실시간 3D 단일 입자 추적에 대 한 프로토콜

요약

건설 및 운영의 실시간 3D 단일 입자 추적 현미경 추적 나노 형광의 높은 방산 속도 낮은 광자 수 요금에서 프로브이 프로토콜 세부 사항.

초록

실시간 3 차원 단일 입자 추적 (RT-3D-SPT) 셀룰러 시스템에 빠르고, 3D 프로세스에 주실 가능성이 있다. 다양 한 실시간 3D SPT 방법을 최근 몇 년 동안에 앞으로 넣어 왔다, 고속 추적 3D 낮은 광자 수 속도에서 입자 확산 남아 있다 도전. 또한, 실시간 3D SPT 설정은 일반적으로 복잡 하 고 어려운 구현, 생물 학적 문제에 그들의 광범위 한 응용 프로그램을 제한. 이 프로토콜 낮은 광자 수 전송률 (10 kHz)에서 3D 동적 광자 지역화 추적 (3D-DyPLoT), 높은 방산 속도 (최대 20 µ m²/s)와 입자를 추적할 수 있는 라는 실시간 3D SPT 시스템을 제공 합니다. 3D DyPLoT 사용 하 여 2D 전기 광학 전향 장치 (2D-EOD)와 단일 초점 드라이브 가변 음향 그라데이션 (태그) 렌즈 레이저 3D에서 동적으로. 최적화 된 위치 추정 알고리즘을 결합 하 여, 3D DyPLoT 높은 추적 속도 높은 지역화 정밀도와 단일 입자에 잠글 수 있습니다. 단일 여기 및 단일 검색 경로 레이아웃 때문 3D DyPLoT 강력 하 고 쉽게 설치 하는. 이 프로토콜에는 3D-DyPLoT 단계를 구축 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, 광학 레이아웃을 설명 합니다. 다음, 시스템 보정 이며 래스터 190 nm 형광 구슬 압 전 nanopositioner로 검색 하 여 최적화 된. 마지막으로, 실시간 3D 추적 능력을 보여 110 nm 형광 구슬은 물에서 추적 됩니다.

서론

고급 이미징 기술의 출현 분자 수준 내려가면서 세포 현상의 더 상세한 구조를 보고 창을 열었습니다. 확률적 광학 재건 현미경 (스톰)^1,2,3, 사진 활성화 지역화 현미경 (손바닥)^{,45,6,7 같은 방법} , 구조화 조명 현미경 (SIM)^8,,910,11및 자극 방출 소모 현미경 (호텔 위치)^{12,13, 14} 까지 구조와 살아있는 세포의 기능으로 전례 없는 세부 정보를 제공 하는 회절 한계 저쪽에 갔을. 그....

프로토콜

1. 레이아웃 및 정렬 설정

1. 설치 및 추적 여기의 준 레이저
   1. 집에서 만든 마운트를 사용 하 여 광학 테이블에 레이저 부착 마운트는 간단한 알루미늄 플레이트 설치 구멍을 이용한 레이저 머리와 광학 테이블입니다. 레이저는 안정성과 열 분산 금속 마운트에 단단히 부착 한다. 이 작품에 대 한 파장 맞게 특정 fluorophore 또는 실험에 선정 될 수 있다 488 nm 고체 레이저 조명 (그림 1)에 대 한 사용 합니다. 중요 한 요소는 레이저 파장 맞는 두 deflectors 사이 파 격판덮개에 의해 주로 결정 되는 2D EOD 작업 범위 (그림 1: W2). 488 nm 레이저는 녹색 또는 노란 형광 성 단백질 (GFP/YFP), 라이브 세포 실험에서 일반적인 형광 태그는 자극 효과적으로 수 있습니다.
   2. 레이저 빔 높이 및 유 전체 거울의 쌍을 사용 하 여 방향을 조정 (그림 1: M). 레이저 빔 병렬 광학 테이블에 있는지 확인 하 고 적당 한 높이로 조정.
      참고: 높이 선택 되어야 한다 현미경 플랫폼에 따라.....

결과

고정된 입자 (그림 4)를 검색 하 고 자유롭게 확산 110 nm 형광 입자 추적 (그림 5)는 위의 프로토콜에 따라 수행 했다. 입자 스캔 스캔에서 각 지점에서 위치 추정 입자의 동시에 계산 하는 동안 압 전 nanopositioner 및 빈 광자를 이동 하 여 수행 되었다. 스캔 이미지 심지어 강도 (그림 4a)의 사각형을 표시 하 고 예상된 위치 표시 x, 1 × 1 × 2 µ m 범위 입자의 실제 위치와 선형 관계를 y, 그리고 z 방향 (그림 4b-f).

실시간 추적을 보여 110 n.......

토론

비록 최근 몇 년 동안에서 3D 단일 입자 추적 방법의 많은 품종 등장, 간단한 설치를 사용 하 여 낮은 광자 수 속도로 고속 3D 확산의 강력한 실시간 추적은 여전히 중요 한 생물학의 응용을 제한 하는 도전 문제입니다. 3D DyPLoT 메서드를 사용 하면 이러한 문제는 여러 가지 방법으로이 프로토콜 주소에서 설명합니다. 첫째, 여기 및 탐지 경로 간단 하 고 강력한 정렬을 만드는 다른 구현에 비해 크게 단순화 됩니다. 둘째, 움직이는 레이저 자리와 위치 추정 알고리즘 피드백을 더 안정 하 고 피드백 루프에 대 한 정확한 위치 견적을 제공 합니다. 셋째, 동적으로 움직이는 레이저의 효과적으로 큰 감지 범위 (4 µ m x 1 x 1) 빠르게 움직이는 입자의 추적에 대 한 수 있습니다. 되는지 왜이 큰 탐지 영역 중요 한, 그것은 압 전 nanopositioner의 기본 응답 시간을 고려 하는 것이 중요입니다. 고속 압 전 단계 1 kHz, 1 양 1 ms, 4 µ m²/s의 확산 계수와 100 nm 나노 순.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2D 전기 광학 디플렉터	ConOptics	M310A	2 필요
EOD용 전원 공급 장치	ConOptics	412	FPGA 출력을 EOD TAG용 고전압으로 변환합니다
. 렌즈	TAG Optics	TAG 2.0	축 방향
XY 압전 나노 포지셔너	MadCity Labs	Nano-PDQ275HS	샘플을 이동시켜 입자를 목표 초점 볼륨에 고정하는 데 사용됩니다.
Z 압전 나노포지토너	MadCity Labs	Nano-OP65HS	확산 입자를 따르기 위해 대물 렌즈를 이동하는 데 사용됩니다.
Micropositioner	MadCity Labs	MicroDrive	대물 렌즈 샘플을 거칠게 배치하고 평가하는 데 사용됩니다
최고의 감도를 위해 필요한 높은 개구수는 대물 렌즈 Zeiss PlanApo입니다. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
sCMOS 카메라	PCO	pco.edge 4.2	입자의 위치를 모니터링하는 데 사용
APD	Excelitas	SPCM-ARQH-15	낮은 암흑 카운트 유익한
필드 프로그래밍 가능 게이트 어레이	National Instruments	NI-7852r
소프트웨어	National Instruments	LabVIEW
Tracking excitation laser	JDSU	FCD488-30
Lens	ThorLabs	AC254-150-A-ML	L1
렌즈	ThorLabs	AC254-200-A-ML	L2
핀홀	ThorLabs	P75S
PH Glan-Thompson 편광판	ThorLabs	GTH5-A	GT
반파 플레이트	ThorLabs	WPH05M-488	WP
렌즈	ThorLabs	AC254-75-A-ML	L3
렌즈	ThorLabs	AC254-250-A-ML	L4
렌즈	ThorLabs	AC254-200-A-ML	L5
렌즈	ThorLabs	AC254-200-A-ML	L6
이색성 미러	크로마	ZT405/488/561/640rpc	DC
형광 방출 필터	크로마	D535/40m	F
10/90 빔스플리터	크로마	21012	BS
PBS	Sigma	D8537
190nm 형광 나노 입자	Bangs 실험실	FC02F/9942
110nm 형광 나노 입자	Bangs 실험실	FC02F/10617
커버슬립	Fisher Scientific	12-545A
파워미터	Thorlabs	PM100D
CMOS	Thorlabs	DCC1545M
Iris	Thorlabs	SM1D12D
현미경	Mad City Labs	RM21