방법 논문

실시간 3D 단일 입자 추적에 대 한 프로토콜

DOI:

10.3791/56711

⸱

2018년 1월 3일

 , 
1Department of Chemistry, Duke University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

건설 및 운영의 실시간 3D 단일 입자 추적 현미경 추적 나노 형광의 높은 방산 속도 낮은 광자 수 요금에서 프로브이 프로토콜 세부 사항.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

실시간 3 차원 단일 입자 추적 (RT-3D-SPT) 셀룰러 시스템에 빠르고, 3D 프로세스에 주실 가능성이 있다. 다양 한 실시간 3D SPT 방법을 최근 몇 년 동안에 앞으로 넣어 왔다, 고속 추적 3D 낮은 광자 수 속도에서 입자 확산 남아 있다 도전. 또한, 실시간 3D SPT 설정은 일반적으로 복잡 하 고 어려운 구현, 생물 학적 문제에 그들의 광범위 한 응용 프로그램을 제한. 이 프로토콜 낮은 광자 수 전송률 (10 kHz)에서 3D 동적 광자 지역화 추적 (3D-DyPLoT), 높은 방산 속도 (최대 20 µ m2/s)와 입자를 추적할 수 있는 라는 실시간 3D SPT 시스템을 제공 합니다. 3D DyPLoT 사용 하 여 2D 전기 광학 전향 장치 (2D-EOD)와 단일 초점 드라이브 가변 음향 그라데이션 (태그) 렌즈 레이저 3D에서 동적으로. 최적화 된 위치 추정 알고리즘을 결합 하 여, 3D DyPLoT 높은 추적 속도 높은 지역화 정밀도와 단일 입자에 잠글 수 있습니다. 단일 여기 및 단일 검색 경로 레이아웃 때문 3D DyPLoT 강력 하 고 쉽게 설치 하는. 이 프로토콜에는 3D-DyPLoT 단계를 구축 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, 광학 레이아웃을 설명 합니다. 다음, 시스템 보정 이며 래스터 190 nm 형광 구슬 압 전 nanopositioner로 검색 하 여 최적화 된. 마지막으로, 실시간 3D 추적 능력을 보여 110 nm 형광 구슬은 물에서 추적 됩니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

고급 이미징 기술의 출현 분자 수준 내려가면서 세포 현상의 더 상세한 구조를 보고 창을 열었습니다. 확률적 광학 재건 현미경 (스톰)1,2,3, 사진 활성화 지역화 현미경 (손바닥),45,6,7 같은 방법 , 구조화 조명 현미경 (SIM)8,,910,11및 자극 방출 소모 현미경 (호텔 위치)12,13, 14 까지 구조와 살아있는 세포의 기능으로 전례 없는 세부 정보를 제공 하는 회절 한계 저쪽에 갔을. 그러나, 전체 이해 어떻게 이러한 시스템의 동작 구조 정보 뿐 아니라 동적 정보 필요 합니다. 위에 나열 된 슈퍼 해상도 방법 포함 절충 한 공간 해상도 시간적 해상도, 제한 시간 정밀도는 동적 프로세스를 탐색할 수 있습니다. 고정밀 공간 및 시간적 해상도 RT-3D-SPT15,,1617,18,19,20, 제공 하는 방법 21,22,23,24,25,26,27,,2829. 여기, 우리는 구별을 그릴 전통적인 3D-SPT30 RT-3D-SPT. 전통 사이 3D SPT 하려면 (이 중 confocal 현미경 또는 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 얻을 수 있다 3 차원 이미지 데이터의 시간 시리즈 오른쪽 구성 제공). 전통적인 3D-SPT에서 입자의 좌표는 궤적을 만들 각 이미지 스택에 입자를 찾아서 연속 볼륨에 위치를 연결 하 여 데이터 수집 후 결정 됩니다. 이러한 방법에 대 한 궁극적인 시간적 해상도 체적 이미징 속도 의해 결정 됩니다. Confocal 현미경, 이것은 쉽게 수십 초 초 규모 에입니다. 어떤 점에서 광학 경로 조작 축 위치 정보를 추출할 수 있도록 하는 epifluorescence 방법에 대 한 시간적 해상도 카메라 노출 또는 판독 시간에 의해 제한 됩니다. 이 epifluorescent 메서드는 축 정보를 수집할 수 있습니다 범위에서 제한 됩니다, 그리고 디자인 및 적응 광학이이 범위 10 µ m 또는 더 많은31,32 연장 비록 푸리에 비행기 단계에서 최근 진행 마스크 , 33 , 34.

반면, 실시간 3D SPT 3D 이미지 스택 취득 하 고 사후에 입자를 찾는에 의존 하지 않습니다. 대신, 실시간 위치 정보는 단일 포인트 감지기를 통해 추출 되 고 피드백 적용에 효과적으로 고속 압 전 단계에 사용 하는 렌즈의 초점에 입자를 "잠금". 입자의 위치 제한의 연속 측정을 얼마나 많은 광자를 수집할 수 있습니다 의해서만 수 있습니다. 또한,이 메서드는 긴 범위 이동할 때 입자의 스펙트럼 심문 수 있습니다. RT-3D-SPT 적용 작품 nanoscale 개체, 어떤 점에서 입자는 지속적으로 조사 하 고 큰 레이저 파워에 대 한 필요 없이 실시간 또는 광학 측정에 대 한 힘 없는 광학 트랩에 가깝다 강요 합니다. 그 RT-3D-SPT 낮은 광자 수 요금20,29, 3 차원에 빨리 퍼지는 개체 (최대 20 µ m2/s)25,29 의 연속 심문을 위해는 수단을 제공 합니다. 35, 그것은 세포내 화물 수송, 리간드-수용 체 바인딩 및 단일 virions의 extracellular 역학 등 빠르거나 과도 생물 학적 과정으로 창을 제공 해야 합니다. 그러나,이 시점에, RT-3D-SPT의 응용 프로그램 제한 되었습니다이 기술을 사전에 작업 그룹의 소수.

한 변화는 실시간 3D SPT 메서드에서 필요한 광학 레이아웃의 복잡성입니다. 대부분의 방법에 대 한 광 피드백 압 전 단계에 의해 제공 됩니다. 입자 게 작은 움직임을 X, Y, 또는 Z, 단일 포인트 감지기에서 정보는 오류 함수 변환에 먹이로 압 전 nanopositioner에 고속에 차례 이동 입자의 모션을 효과적으로 중화 샘플 목표 렌즈 기준으로 장소에 그것을 잠금. X에 작은 위치 움직임을 측정 하기 위해 Y, 그리고 Z, 여러 감지기 (4 또는 5는 구현에 따라)15,,1821 또는 여러 여기 명소 (2-4는 낮은 경우 적용 될 수는 잠금 증폭기 X를 추출 하는 데 사용 됩니다 및 Y 위치를 회전을 사용 하 여 레이저 자리)25,28 적용 됩니다. 이러한 여러 탐지 및 방출 반점의 오버랩 어려워질 시스템 및 유지 관리.

여기, 우리 3D-DyPLoT29라는 단순화 된 광학 설계 고속 표적은 고정 3D SPT 방법 제시. 3D DyPLoT 2D EOD와 태그 렌즈36,,3738 을 사용 하 여 동적으로 높은 속도로 (50khz XY, Z 70 kHz) 객관적인 초점 볼륨 통해 초점된 레이저 자리를 이동. 레이저 초점 위치와 광자 도착 시간을 결합 하 여 입자의 3D 위치를 낮은 광자 수 속도 에서도 신속 하 게 얻을 수 있습니다. 2D-EOD 기사의 투어 패턴39 X Y 평면에서 1 x 1 µ m의 사각형 크기에에서 레이저 초점을 태그 렌즈 축 방향으로 2-4 µ m의 범위에서 레이저 초점을 이동 한다. 최적화 된 위치 추정 알고리즘29,40 3 차원에서 3D 파티클 위치를 얻을 수 있습니다. 3D 동적으로 움직이는 레이저 자리, 광 양자 눈사태 포토 다이오드 (APD), 실시간 입자 위치 계산, 압 전 단계 피드백 및 데이터 기록에서 계산의 제어 필드 프로그래머블 게이트 어레이 (FPGA)에서 수행 됩니다.이 프로토콜에서 우리 3D-DyPLoT 현미경 광학 정렬, 고정된 입자와 보정을 포함 하 여, 단계별 구축 하는 방법을 설명 하 고 마지막으로 입자 추적 무료. 데모, 110 nm 형광 구슬 했다 추적 지속적으로 물에 한 번에 분.

여기에 설명 된 방법 그것은 낮은 조명 수준에서 바이러스, 나노 입자, 및 endosomes 같은 소포를 포함 하 여 빠른 속도로 움직이는 형광 프로브를 지속적으로 모니터링을 원하는 모든 응용 프로그램에 대 한 이상적인 선택입니다. 이전 방법을 달리 한 흥분 및 단일 검색 통로, 맞춤 및 유지 보수를 간단 하가 있다. 또한, 대형 탐지 영역 쉽게 신속 하 게 확산 하는 입자, (10 kHz) 아래로 낮은 신호 레벨에서 추적 하는 능력은이 방법을 낮은 조명 응용 프로그램29에 이상적 동안 데리 러이 현미경에서는.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 레이아웃 및 정렬 설정

  1. 설치 및 추적 여기의 준 레이저
    1. 집에서 만든 마운트를 사용 하 여 광학 테이블에 레이저 부착 마운트는 간단한 알루미늄 플레이트 설치 구멍을 이용한 레이저 머리와 광학 테이블입니다. 레이저는 안정성과 열 분산 금속 마운트에 단단히 부착 한다. 이 작품에 대 한 파장 맞게 특정 fluorophore 또는 실험에 선정 될 수 있다 488 nm 고체 레이저 조명 (그림 1)에 대 한 사용 합니다. 중요 한 요소는 레이저 파장 맞는 두 deflectors 사이 파 격판덮개에 의해 주로 결정 되는 2D EOD 작업 범위 (그림 1: W2). 488 nm 레이저는 녹색 또는 노란 형광 성 단백질 (GFP/YFP), 라이브 세포 실험에서 일반적인 형광 태그는 자극 효과적으로 수 있습니다.
    2. 레이저 빔 높이 및 유 전체 거울의 쌍을 사용 하 여 방향을 조정 (그림 1: M). 레이저 빔 병렬 광학 테이블에 있는지 확인 하 고 적당 한 높이로 조정.
      참고: 높이 선택 되어야 한다 현미경 플랫폼에 따라. 그것은 명시적으로 명시 되지 것입니다 하지만이 높이이 프로토콜에 사용 되는 모든 후속 거울에 대 한 유지 되어야 한다.
    3. 렌즈의 쌍을 가진 빔 당기기 (그림 1: l 1과 L2). 렌즈의 초점 길이 2D EOD의 조리개에 의해 잘린 되 고 레이저 자리를 피하기 위해 신중 하 게 선택 되어야 한다. 클리핑 2D EOD 통과 후 레이저 빔 모양에 있는 변화에 의해 분명 하다. 여기에 준의 품질 차 후속 렌즈에 의해 증폭 될 것 이다 하 고 모든 분기 2D EOD 편향의 성능이 저하 됩니다 때문에 아주 중요 하다. 이상적으로, 적어도 20 m 거리 지점에 광속을 집중 하 여 광속을 당기기.
  2. 장소는 작은 구멍 (그림 1: PH)의 첫 번째 준 렌즈의 초점에 적절 한 크기 (그림 1: L1).
    1. 적절 한 크기의 작은 구멍을 선택 하십시오. 작은 구멍 크기는 다음 계산에 따라 선택 될 수 있다:
      figure-protocol-1
      여기서 λ 는 레이저의 파장 f 첫 번째 렌즈의 초점 거리 이며 D 는 입력된 광속 직경.
    2. 첫 번째 준 렌즈의 초점에 정확 하 게 배치 될 수 있도록 3 차원 번역 단계에 pinhole을 탑재 합니다.
    3. 핀 홀의 위치를 조정 합니다. Pinhole 후 레이저 파워 미터를 놓고 전원 미터 판독을 최대화 하기 위해 XYZ에 핀 홀 위치를 조정 합니다. 회절 반지 관찰 2D EOD 앞 창포와 차단.
  3. Glan 톰슨 편광판의 설치
    1. Glan 톰슨 편광판을 넣어 (그림 1: GP) 후 두 번째 준 렌즈 (그림 1: L2) 레이저 광선의 편광을 청소. 최대 전송 전력 측정기와 함께 찾을 수 편광판을 회전 합니다.
  4. EODs의 설치
    1. 2 EODs를 사용 하 여 (그림 1: EOD1 & EOD2) X, Y 방향에서 레이저를 빗 나가게 하. 침로 벗어남, 피치 및 각 EOD의 높이 조정 하 여 레이저 전송을 극대화 합니다.
    2. 각 편향 측면에 제조업체에서 제공 하는 맞춤 마커를 사용 하 여 서로 관하여 2 개의 EODs를 맞춥니다.
    3. 2D-EOD의 컨트롤러는 EOD의 출력 검사에 테스트 패턴을 적용 합니다. 이 수는 나이트 투어 (그림 2) 아래에 설명 된 FPGA 또는 간단한 사인 파동 함수 발생기에 의해 제공을 통해 있습니다. 최상의 성능을 위해 각 편향에 의해 편향 피 nanopositioner의 X 또는 Y 방향에 평행 해야 합니다. 이 방향에 대 한 전송 축 deflectors의 각도 방향으로 결정 됩니다. 2D EOD를 이동 하지 않고 편향 방향 회전, 압 전 nanopositioner 축에 편향 축 정렬 2D EOD 후 비둘기 프리즘을 배치 합니다.
  5. 반 파 판의 설치
    1. 하프 웨이브 접시를 놓습니다 (그림 1: W1) Glan 톰슨 편광판 사이 (그림 1: GP) 들어오는 레이저 정렬 2D EOD 2D EOD의 편향 축과 편광 빔과. 2D EOD 후 긴 초점 렌즈 (300mm)를 놓고 레이저 포커스에서 sCMOS 카메라를 배치 합니다. 다음으로, 생성 (그림 2) 아래에 설명 된 나이트의 투어를 2D EOD를 켭니다. 하프 웨이브 접시를 돌려 하 여 균등 하 게 평방 레이저 분포는 카메라에 관찰.
  6. 렌즈 한 쌍 및 릴레이 렌즈 쌍을 늘리지 빔 설치
    1. 렌즈의 쌍을 배치 (그림 1: L3 및 L4) 대물 렌즈의 후면 조리개를 채우기 위해 빔 확장 2D EOD 후 (그림 1: OL)와 렌즈의 다른 쌍 (그림 1: L5, L6)를 현미경 목표에 초점면 릴레이. 반드시 태그 렌즈 나중 단계에서 그들 사이 설치 될 것 이다 렌즈의 두 쌍이 사이 충분 한 공간을 두어야 합니다.
  7. Dichroic 필터, 렌즈, APD, 렌즈, 그리고 형광 방출 필터 검색 경로 완료 하는 데 초점을 맞추고 10/90 빔 스플리터를 설치 합니다.
    1. 색 성 필터를 설치 (그림 1: DC) 대물 렌즈 쪽으로 레이저를 반영 하기 위해. 긴 렌즈 튜브의 위아래에 두 홍 채를 사용 하 여 대물 렌즈의 센터를 통해 바로 서 레이저를 맞춥니다.
    2. 10/90 빔 스플리터를 설치 (그림 1: BS) 이미징 sCMOS 카메라 (아래 설명 참조)와 추적 APD 통과의 90%에 의해 빛의 10%를 반영 하 여.
    3. APD를 맞춥니다. 대물 렌즈에 의해 한 coverslip에 레이저 초점. 객관적인 초점에는 coverslip 퍼 팅 APD 판독의 강도 확인 하 여 모든 다운스트림 요소를 정렬 하는 coverslip에서 반사를 사용 합니다. 빔 스플리터 설치 APD 초점 렌즈 (그림 1: L7)는 APD 3D 번역 단계에서 다음. 목표에서 레이저 반사 렌즈의 중심을 통과 하는 렌즈를 배치 합니다.
APD 위치는 coverslip에 레이저 반사에서 강도 극대화 하기 위해 3D 위치를 조정 하 여 최적화할 수 있습니다. 어떤 방향에서 검출기 위치 이동 강도 때 APD 위치 최적의 위치입니다.
  • Longpass 형광 방출 필터를 설치 (그림 1: F) 반영 하 고 흩어져 빛을 제거 하 빔 스플리터 전에.
  • 태그 렌즈의 설치
    1. 렌즈 두 쌍 사이의 태그 렌즈를 놓습니다 ( 그림 1사이: L4 및 L5)로 전에 언급 하 고 그림 1에 표시 된. 빔이 수직 센터의 태그 렌즈를 통해 전달 되도록 요, 피치, 높이 및 가로 위치를 조정 합니다.

    • 2. 샘플 준비입니다.

    1. 고정된 입자 준비
      1. 희석을 190 nm 형광 구슬 ~ 5 × 108 구슬/mL PBS에. 압 전 단계의 샘플 홀더에 coverslip 마운트에 400 µ L 비즈 솔루션 추가 (구슬의 볼륨 샘플 소유자에 따라 달라 집니다; 그리고 여기에 사용 되는 샘플 홀더 챔버의 직경은 18 m m). 여기에 사용 되는 구슬, PBS 입자는 coverslip에 입금 하면.
    2. 무료 이동 입자 준비
      1. 110 nm 형광 구슬 희석 ~ 5 × 108 구슬/mL 디 물. coverslip에 400 µ L 비즈 솔루션을 추가 하 고 압 전 단계의 샘플 홀더에 탑재.

    3. 최적화 추적 매개 변수

    1. 래스터 스캔 고정된 입자
      1. 고정된 입자 샘플을 현미경 위에.
      2. 레이저, micropositioner 컨트롤러, 압 전 nanopositioner 컨트롤러, 태그 렌즈 컨트롤러 및 EOD 컨트롤러를 켭니다. 참고 순서가 중요 하지 않습니다. 폐쇄 루프에서 압 전 nanopositioner를 실행 합니다.
      3. 래스터 스캔 사용자 지정 스캔 소프트웨어 프로그램 (그림 S3, 소프트웨어 저자에서 요청 시 제공), 2D EOD는 나이트 투어 (그림 2)에서 APD에서 카운트를 수집는 피에 조 드라이브를 사용 하 여 XYZ에 샘플 nanopositioner, 위치 계산 (그림 S2)를 수행 합니다. 단계 크기는 40 nm와 검사 범위는 2 µ m.
        1. 목표의 초점에는 coverslip를, 형광 방출 필터를 제거 하 고는 micropositioner의 Z 위치의 기능으로 신호 강도 극대화 하는 coverslip에서 레이저의 반사를 사용 합니다. 초점면에서 샘플을 배치 후 형광 방출 필터 다시 배치 합니다.
        2. 스캔 프로그램을 엽니다. '시작', '마침', 그리고 '단계'에 숫자를 입력 하 여 검색 범위와 스텝 크기를 설정 합니다. 먼저 큰 검사 범위 및 (예를 들어, 10 x 10 µ m 범위 200 nm 스텝 크기) 입자를 찾으려고 단계 크기를 설정 합니다. 입자를 찾는 후에 검색 범위를 축소 하 고 단계 크기 (예를 들어, 2 x 2 µ m 범위 100 nm 스텝 크기). 형광 초점을 찾아 3D 래스터 스캔을 수행 하는 '스캔' 버튼을 클릭 합니다.
    2. 태그 렌즈 설정 ( 그림 3참조)
      1. 태그 렌즈 제어 소프트웨어를 클릭 하십시오. 클릭 '연결', '전원' 순차적으로 합니다.
      2. 트리거 신호 출력 단계를 변경 하려면 출력 트리거 모드를 바꿀 필요가 있다. 먼저 'Multiplane'을 'RGB'에서 모드 변경 하 고 다시 그것을 변경 합니다. 이제는 단계 수 변경 (그림 3b).
      3. 0 °, 90 °, 270 ° 되도록 출력 단계를 설정 합니다. 이 세 가지 경험적으로 잘 작동을 발견 하는 위상 공간을 포함 하는 모든 세 단계를 사용할 수 있지만 (그림 3c).
      4. 68,500 Hz 주파수 설정을 선택 합니다.
      5. 최적의 주파수를 찾을 그것은 종종 주파수 검색 범위를 변경 하는 데 필요한입니다. '고급', '설정'을 클릭 합니다. 변화는 ' 최대. Freq(Hz)' 71,500 hz 70000 Hz에서 열 0의. 이 어떤 주파수 범위는 적절 하 게 조정할 수 있습니다. 클릭 '저장 교정', '종료 교정' (그림 3).
      6. 새로운 교정 유효화 하려면 다른 주파수 (예, 189,150 Hz)에 공명을 전환 하 고 다음 68,500 Hz 주파수 설정 (그림 3e)로 다시 전환.
      7. 35% 진폭을 점진적으로 변경 합니다. '공명 잠금'을 클릭 합니다. 주파수 고정 후 ' 공명 잠금 해제 ' (그림 3e)를 클릭 합니다. 태그 렌즈 지금 사용 준비가 되어 있습니다.
      8. 보정, 있도록 예상된 위치 실제 위치에 동일한 그림 4e와 같이 추정에 사용 되는 매개 변수를 변경, f. 입력 x, y의 스캐닝 범위와 z 클릭 '스캔' 버튼 이동 XYZ에 샘플을 검사 하는 움직이는 레이저 자리를 통해 입자입니다. 입자의 위치 레이저 초점을 통해 검색으로 위치 추정 루프 (그림 S1)에 의해 결정 예상된 입자 위치와 동의 해야 합니다. 예상된 위치 이미지 (그림 4 층)에서 예상된 위치와 실제 위치 (그림 4 d) 사이의 관계를 추출할 수 있습니다. 위치, 동의 하지 않는 경우 위치 추정 루프 (그림 S1)에 사용 되는 레이저 위치 (ck)의 값을 조정 합니다.
      9. 정렬 태그 렌즈
        1. 태그 렌즈 컨트롤러 해제 되어 때는 래스터 스캔 촬영 태그 렌즈를 설치 하기 전에 설치 태그 렌즈 동일 보여야 후 입자 이미지 (아래 설명 참조). 다음, 형광 입자 Z 스택 위치 및 태그 렌즈 (그림 4)의 각도 조정 하 z nanopositioner와 함께 목표를 이동 하 여 검색을 수행 합니다. 있을 때까지 아무 드리프트 입자 이미지에 Z 위치 (그림 4 d)의 함수로 입자의 XY 위치에서 변경 하는 경우 Z 방향에 따라 XY 평면에 태그 렌즈의 위치를 조정 합니다. 추적 시스템은 태그 렌즈의 정렬 후 사용할 준비가.
    3. 입자 모니터링을 위한 sCMOS 카메라의 설치
      1. 그들은 추적 되는 동안 입자를 시각화 하는 sCMOS 카메라를 설치 합니다. 추적 시스템의 모든 구성 설치 하 고 최적화 된 후에 sCMOS를 설치 합니다.
    현미경에 고정된 형광 입자 샘플을 로드 하 고 객관적인 초점 볼륨에서 1 개 입자를 잠그려면 추적 프로그램을 실행 합니다. 그런 다음 100 m m 초점 거리 렌즈를 설치 (그림 1: L8) 및 sCMOS. 입자의 이미지는 작고 밝은 자리에 초점을 맞추고 sCMOS 위치를 조정 합니다.

    4. 3D 추적 자유롭게 확산 하는 나노 입자의

    1. 넣어 110 nm 무료 현미경에 입자 샘플을 이동합니다.
    2. 레이저, 마이크로-포지 셔 너 컨트롤러, 압 전 nanopositioner 컨트롤러, 태그 렌즈 컨트롤러 및 EOD 컨트롤러를 켭니다. 오픈 루프에서 압 전 nanopositioner를 실행 합니다. 3.2 단계에 따라 태그 렌즈 소프트웨어를 설정 합니다.
    3. 열고 추적 소프트웨어 (저자에서 요청 시 사용 가능)를 실행 합니다. 섹션 3에 최적화 된 값으로 위치 추정 매개 변수를 설정 합니다.
    4. 목표의 초점에는 coverslip를, 형광 방출 필터를 제거 하 고는 micropositioner의 Z 위치의 기능으로 신호 강도 극대화 하는 coverslip에서 레이저의 반사를 사용 합니다. coverslip 찾는 후 레이저는 coverslip 그리고 솔루션에 초점을 초점 위치 15 µ m 증가. 장소 다시 형광 방출 필터.
    5. 통합 컨트롤 상수를 설정 합니다. 낮은 값에서 시작 하 고 진동 입자의 위치 정보에서 볼 수 있습니다 때까지 천천히 증가 통합 컨트롤 상수를 설정할 수 있습니다. 진동 관찰 되 면 진동 발생 값의 80%를 통합 제어 상수를 설정 합니다. 전형적인 값 XY '통합 이득'에 대 한 0.012 0.004 Z '통합 이득'에 대 한 주위에 있을 것입니다.
    6. ' 트랙 임계값 '와 ' 트랙 최소 ' 추적 임계값을 설정 하 고 '검색' 및 ' 자동 트랙 '을 클릭 하 여 추적 실험을 시작 합니다. 종료 추적에 대 한 임계값은 백그라운드 수준 보다 약간 높은 설정 하 고 추적 트리거 임계값은 배경 보다 약 2 배 높은. 여기, 트리거링 추적에 대 한 임계값은 3 kHz 고 궤적을 종료에 대 한 임계값은 1.5 kHz.

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    결과

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    고정된 입자 (그림 4)를 검색 하 고 자유롭게 확산 110 nm 형광 입자 추적 (그림 5)는 위의 프로토콜에 따라 수행 했다. 입자 스캔 스캔에서 각 지점에서 위치 추정 입자의 동시에 계산 하는 동안 압 전 nanopositioner 및 빈 광자를 이동 하 여 수행 되었다. 스캔 이미지 심지어 강도 (그림 4a)의 사각형을 표시 하 고 예상된 위치 표시 x, 1 × 1 × 2 µ m 범위 입자의 실제 위치와 선형 관계를 y, 그리고 z 방향 (그림 4b-f).

    실시간 추적을 보여 110 n...

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    토론

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    비록 최근 몇 년 동안에서 3D 단일 입자 추적 방법의 많은 품종 등장, 간단한 설치를 사용 하 여 낮은 광자 수 속도로 고속 3D 확산의 강력한 실시간 추적은 여전히 중요 한 생물학의 응용을 제한 하는 도전 문제입니다. 3D DyPLoT 메서드를 사용 하면 이러한 문제는 여러 가지 방법으로이 프로토콜 주소에서 설명합니다. 첫째, 여기 및 탐지 경로 간단 하 고 강력한 정렬을 만드는 다른 구현에 비해 크게 단순화 됩니다. 둘째, 움직이는 레이저 자리와 위치 추정 알고리즘 피드백을 더 안정 하 고 피드백 루프에 대 한 정확한 위치 견적을 제공 합니다. 셋째, 동적으로 움직이는 레이저의 효과적으로 큰 감지 범위 (4 µ m x 1 x 1) 빠르게 움직이는 입자의 추적에 대 한 수 있습니다. 되는지 왜이 큰 탐지 영역 중요 한, 그것은 압 전 nanopositioner의 기본 응답 시간을 고려 하는 것이 중요입니다. 고속 압 전 단계 1 kHz, 1 양 1 ms, 4 µ m2/s의 확산 계수와 100 nm 나노 순...

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    공개 사항

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

    감사의 글

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    이 작품에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학의 보너스 번호 R35GM124868에서 건강의 국가 학회 및 듀크 대학에 의해 지원 되었다.

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    재료

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    2D 전기 광학 디플렉터 ConOpticsM310A2 필요
    EOD용 전원 공급 장치ConOptics412FPGA 출력을 EOD TAG용 고전압으로 변환합니다
    . 렌즈TAG OpticsTAG 2.0축 방향
    XY 압전 나노 포지셔너MadCity LabsNano-PDQ275HS샘플을 이동시켜 입자를 목표 초점 볼륨에 고정하는 데 사용됩니다.
    Z 압전 나노포지토너MadCity LabsNano-OP65HS확산 입자를 따르기 위해 대물 렌즈를 이동하는 데 사용됩니다.
    MicropositionerMadCity LabsMicroDrive대물 렌즈 샘플을 거칠게 배치하고 평가하는 데 사용됩니다
    최고의 감도를 위해 필요한 높은 개구수는 대물 렌즈 Zeiss PlanApo입니다. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
    sCMOS 카메라PCOpco.edge 4.2입자의 위치를 모니터링하는 데 사용
    APDExcelitasSPCM-ARQH-15낮은 암흑 카운트 유익한
    필드 프로그래밍 가능 게이트 어레이National InstrumentsNI-7852r
    소프트웨어National InstrumentsLabVIEW
    Tracking excitation laserJDSUFCD488-30
    LensThorLabsAC254-150-A-MLL1
    렌즈ThorLabsAC254-200-A-MLL2
    핀홀ThorLabsP75S
    PH Glan-Thompson 편광판ThorLabsGTH5-AGT
    반파 플레이트ThorLabsWPH05M-488WP
    렌즈ThorLabsAC254-75-A-MLL3
    렌즈ThorLabsAC254-250-A-MLL4
    렌즈ThorLabsAC254-200-A-MLL5
    렌즈ThorLabsAC254-200-A-MLL6
    이색성 미러크로마ZT405/488/561/640rpcDC
    형광 방출 필터크로마D535/40mF
    10/90 빔스플리터크로마21012BS
    PBSSigmaD8537
    190nm 형광 나노 입자Bangs 실험실FC02F/9942
    110nm 형광 나노 입자Bangs 실험실FC02F/10617
    커버슬립Fisher Scientific12-545A
    파워미터ThorlabsPM100D
    CMOSThorlabsDCC1545M
    IrisThorlabsSM1D12D
    현미경Mad City LabsRM21
    는 .

    참고문헌

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
    2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
    3. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
    4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
    5. Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
    6. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
    7. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417(2008).
    8. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044(2011).
    9. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339(2009).
    10. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
    11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
    12. Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
    13. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
    14. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
    15. Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
    16. Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
    17. Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
    18. Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
    19. Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901(2006).
    20. Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
    21. Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
    22. Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
    23. McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
    24. McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
    25. McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
    26. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
    27. Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
    28. Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
    29. Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
    30. Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
    31. Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
    32. Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701(2012).
    33. Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
    34. Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
    35. Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606(2017).
    36. Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
    37. Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
    38. Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
    39. Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
    40. Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
    41. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).

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