⁸에서 hematocytometer를 사용 하 여 셀 밀도 측정.
4. 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 보충 하는 2.5 × 10⁵ 셀/ml Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM)와 셀을 희석. 6 잘 플레이트의 각 음에 희석된 셀 서 스 펜 션의 2 개 mL (5 × 10⁵ 셀)를 추가 합니다.
5. CO₂ 인큐베이터 (37 ° C, 습도 공기, 5% CO₂)에서 하룻밤 세포 성장.
6. Transfection HEK293 세포로
   참고: 생 Rab10의 인 산화 하는 경우 검사, 1.7 단계를 진행 합니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 플라스 미드는 요청 시 저자에서 얻어질 수 있다. 간략 한 정보에 대 한 재료의 표 및 그림 s 1 의 DNA 시퀀스를 참조 하십시오.
   1. Aliquot 200 µ L DMEM의 1.5 mL 튜브에.
   2. 각 튜브를 인코딩 하 Rab10 및 1.066 µ g (5.33 µ g/mL의 최종 농도)는 플라스 미드 인코딩 3 ×의 플래그 LRRK2 500 µ g/mL 플라스 미드 주식에서 플라스 미드의 두 0.266 µ g (1.33 µ g/mL의 최종 농도)를 추가 합니다. 다음 polyethyleneimine (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.0에에서 녹아 있는)의 1 mg/mL 해결책의 4 µ L을 추가 하 고 즉시 혼합 솔루션 5 vortexing s.
   3. 튜브 10 분 동안 실내 온도에 서 서 하 고 잘 사용 하 여는 micropipette dropwise 한 튜브의 내용을 추가 하자. 부드럽게 및 수동으로 바위 문화 접시 앞뒤로 여러 번 잘 걸쳐 균등 하 게 확산 transfection 혼합물 수 있도록.
7. 또 다른 24-36 h는 CO₂ 배양 기 (37 ° C, 습도 공기, 5% CO₂)에 대 한 성장 하는 세포를 하자.
8. 내 생 Rab10의 인 산화 하는 경우 검사, 세포를 lysing 전에 셀 1 h LRRK2 억제제 없이 처리 합니다.
   1. 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 10mm에에서 억제제를 용 해 하 여 LRRK2 억제제의 재고 솔루션을 준비 합니다. MLi-2와 GSK2578215A, 매우 구체적이 고 강력한 LRRK2 억제제를 사용 하는 것이 좋습니다. -80 ° c.에 재고 솔루션 저장
   2. DMSO와 재고 솔루션을 diluting 하 여 작업 주식은 억제제의 준비: MLi-2 생 및 overexpressed LRRK2 위한 10 µ M 및 30 µ M를 각각 준비. GSK2578215A를 위한 준비 1 밀리미터와 3 밀리미터 생 및 overexpressed LRRK2, 각각.
   3. 잘 사용 하는 micropipette의 중간 MLi-2 또는 GSK2578215A의 일의 2 µ L을 추가 하 고 부드럽게 잘 걸쳐 균등 하 게 확산 억제제를 접시 수동으로 앞뒤로 여러 번 바위.
   4. 단계 1.8.3에서에서 억제제를 비슷한 방식으로 부정적인 컨트롤을 다른 영역 DMSO의 2 µ L 추가 합니다.
   5. 인큐베이터에 다시 접시를 넣고 1 시간에 대 한 셀을 문화.
9. 셀 lyse
   1. 얼음에 배양 배지를 넣어. 제거 하 고 미디어를 삭제. 첫 번째 추가 2 mL 셀을 방해 하지 않도록 하는 접시의 측면에 DPBS 레이어를 수동으로 바위 요리 앞뒤로 여러 번 하 여 세포를 씻어.
   2. 제거 하 고 삭제는 DPBS 세포의 용 해 버퍼의 셀 100 µ L에 추가 (50 mM Tris HCl pH 7.5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) octylphenyl 에테르, 1mm EGTA (에틸렌 글리콜-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic 산), 1 m m 나트륨 orthovanadate, 50 m m 나트륨 불 화물, 10 m m β-glycerophosphate, 5 mM 나트륨 파이 인산, 0.1 µ g/mL microcystin LR, 270 m m 자당, 프로 테아 제 억제 물 칵테일).
   3. 얼음에 번호판 기울기와 수집 가능한 lysate 많은 셀을 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 다쳤어요. Lysates (미리 얼음에 냉장) 1.5 mL 튜브에는 micropipette를 사용 하 여 수집 합니다.
      주의: Microcystin LR 치명적일 수 있습니다 삼 켜 또는 피부에 접촉 하는 경우.
10. 완전 한 세포에 대 일 분 동안 얼음에 서 관을 보자. 원심 분리 (20000 × g, 4 ° C에서 10 분)에 의해 세포 lysates를 명확히 하 고 미리 얼음에 냉장 새로운 1.5 mL 튜브에는 supernatants 전송.
11. Bradford 분석 실험에 의해 허가 lysates의 단백질 농도 (µ g / µ L)를 측정 합니다.
    1. 준비 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 기준 (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 및 1 mg/mL) 증류수와 재고 솔루션을 diluting 하 여. 20-fold에 의해 허가 세포 lysates 희석 된 증류수.
    2. 3 중에서 96 잘 접시에 lysate BSA 기준, 빈 (증류수), 그리고 각 희석된 셀의 5 µ L/잘 넣어.
    3. 12 채널 micropipette를 사용 하 여 Bradford 분석 결과 시 약의 150 µ L/잘 추가 하 고 5 분 동안 실내 온도에 서 서 접시를 보자.
    4. 595에서 흡 광도 측정 플레이트 리더와 BSA 기준 비교에 nm.
12. SDS 페이지에 대 한 샘플의 100 µ L를 준비 합니다. 샘플의 단백질 농도 overexpressed HA-Rab10 대 한 µ 1 µ g/L 이며 생 Rab10에 대 한 µ 2 µ g/L.
    1. 단계의 1.11.4 정량된 농도 사용 하 여 볼륨 (µ L) 100 µ g (overexpressed HA-Rab10)에 해당 하는 세포 lysates의 200 µ g (생 Rab10) 나누어 계산 (100 µ g 또는 200 µ g) 단백질 양 (µ lysates의 단백질 농도 의해 g / µ l)입니다.
    2. 실 온에서 보관 하는 새로운 1.5 mL 튜브에 4 × Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼 (62.5 m m Tris HCl, pH 6.8, 8% (w/v) SDS, 40% (v/v) 글리세롤, 0.02% (w/v) bromophenol 블루, 4% (v/v) β-mercaptoethanol)의 25 µ L를 추가 합니다.
    3. 튜브 5 vortexing에 의해 혼합 셀 각 lysates의 계산된 볼륨 추가 실 온에서 s.
    4. 5 vortexing에 의해 세포의 용 해 버퍼와 혼합 100 µ L을 총 볼륨을가지고 실 온에서 s.
13. MnCl₂ chelating 에이전트를 풀기 위해 10mm로 보충. 500 mM MnCl₂의 1 µ L를 추가 합니다. 5 vortexing에 의해 혼합 실 온에서 s.
    참고: 샘플 포함 된 MnCl₂ 정상적인 SDS 페이지에 적합 한 않을 수 있습니다.

이 단계는 chelating 에이전트의 존재로 인해 필요 (ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), EGTA, 등 등) 세포의 용 해 버퍼에서. 그렇지 않으면, 미네소타^{2 +} 이온 P 태그 아크릴 아 미드 결합 chelating 에이전트에 의해 해리 될 것 이다 고 P 태그 SDS 페이지 제대로 작동 하지 않습니다.

5 분 동안 100 ° C에서 모든 샘플을 삶아 고 사용까지-20 ° C 아래에 샘플을 저장 합니다. 삶은 샘플은 6 개월 이상 저장할 수 있습니다.

2. 주조 젤 P 태그 SDS-페이지에 대 한

참고: 젤은 젤을 실행 같은 날에 제출 되어야 합니다. 젤은 주변 조명 조건 하에서 할 수 있다.

1. 메탄올의 100 µ L로 분말/고체 P 태그 아크릴의 10 mg을 먼저 용 해 하 여 5 mM P 태그 아크릴 재고 솔루션을 준비 하 고 두 배 증류수를 추가 하 여 3.3 mL를가지고.
   참고: P 태그 아크릴은 빛에 민감한. 준비 된 솔루션 사용까지 4 ° C에서 어둠 속에 저장 합니다.
2. 70% 에탄올을 분사 하 고 종이 타월로 닦아 하 여 깨끗 한 모두 평범 하 고 노치 접시. 젤 접시를 조립 한다. 이 특정 프로토콜에 사용 되는 젤 번호판의 크기는 80 또는 100 m m 폭 100 m m 여 긴. 깨끗 한 실리콘 스페이서 일반 사이 넣고 노치 판과 조립된 판 바인더 클립 고정 됩니다.
   참고: 일반적인 SDS-PAGE를 위해 일 하는 젤 격판덮개의 모든 종류를 사용할 수 있습니다.
3. 빗을 넣어 수 사용 (17-잘 플라스틱 빗) 조립된 젤 접시와 젤 격판덮개 우물의 바닥의 위치에 마크에 영구 표시와 함께.
4. 10% 아크릴 아 미드 젤 혼합물의 10 mL를 준비 (10% (w/v) 아크릴 (acrylamide:bis-아크릴 = 29: 1), 375 mM Tris HCl (pH 8.8), 0.1% (w/v) SDS) 15 mL 튜브에.
   참고: 최적의 농도의 아크릴 아 미드 사용 시 약에 따라 달라질 수 있습니다. Tetramethylethylenediamine (TEMED)와 암모늄 persulfate (AP)는이 시점에서 추가 되어야 합니다.
5. 추가 5 m m P-태그 아크릴의 100 µ L 1 M MnCl₂ 솔루션의 10 µ L 50 µ M, 100 µ M의 최종 농도에서 각각.
   참고: P 태그 아크릴 및 MnCl₂ 의 최적 농도 또한 사용 시 약에 따라 달라질 수 있습니다.
6. 0.15% (v/v)의 최종 농도에 젤 혼합물에 TEMED의 15 µ L 10% (w/v) APS 0.05% (w/v)의 최종 농도에 다음 50 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 즉시 높이로 즉 2mm 아래 위치 표시 단계 2.3에서에서 조립된 판으로 5 s와 부에 대 한 튜브를 소용돌이로 잘 섞는다.
7. 부드럽게 2-프로 판 올 젤을 분리의 상단을 평평 하 게 젤 솔루션에 레이어.
8. 젤 상 온에서 30 분 동안 서 보자. 빛 으로부터 젤을 보호 하기 위해 필요는 없습니다.
   참고: 그것은 차가운 실내 온도에서 설정 하는 젤에 대 한 더 오래 걸릴 수 있습니다. APS와 TEMED 추가 하기 전에 젤 혼합 기체 제거에이 단계를 가속화 하는 데 도움이 됩니다. 이 위해 젤 혼합물은 흡입에 연결 된 100-200 mL 삼각 플라스 크에 준비 될 수 있습니다. 10 분 솔루션 드
9. 종이 수건으로 흡수 하 여 레이어 2-프로 판 올을 제거 합니다.
10. 증류수 세척 병에서와 공간을 작성 하 여는 젤의 최고의 공간을 세척 하 고 물에서 분 지에 붓는 의해 무시. 반복 3 회 세척 합니다.
11. 잔여 수는 젤의 최고의 공간에 남아 있는 종이 수건으로 흡수 하 여 제거 합니다.
12. 3 mL 4% 아크릴 아 미드 젤 혼합물의 준비 (4% (w/v) 아크릴 (a: crylamide:bis-아크릴 = 29: 1), 125 mM Tris HCl (pH 6.8), 0.1% (w/v) SDS) 15 mL 튜브에.
    참고: 겹침 젤 혼합물에 P 태그 아크릴 또는 MnCl₂ 솔루션을 추가 하지 마십시오.
13. TEMED의 7.5 µ L와 10% (w/v) APS 0.25% (v/v) 및 0.08% (w/v)의 최종 농도 24 µ L를 각각 추가 합니다. 부드럽게 5 s를 분리 젤 위에 혼합물을 부 어 관을 소용돌이 의해 잘 혼합. 바로 적절 한 빗 (예를 들어 샘플의 최대 25 µ L를 수용 하는 17-잘 플라스틱 빗)을 넣어.
14. 젤 상 온에서 30 분 동안 서 보자. 빛 으로부터 젤을 보호 하기 위해 필요는 없습니다. 겹쳐 쌓이는 젤 설정 후 추가 스토리지 없이 그들을 실행 합니다.

3. SDS-페이지 및 Immunoblotting

1. 젤에서 빗을 제거 합니다. 다음은 젤에서 실리콘 스페이서 그리고 클립을 제거 합니다.
2. 젤 탱크에 casted 젤을 넣고 바인더 클립 클램핑 하 여 탱크에 젤을 수정.
3. 아래는 젤의 상단에서 실행 버퍼 (25mm Tris, 192 m m 글리신, 0.1% (w/v) SDS)를 부 어. 제거 젤을 5 mL 주사기 및 바늘 21 G를 사용 하 여 실행 중인 버퍼 플러시에 의해의 깨끗 한 우물
4. 주사기에 부착 된 구부러진된 바늘을 사용 하 여 젤의 하단 공간에서 공기 방울을 제거 합니다. 구부러진된 바늘을 하려면 수동으로 구부려 21 G 바늘 바늘 중간 그래서는 팁과 바늘의 각도가 30-45 °.
5. 명확한 예제를 실 온에서 1 분 동안 20000 × g에서 MnCl₂ 의 추가 의해 발생 하는 침전 물 아래로 회전 합니다.
6. 내 인 성 Rab10에 overexpressed Rab10과 30 µ g 단백질의 인 산화를 탐지 하기 위한 10 µ g 단백질을 로드 합니다.
   참고: 그것은 로드 모든 우물에 샘플의 동일한 볼륨에 중요 한입니다. 빈 레인 1 × Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼와 함께 로드 합니다. 샘플 포함 MnCl₂, MnCl₂ 의 동일한 농도 더미 샘플에 추가.
7. 잘 분자량 표시 (MWM)와 함께 로드 해야 또한 보완 될 1 × Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼 로드 샘플의 볼륨은 모든 우물에 동일.
   참고: 다시, 샘플 MnCl₂를 포함 하는 경우 추가 MnCl₂ 의 동일한 농도 MWM에. 또한, EDTA 무료 MWM 사용할 수 있습니다.
8. 염료 전면 분리 젤으로 교차 때까지 (약 30 분) 스태킹에 대 한 50 V에서 젤을 실행 합니다.
9. 후 샘플 스택 변경 전압 120 V 분리 염료 전면은 젤의 맨 아래에 도달할 때까지 (약 50 및 80 분 80, 100 m m에 대 한 긴 젤, 각각).
   참고:는 MWM의 마이그레이션 패턴 정상적인 SDS 페이지 젤에 다른 것으로 예상 된다. 그것은 P 태그 SDS 페이지 젤에 단백질의 분자량을 계산 사용할 수 없습니다 하지만 P 태그 젤의 재현성을 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 토론 을 참조 하십시오.
10. 워시는 젤에서 MnCl₂ 를 제거 하 젤.
    1. 버퍼 (48 m m Tris, 39mm 글리신, 20% (v/v) 메탄올) 포함 10 mM EDTA와 0.05% (w/v) SDS 컨테이너 (예를 들어, 대형 보트 무게)으로 전송 하 거 라.

버퍼의 볼륨 젤을 커버 하기에 충분 해야 합니다.

젤 격판덮개에서 분리 젤을 제거 하 고 하나의 컨테이너에 한 젤을 넣어. 겹쳐 쌓이는 젤을 삭제 합니다.

실 온에서 10 분 동안 락 통 (~ 60 rpm)에 젤을 둡니다.

세척 단계 총에서 3 회 반복 한다.
참고: 각 세척에 대 한 신선한 버퍼를 사용 합니다.

0.05% (w/v) EDTA를 제거 하는 SDS 포함 하는 전송 버퍼와 10 분 한 번 젤을 씻어. 버퍼의 볼륨 젤을 커버 하기에 충분 해야 합니다.

전기-니트로 또는 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 젖은 탱크를 사용 하 여 이동.

1. 전송 위한 스폰지 패드에 필터 종이 (10 x 7 cm)를 배치 합니다. 필터 종이에 젤을 놓습니다. 필터 종이 젤 사이 아무 기포는 다는 것을 확인 하십시오.
2. 막 (10 x 7 cm) 젤에 넣고 젤과 막 사이 공기 거품 없는 있는지 확인 하십시오.
3. 다른 필터 종이 (10 x 7 cm)에 막 넣고, 다시, 멤브레인 및 필터 종이 사이 아무 기포는 다는 것을 확인.
4. 필터 종이에 또 다른 스폰지 패드를 넣어. 멤브레인/필터 종이의 스택의 전송 위한 카세트에 넣어.
5. 막이 젤 하 고 긍정적으로 위탁된 한 양극 사이 전송 탱크에 카세트를 넣어.
6. 전원 공급 장치에 탱크를 연결 하 고 얼음 처럼 차가운 물으로 채워진 상자 발포 스 티 렌에에서는 탱크를 넣어. 100 V 180 분에서 시작 합니다.
   참고: P 태그 SDS 페이지 젤에서 단백질의 양도 일반 SDS 페이지 젤에서 그만큼 효율적으로 하지 않습니다 이후 장기간된 전송 필요 하다. 효율적인 냉각 전송 중 젤 녹는 피하기 위해 필수적입니다.

전송 확인

1. 핀셋을 사용 하 여 젤에서 멤브레인을 제거 하 고 플라스틱 용기에 세포 막에 옮겨진된 단백질 얼룩 Ponceau S 솔루션 (0.1% (w/v) Ponceau S, 5% (v/v) 초 산)에 막 담가. 솔루션의 볼륨 멤브레인을 커버 하기에 충분 해야 합니다.
2. 수동으로 락 하 여 실 온에서 1 분 동안 막 품 어.
   참고: 밴드의 사다리 각 레인에 표시 될 것입니다.
3. 핀셋으로 얼룩 솔루션에서 멤브레인을 선택 하 고 밴드의 사다리에 샘플 로드 어디 모든 레인에 균일 한 패턴 및 강도 있는지.
4. 확인 후는 얼룩, 얼룩 솔루션을 제거 하 고 TBST 버퍼 (20 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurate)를 추가 합니다. 버퍼의 볼륨 멤브레인을 커버 하기에 충분 해야 합니다.
   참고: Ponceau S 솔루션 수 및 여러 번 다시 사용.
5. 아니 보이는 밴드는 세포 막에 남아 때까지 실 온에서 락 통 (~ 60 rpm)에 TBST에 막 바위.
6. 5 분에 대 한 신선한 TBST 가진 세척 단계를 반복 합니다.

제거 하 고는 TBST를 삭제. 실 온에서 1 h TBST에 녹아 있는 5% (w/v) 탈지 우유를 추가 하 고 통 (~ 60 rpm)에 락 하 여 차단. 차단 솔루션의 볼륨 멤브레인을 커버 하기에 충분 해야 합니다.

1 차 항 체 (내 인 성 Rab10에 대 한 안티-Rab10 항 체) 및 안티-HA 항 체 overexpressed HA-Rab10에 대 한 차단 솔루션의 막 당 10 mL에 희석 하 여 1 차적인 항 체 솔루션 준비 (농도 대 한 재료의 표 참조).

제거 및 차단 솔루션을 삭제 하 고 기본 항 체를 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 락 통 (~ 60 rpm)에 막을 품 어

1 차적인 항 체 솔루션을 제거 하 고 세포 막 씻어 TBST를 추가. 버퍼의 볼륨 멤브레인을 커버 하기에 충분 해야 합니다.

실 온에서 락 통 (~ 60 rpm)에 5 분 동안 막 품 어. 반복 세척 (3.16 단계) 총에서 3 회 신선한 TBST를 사용 하 여 각 시간.

차단 솔루션의 막 당 10 mL에 묽 이차 항 체 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)으로 표시 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다. HRP와 안티-Rab10 항 체를 조사 하는 세포 막에 대 한 분류-토끼 IgG 항 체와 반대로 마우스 IgG 항 체는 HRP와 안티와 탐지 그에 대 한 분류를 사용 하 여-하 항 체 (농도 대 한 재료의 표 참조).

제거 하 고 세 번째 세척 후는 TBST를 삭제 이차 항 체 해결책을 추가 하십시오. 실 온에서 1 h 락 통 (~ 60 rpm)에 막 품 어.

10 분 세척 단계 총에서 3 회, 3.17 단계로 비슷한 반복에 대 한 세포 막 TBST에 씻어.

향상 된 화학 (ECL)를 사용 하 여 막 개발.
참고: 노출 시간 ECL 솔루션 및 화학의 감지에 사용 하는 시스템에 따라 달라질 수 있습니다.

1. 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라를 장착 하는 영상에는 영상에 연결 된 컴퓨터 설정. 영상에 대 한 제어 소프트웨어를 시작 합니다. CCD 카메라의 온도-25 ° c.에 도달 될 때까지 기다립니다
2. 벤치에 확산 플라스틱 랩에 한 막 ECL 솔루션의 1 mL를 넣어.
3. ECL 솔루션에는 막 젤 사이드-업을 넣고 신속 하 게 뒤집어 그것은 그렇게 막의 양쪽 모두는 솔루션 입힌 다.
4. 멤브레인을 선택 하 고 5 종이 타월 막 터치의 한쪽에 놓아 그것을 드레인 s.
5. 분명 영화 (예를 들어, 분명 종이 주머니) 사이 막 넣어.
   참고: 플라스틱 랩 포장은 막에 대 한 권장 하지 않습니다. 분명 영화는 막 배치를 위해 사용 가능한 고르지 못한 백그라운드를 피하기 위해 눈에 보이는 주름 없이 평면 있이 필요가 있다.
6. 막 검은 쟁반에 놓습니다. 영상에 트레이 넣어 고 문을 닫습니다.
7. 제어 소프트웨어의 창에 "초점" 버튼을 클릭 합니다. 막 올바르게 배치 됩니다 확인 하십시오. "반환" 버튼을 클릭 합니다.
8. "노출 유형"에 대 한 "전체"를 선택 합니다. "노출 시간"에 대 한 "수동"을 선택 하 고 노출 시간을 1로 설정 s.
9. "감도/해상도"에 대 한 "높음"을 선택 합니다. "디지털화 이미지 추가" 상태로 둡니다. 이미지를 "시작" 버튼을 클릭 합니다.
10. TIFF 파일로 컴퓨터에 디스플레이에 나타난 이미지를 저장 합니다.
11. 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150에서 노출 시간으로 촬영 이미지를 반복 s 최대 180 s. 마지막 이미지를 찍을 때 디지털 이미지, 막의 화학 하지를 동시에 촬영 수 있습니다 그래서 "디지털화 이미지 추가"를 확인 합니다.
12. 관심의 밴드에서 가장 큰 동적 범위와 saturating 픽셀 (빨간색으로 표시) 없이 이미지를 선택 합니다.
    참고: 기존의 x 선 필름 또한 탐지¹⁹에 대 한 사용할 수 있습니다.

결과

Overexpression 시스템: 하-Rab10 3의 인 산화 × 플래그 LRRK2 HEK293에 셀:

HEK293 세포 0.266 µ g의 HA Rab10 야생-타입 및 1.066 µ g 3 × 플래그 LRRK2 (야생-타입, 니 비활성 돌연변이 (K1906M), 또는 FPD 돌연변이)와 페 했다. Rab10 인 산화는 P 태그 SDS 페이지 immunoblotting 안티를 사용 하 여 다음에 의해 시험 되었다-하 항 체 (그림 2). 10 µ g 단백질의 포함 된 50 µ M P 태그 아크릴 100 µ M MnCl₂10% 젤 (80 x 100 x 1 m m)에 실행 되었다. P-태그 젤 (맨 위 패널)에 대 한 노출 시간이 10 s 표준 ECL 솔루션을 사용 하 여. LRRK2 Rab10와...

토론

여기, 우리 감지 LRRK2 P 태그 방법론에 따라 내 생 수준에 의해 인 산화 Rab10 손쉬운 강력한 방법을 설명 합니다. Phosphorylated Rab10에 대 한 현재 사용할 수 있는 항 체 overexpressed 단백질¹⁵만으로 작동을 하기 때문에 P 태그 SDS 페이지를 활용 하 여 현재 메서드 Rab10 인 산화의 내 생 수준을 평가 하는 유일한 방법입니다. 또한, 현재 메서드는 셀에 Rab10 인 산화의 산출할 추정 수 있습니다. P 태그 방법론 인 단백질에 일반적으로 적용할 수 있기 때문에, 현재 프로토콜 "프로토 타입" 다른 인 단백질 유사한 방법 수립에 대 한 수 있습니다.

프로토콜에 중요 한 단계는 주조 젤과 샘플의 준비. P 태그 아크릴 상대적으로 사진 정한 시 약 이며 phosphorylated 단백질 전기 이동 기동성을 지체 하는 능력은 4 ° c.에 장기 저장 후 손실 때로는 연구원 P 태그 아크릴 빛에...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)	수제		150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 MilliQ 물에 넣고 염화
나트륨	Nacalai를 고압증기멸균하여 살균합니다. Tesque	31320-34
나트륨 인산이나트륨 12-물	Wako	196-02835
염화칼	Wako	163-03545
인산이수소 칼	륨 Wako	169-04245
2.5% 트립신(10X)	Sigma-Aldrich	T4549	작업 용액
준비를 위한 멸균 DPBS로 10배 희석Dulbecco의 변형 된 Eagle medium (DMEM)	Wako	044-29765
Fetal bovine serum	BioWest	S1560	56 °에서 열 비활성화; C 30분 페
니실린-스트렙토마이신(100X)	Wako	168-23191
HEPES	Wako	342-01375
수산화나트륨	Wako	198-13765
폴리에틸렌 HCl MAX, 선형, Mw 40,000(PEI MAX 40000)	PolySciences, Inc.	24765-1	원액을 20mM HEPES-NaOH pH 7.0에서 1mg/mL로 제조한 다음 NaOH 디메틸설폭사이드로 pH를 7.0으로 조정했습니다
	Wako	045-28335
Tris	STAR	RSP-THA500G
Hydrochloric acid	Wako	080-01066
폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐 에테르	Wako	160-24751	Triton X-100과 동등합니다
에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'-테트라 아세트산 (EGTA)	Wako	346-01312
오르토 바나 데이트 나트륨 (V)	Wako	198-09752
불화 나트륨	간토 화학 물질	37174-20
β -글리세로 인산 나트륨 염 펜타 하이드레이트	Nacalai Tesque	17103-82
나트륨 피로인산염 데카하이드레이트	Kokusan Chemical	2113899
Microcystin-LR	Wako	136-12241
설탕	Wako	196-00015
완전한 EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일	Roche	11873580001	-20°C에서 저장할 수 있는 1 mL 물에 한 정제를 용해; C를 한 달 동안 사용합니다. 세포 용해를 위해 1:50 희석으로 사용
Pierce Coomassie (Bradford) 단백질 분석 키트	Thermo Fisher Scientific	23200
나트륨 도데실 설페이	Nacalai Tesque	31607-65
글리세롤	Wako	075-00616
Bromophenol 블루	Wako	021-02911
β-메르캅토에탄올	Kanto Chemical	25099-00
에탄올	Wako	056-06967
메탄올	Wako	136-01837
인산염 결합 태그 아크릴아미드	Wako	AAL-107	P-태그 아크릴아미드
40%(w/v) 아크릴아미드 용액	Nacalai Tesque	06119-45	아크릴아미드:Bis = 29:1
테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)	Nacalai Tesque	33401-72
과황산암모늄(APS)	Wako	016-08021	10%(w/v) 용액을 과황산암모늄 분말을 MilliQ 물
2-프로판올	Wako	166-04831
염화망간 사수화물	Sigma-Aldrich	M3634
Precision Plus Protein Prestained Standard	Bio-Rad	1610374, 1610373, 1610377	프로토콜에 사용되는 분자량 마커
: WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III	Wako	230-02461
Glycine	Nacalai Tesque	17109-64
Amersham, Protran, NC 0.45	GE Healthcare	10600007	니트로 셀룰로오스 멤브레인
Durapore 멤브레인 필터	EMD Millipore	GVHP00010	PVDF 멤브레인
필터 Papers No.1	Advantec	00013600
Ponceau S	Nacalai Tesque	28322-72
아세트산	Wako	017-00251
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	Wako	345-01865
탈지 분유	Difco Laboratories	232100
Immunostar	Wako	291-55203	ECL 용액(보통 감도)
Immunostar LD	Wako	290-69904	ECL 용액(고감도)
CBB 염색 용액	수제		1g CBB R-250, 50%(v/v) 메탄올, 10%(v/v) 아세트산 MilliQ 물 1L,
CBB R-250	Wako	031-17922
CBB 탈색 용액	수제		12 % (V / V) 메탄올, 7 % (V/V) 아세트산 1 L MilliQ 물
< 강> 이름 < / 강한>	< 강한> 회사 < / 강한> <	강한>카탈로그 번호 < / 강한>	< 강> 코멘트 < / 강>
< 강한> 항체 < / 강>
안티 HA 항체	시그마 알드리치	11583816001	0.2 μ 면역 블로팅을 위한 g/mL.
항-Rab10 항체	세포 신호 기술	#8127	면역블로팅을 위해 1:1000에 사용됨. 특이성은 CRISPR KO에 의해 확인되었습니다.
anti-pSer935 항체	Abcam	ab133450	1 &mu에서 사용; 면역 블로팅을 위한 g/mL.
항-LRRK2 항체	Abcam	ab133518	1 &mu에서 사용; 면역 블로팅을 위한 g/mL.
항 -& 알파; - 튜불린 항체	시그마 - Aldrich	T9026	1 μ 면역 블로팅을 위한 g/mL.
anti-GAPDH 항체	Santa-Cruz	sc-32233	0.02 μ 면역 블로팅을 위한 g/mL.
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	515-035-003	0.16 &mu에서 사용됨; 면역 블로팅을 위한 g/mL.
Peroxidase Affini순수 염소 안티 토끼 IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-003	0.16 &mu에서 사용; 면역 블로팅을 위한 g/mL.
Name	Company	카탈로그 번호<	strong>Comments
Inhibitors
GSK2578215A	MedChem Express	HY-13237	원액을 DMSO에서 10mM로 제조하고 -80°C에서 저장했습니다. C
MLi-2	Dr Dario Alessi (University of Dundee)에 의해 제공됨		스톡 용액은 10 mM에서 DMSO에서 준비되고 -80°C에서 저장되었습니다. C
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Plasmids
Rab10/pcDNA5 FRT TO HA	제공: Dr Dario Alessi (University of Dundee)		이 플라스미드는 아미노 말단에 HA로 표지된 human Rab10을 발현합니다.
LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10	Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학) 제공Ito		et al., Biochemistry, 46: 1380– 1388 (2007). 이 플라스미드는 아미노 말단 3xFLAG 태그가 지정된 야생형 인간 LRRK2를 발현합니다.
LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10	Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학)		제공 Ito et al., Biochemistry, 46: 1380– 1388 (2007). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 붙은 K1906M 키나아제 비활성 돌연변이를 발현합니다.
LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10			이 논문. 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 지정된 N1437H FPD 돌연변이를 발현합니다.
LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10	Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학)		et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 지정된 R1441C FPD 돌연변이를 발현합니다.
LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10	Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학)		et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 지정된 R1441G FPD 돌연변이를 발현합니다.
LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10	Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학) 제공Kamikawaji		et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 붙은 R1441H FPD 돌연변이를 발현합니다.
LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10			이 논문. 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 지정된 R1441S FPD 돌연변이를 발현합니다.
LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10	Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학)		et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 지정된 Y1699C FPD 돌연변이를 발현합니다.
LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10	Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학) 제공Kamikawaji		et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 붙은 G2019S FPD 돌연변이를 발현합니다.
LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10	Dr Takeshi Iwatsubo (도쿄 대학) 제공Kamikawaji		et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). 이 플라스미드는 인간 LRRK2의 아미노 말단 3xFLAG 태그가 붙은 I2020T FPD 돌연변이를 발현합니다.
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Equipments
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	Forma Series II 3110 Water-Jacketed
Auto	Pipette Drummond	Pipet-Aid PA-400
마이크로피펫 P10	Nichiryo	00-NPX2-10	0.5– 10 &뮤; L
마이크로피펫 P200	Nichiryo	00-NPX2-200	20– 200 &뮤; L
마이크로피펫 P1000	Nichiryo	00-NPX2-1000	100– 1000 &뮤;
L 마이크로피펫용 팁 P10	STAR	RST-481LCRST
마이크로피펫용 멸균 팁 P200	FUKAEKASEI	1201-705YS
마이크로피펫용 멸균 팁 P1000	STAR	RST-4810BRST	멸균
5mL 분무성 피펫	Greiner	606180	멸균
10mL 분무성 피펫	Greiner	607180	멸균
25 mL 디스퍼저블 피펫	Falcon	357535	멸균
혈액 세포 분석기	Sunlead Glass	A126	개선 된 Neubeuer
현미경	Olympus	CKX53
10cm 접시	Falcon	353003	조직 배양 용
6 웰 플레이트	AGC Techno Glass	3810-006	조직 배양 용
Vortex mixer	Scientific Industries	Vortex-Genie 2
셀 스크레이퍼	Sumitomo Bakelite	MS-93100
1.5 mL 튜브	STAR	RSV-MTT1.5
15 mL 튜브	AGC Techno Glass	2323-015
50 mL 튜브	AGC Techno Glass	2343-050
원심분리기	TOMY	MX-307
96-웰 플레이트	Greiner	655061	조직 배양용이 아님
플레이트 리더	분자 장치	SpectraMax M2e
SDS– PAGE 탱크	Nihon Eido	NA-1010
이송 탱크	Nihon Eido	NA-1510B
겔 플레이트 (노치)	Nihon Eido	NA-1000-1
겔 플레이트 (일반)	Nihon Eido	NA-1000-2
실리콘 스페이서	Nihon Eido	NA-1000-16
17-well combs	Nihon Eido	Custom made
바인더 클립	Nihon Eido	NA-1000-15
5 mL 주사기	Terumo	SS-05SZ
21G	Terumo	NN-2138R
Power Station 1000 VC	ATTO	AE-8450	전원 공급 장치 SDS– PAGE and transfer
대형 계량 보트	Ina Optika	AS-DL
플라스틱 용기	AS ONE	PS CASE No.4	10 x 80 x 50 mm
흔들림 쉐이커	Titech	NR-10
스티렌 폼 박스	일반		내부 치수는 하나의 이송 탱크(200 x 250 x 250mm)에 맞아야 합니다.
ImageQuant LAS-4000	GE Healthcare		ECL 감지를 위한 냉각식 CCD 카메라가 장착된 이미저