근이 영양 증의 마우스 모델에서 Ambulation를 측정 하기 위한 간단 하 고 저렴 한 비용 분석 결과

요약

이 프로토콜 열 필드 활동 분석 결과에 마우스 ambulation를 측정 하기 위한 유연 하 고, 저렴 한 비용 시스템을 설명 합니다. 우리는이 시스템에 따라 6 분 ambulation 분석 결과 mdx 마우스에서 자발적인 운동 감소를 감지 하 고 정확 하 게 구별이 동물의 근육 특정 구조에 개선 보여.

초록

근이 영양 증의 치료에 기능 성과 측정 전 임상 시험의 필수적인 측면 이다. 마우스 모델에서 자발적으로 ambulation의 평가 직접 환자 ambulation 6 분 도보 시험 등의 측정 및 이동성 점수 관련 비-침략 적이 고 재현성 활동 분석 결과 이다. 마우스 ambulation 속도 거리를 테스트 하기 위한 많은 일반적인 메서드는 경기장 내에서 동물의 자유 운동 시간이 지남에 측정은 오픈 필드 테스트를 기반으로 합니다. 이 방법은 하나의 주요 단점은 그 상용 소프트웨어 이며, 고해상도 동작 추적에 대 한 장비 비싼 이며, 테스트를 위한 전문된 시설에 쥐를 전송 해야 할 수도 있습니다. 여기, 우리는 무료 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용 하 여 마우스 ambulation를 측정 하기 위한 저가, 비디오 기반 시스템을 설명 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 보여 줍니다 dystrophin null mdx 마우스 모델에는 자발적인 ambulation 듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD) 야생-타입 마우스 활동 상대적인 감소에 대 한. Mdx 에서 마우스 utrophin transgene 표현,이 활동 적자는 관찰 하지 하 고 주행 한 총 거리는 야생-타입 마우스에서 구별할 수 있습니다. 이 방법은 dystrophic 병 리와 관련 된 자발적인 ambulation에 변화를 측정 하기 위한 효과적 이며 다양 한 연구 설정에 쉽게 적응 될 수 있는 다양 한 플랫폼을 제공 합니다.

서론

근육 기능에 대 한 안정적이 고 재현 가능한 측정은 DMD에 대 한 잠재적인 치료의 효능을 평가 하기 위한 중요 합니다. DMD는 dystrophin 유전자에 돌연변이로 인 한 유전 장애 진보적인 근육의 약점, ambulation, 그리고 결국 심폐 실패의 손실에 지도. DMD의 가장 널리 사용 되는 동물 모델 dystrophin null mdx 마우스입니다. 기능 테스트의 배터리는 다른 dystrophies myopathies의 유사한 동물 모델 뿐만 아니라 mdx 마우스에서 질병의 진행을 평가 하기 위한 일상적인 분석으로 등장 했습니다. 일반적으로 사용 되 vivo에서 분석 forelimb 그립 강도, 시간, rotarod 최대, 시간 디딜 방 아 실행, 그리고 모터 활동 추적 도중 피로 매달려 철사의 측정을 포함 합니다. 쥐^1,2에서 테스트 하는 치료제의 변환 가능성을 증가 하 고 전 임상 연구 사이 가변성을 감소의 목표와 함께 이러한 테스트 표준화 분야에서 상당한 노력이 계속 있다.

전 임상 시험의 1 개의 중요 한 종류의 자발적인 운동, 근이 영양 증의 murine 모델에서 자주 변경 하는 매개 변수 측량 이다. 이 일반적으로 오픈 필드 활동 모니터링에 따라 분석 하 여 테스트 하 고 분 또는 시간^2,,34의 과정을 통해 가로 (걷고) 또는 수직 (양육) 움직임을 평가할 수 있습니다. 다양 한 연구 특히 운동 후 mdx 마우스에서 변경할 자발적인 운동 나타났습니다 그리고 약물 치료와 질병 진행에 민감한이 측정 표시 되었습니다. 이러한 분석을 수행에 한 가지 주요 한계 전문, 높은-비용 장비에 대 한 필요는. 여기, 마우스 ambulation 쉽게 사용할 수 있는 리소스를 사용 하 여 추적 하는 낮은-비용 메서드 제공 됩니다.

도보 6 분 거리 일반적으로 듀 켄 씨 근이 영양 증^5,6개인 임상 평가 도구를 사용 하는 통계입니다. 이 조치의 수정, mdx 마우스⁷ , 골든 리트리버 근 위축 증 (GRMD) 개⁸을 포함 하 여 듀 켄 씨의 동물 모델에서 결과 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 본이 연구에서는 우리 6 분 가벼운 운동 도전 직후에 자발적인 오픈 필드 운동을 기록 합니다. Ambulation 거리 다음 시간이 지남에 수평 움직임을 측정 하기 위해 무료 오픈 소스 소프트웨어를 사용 하 여 계산 됩니다.

이 방법의 주요 장점은 동물 분석을 위한 특수 장비 또는 높은 비용 상용 소프트웨어를 필요로 하기 없이 다양 한 설정 테스트할 수 있습니다. 이 분석의 한 중요 한 점은 그 그것은 수행할 수 있습니다 기본적인 실험실 설정에서 이동 하거나 마우스는 물고기의 전문된 핵심 시설 필요 없이. 여기서 설명 하는 비디오 추적 프로토콜은 상대적으로 짧은 시간 기간 동안 ambulation의 평가에 적합 및 야생-타입 및 mdx 쥐 사이 활동의 차이 감지할 뿐만 아니라 수 공개는 구조에서 기능 개선 DMD의 모델입니다.

프로토콜

여기에 설명 된 방법은 기관 동물 관리 및 사용 위원회, 로스 앤젤레스가 주 대학에 의해 승인 되었다. 야생-타입 (C57BL/6J) 및 mdx 마우스 (C57Bl/10ScSn 배경) 상업적인 소스에서 구매 되었다. mdx: utrophin-Tg 마우스 허가 케이 데이비스, 제임스 Ervasti에서 선물 했다 및 mdx 백그라운드에 유지 되었다. Ambulation 분석 실험은 6 개월 나이의 남성 쥐에 수행 했다. 마우스 기관 동물 관리에 의해 설립 지침 Terasaki 생명과학 물고기에 유지 및 사용 위원회는 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스 (승인 #2000-029-43)와 이러한 연구에 대 한 승인을 부여 했다는 Ucla의 동물 복지 보증 (승인 #A3196-01).

1입니다. 챔버의 준비

1. 조용 하 고, 온도 제어 룸 하루⁹의 일관 된 시간에 데이터 수집을 수행 합니다. 유전자 형을 테스트 중인 마우스의 치료는 눈을 멀게 하는 테스트를 수행 합니다.
2. 이 분석에 대 한 모든 열 필드 챔버 시스템 적응.
   참고:이 연구에서 우리 큰 쓰레기통에서 건설 저렴 하 고 쉽게 수송 할 수 있는 녹음 챔버를 사용 합니다. 오픈 필드 경기장 케이지 또는 유사한 상승 된 플랫폼에 대해 설정 하는 트레이입니다.
3. 전체 분야에 걸쳐 기록 하 상공 위에 철 망에 카메라를 배치 합니다.
4. 녹음 실 각 재판 전에 살 균 제를 청소.

2. 사전 운동 프로토콜 및 데이터 수집

1. 필요한 경우, 활동 기록, 직전 근육 활성화 프로토콜 각 마우스를 도전 한다.
   참고: 이것은 옵션 이지만 관련 된 mdx 쥐 실험에서 권장입니다.
   1. 디지털 포스 게이지의 풀 바 그립 하 고 부드럽게 당겨 다시 풀 바 해제 될 때까지 마우스를 허용 합니다. 5 번 재판 마다이 절차를 반복 합니다.
   2. 레코드 최대 각 재판에 대 한 긴장 (N).
      참고: ambulation 분석 결과 대 한 운동 도전으로 봉사 이외에이 그립 강도 분석 결과 중 동물에 의해 발휘 된 힘 추가 기능 결과 측정^2,10으로 사용할 수 있습니다.
   3. 각 시도 사이 나머지의 1 분 각 마우스에 대 한 총 5 개의 시험을 수행 합니다.
2. 그립 강도 분석 결과 또는 다른 운동 프로토콜 직후 활동 실에서 마우스를 놓습니다.
3. 상공 분야에서 마우스의 움직임의 비디오 녹화를 시작 합니다. 마우스 자유롭게 6 분에 대 한 탐구를 허용 한다.
4. 6 분 녹음을 중지 하 고 그것의 가정 케이지를 마우스를 반환 합니다.

3. 비디오 분석

1. 필요에 따라 프레임 속도 줄여 분석에 대 한 비디오를 준비 합니다. 분석 추적 프레임 속도 줄이기 위해 비디오 편집 소프트웨어 (예를 들어, iMovie 또는 유사 프로그램)에서 다음과 같은 프로토콜을 사용 하 여 2의 요인에 의해 비디오 프레임 속도 시키면서.
   참고: 비디오의 길이 프레임 속도 따라 그것은 유용할 수 있습니다 분석 이전 비디오 프레임 속도 줄이기 위해. 이 연구에서 비디오는 30 프레임/s (6 분 녹음, 약 10800 프레임 총)에서 기록 했다.
   1. 소프트웨어에는 비디오를 로드 합니다.
   2. '속도' 메뉴 선택 ' 속도: 빠른 ' 속도를 2 배 설정 및.
   3. .Mp4 파일 형식 분석을 추적 하기 위한 작 살된 비디오를 내보낼.
2. 소프트웨어 프로그램에서 분석에 대 한 비디오를 엽니다. 선 도구를 사용 하 여 녹화 하는 비디오에 대 한 보정을 설정 합니다. 챔버의 한쪽을 따라 선을 그립니다. 라인을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "보정 계수..." 선택 센티미터에 챔버 쪽의 실제 크기를 입력 합니다.
3. 마우스 위치의 반자동된 추적을 시작 하려면 '이동' 커서를 클릭 합니다.
   추적할 수; 포인트 비디오에 초기 프레임에서 starting, 마우스 오른쪽 단추로 클릭 추적 지점이 파란색 원으로 표시 됩니다.
   참고: 현재 연구에 각 동물의 위치는 꼬리의 기지를 추적 하 여 추적 했다.
4. 키보드에서 오른쪽 화살표를 클릭 하 여 프레임을 사전 추적 포인트는 꼬리 기지의 위치에 따라 자동으로 이동 한다.
   1. 추적 위치 특정된 프레임에 대 한 관심의 포인트와 정렬 되지, 하는 경우 수동으로 꼬리의 기지에 파란색 원을 맞춥니다.
      참고: 비디오의 품질 및 마우스의 속도 따라 추적 관심의 포인트와 정렬을 유지 하기 위해 사용자 입력 변수 수준을 요구할 수 있습니다. 마우스의 경로 비디오의 과정을 통해 전진 해야 한다.
5. 전체 비디오의 추적 완료 되 면 비디오 및 추적 오버레이 저장 합니다. "스프레드시트 내보내기"를 선택 하 여 추적의 위치 데이터를 내보냅니다.

4. 데이터 분석

1. 스프레드시트 소프트웨어 프로그램에서 위치 데이터를 엽니다. 움직임 분석 소프트웨어 X, Y 좌표 각 프레임에서 마우스의 위치를 보고 합니다.
2. 프레임으로 주행 거리를 계산 하려면 다음 수식을 사용 하 여 (한 프레임에 위치는 x₁, y₁ 과 프레임 2는 x₂, y₂):
   
   참고: 시간이 지남에 따라 누적 거리는 각 프레임 사이 주행 거리를 추가 하 여 계산할 수 있습니다.

결과

오픈 필드 분석 결과 근 위축 증의 모델에서 질병의 진행을 테스트 하는 효과적인 방법에 표시 되었습니다. 여기, 우리가 추적 방법을 쉽게 사용할 수 있는 녹음 장비 및 오픈 소스 소프트웨어 (그림 1A-B)를 사용 하 여 2 차원 마우스 움직임의 분석에 대 한 다양 한 비디오를 보여 줍니다. 결과와 일치 우리 야생-타입 마우스 (그림 1C 보다 6 분 오픈 필드 작업에 훨씬 적은 자발적인 움직임을 보여 테스트 직전 mdx 쥐 운동 프로토콜 도전을 보여 유사한 분석 실험에서 보고 , 그림 2). 일반적으로 그립 강도 도전, mdx 쥐의 가벼운 노력에 따라 분 4 ~ 5 (그림 3A

토론

오픈 필드 분석 결과 근육 질병 마우스 모델에서 모터 기능을 테스트 하는 효과적이 고 비-침략 적 방법 제공 하 고이 분석 결과 전 임상 연구에 대 한 귀중 한 끝점 측정값으로 사용할 수 있습니다. 이 이와 같은 분석 결과의 한 가지 주요 한계 활동 모니터링 시스템의 높은 비용 및 한정 된 접근 이다. 본이 연구에서는 기존 상용 소프트웨어 및 장비에 대 한 비슷한 결과 생성할 수 있는 오픈 필드 활동 분석에 대 한 낮은 비용 시스템을 설명 합니다. 이 시스템 vivaria 마우스는 보관 되어 내에서 사용할 수 있는 핵심 시설을 동물을 전송할 필요가 없습니다. 이 분석 결과의 다양성은 또한 다양 한 연구 및 교육 설정, 동물 생리학 및 행동에 초점을 맞춘 학부 실험실 과정을 포함 하 여 추적 하는 비디오를 사용 하 여 수 있습니다.

이 연구에서 우리는 야생 형 및 mdx 마우스 사이의 자발적인 움직임에 차이가 운동에 의해 쉽게 감지 다음 격화 수 발견. 이 강력한 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
비디오 카메라	Apple Inc.	ME553LL/A	보행 비디오 녹화용, iPhone 5S Plus(또는 동급)
Kinovea 소프트웨어(버전 0.8.15)	Kinovea Association		오픈 소스 비디오 분석 소프트웨어. 무료 다운로드, PC 호환(버전 0.8.15, www.kinovea.org)
iMovie(버전 10.0.6)	Apple Inc.		유사한 소프트웨어를 사용하여 비디오 프레임 속도를 줄일 수 있습니다(옵션)러
프넥 32갤런 블랙 라운드 쓰레기통(오픈 필드 챔버)	러버메이	드# 1778013	모든 오픈 필드 챔버 시스템을 녹화에 적용할 수 있습니다. 이 연구는 대형 쓰레기통 바닥에 있는 플랫폼의 트레이로 구성된 녹음 챔버를 사용합니다.
Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (오픈 필드 챔버)	US Acrylic, LLC		모든 오픈 필드 챔버 시스템은 녹음에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 연구는 대형 쓰레기통 바닥에 있는 플랫폼의 트레이로 구성된 녹음 챔버를 사용합니다.
C57BL / 6J	Jackson Laboratory	# 000664	수컷 6 개월 마우스
C57BL / 10ScSn-Dmd / J (mdx< / em>)	Jackson Laboratory	# 001801	수컷 6 개월 마우스
mdx : < / em> utrophin-Tg (fiona)	James Ervasti의 선물, Kay Davies		개월 마우스