방법 논문

운동 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

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DOI:

10.3791/56780

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2018년 2월 20일

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

이 논문에서

요약

설명된 세포 분석 결과 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 식별을 위해 설계 되었습니다-상호 작용 하거나 에이전트는 억제 자극, 경쟁적으로 또는 allosterically, 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 CXCR4 활성화에 의해 시작.

초록

그들은 많은 인간 질병에 관여 하 고 치료 적 개입에 대 한 잘 검증된 대상 포함 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs) 제약 산업에 매우 중요 있습니다. 특히 수용 체의 기능을 억제, 작은 합성 분자를 포함 한 리드 화합물의 발견 약물 개발에 중요 한 초기 단계 이며, 특정, 민감하고 강력한 세포 기반 분석에 의존. 여기, 우리 설명 운동 세포 분석 결과 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 갖는 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 활성화를 억제 하는 특정 수용 체 길 항 제를 식별 하는 데 주로 사용 하는 형광 판독 하 여 그 내 인 성 ligand, CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) 이 방법의 주요 장점은 있다는 것 이다 또한 부여 기본 agonistic 속성 (즉, 세포내 캘리포니아2 + 농도 부재에서 CXCL12의 증가 도출 하는 화합물) 또는 화합물 화합물의 심사 allosteric 바인딩 사이트와의 상호 작용을 통해 수용 체의 기능 변조 (즉, 포지티브 및 네거티브 allosteric 변조기 (PAMs 및 NAMs, 각각)). 아래쪽 측면에서 autofluorescent 화합물은 분석 결과 판독, 신뢰할 수 있는 데이터 해석 함으로써 방해를 방해할 수 있습니다. 대부분이 분석 결과 구현할 수 있습니다, 최소한의 적응으로 많은 다른 GPCRs의 활성화 리드 세포내 캘리포니아2 +의 출시에 대 한 일반적인 약물 발견 분석 결과로.

서론

GPCRs는 extracellular ligand 바인딩 시 신호 변환 폭포를 활성화 하는 세포 표면 단백질의 중요 한 superfamily. 그들은 다양 한 세포내 신호 통로 결국 생물학 응답1,2의 개시 귀착되는 자극 펩 티 드, 단백질 호르몬, 생물 아민, 지질 등의 큰 다양성에 의해 활성화 될 수 있다 . 또한, GPCRs 관련 된 많은 경우 모든, 발달 및 생리 적 프로세스와 많은 인간 질병 장애 GPCR 신호 또는 수용 체 overexpression와 연결. GPCRs는 그러므로 약1,3에서 가장 검증 된 약리 목표 사이.

일반적으로, GPCR 약물 발견 워크플로 셀룰러 심사 분석 활성화 작은 분자, 단일 클론 항 체, 등 특정 GPCR의 활동을 조절 수 있는 펩 티 드 화합물의 식별으로 시작 합니다. GPCR 신약 같은 화합물에 대 한 검색을 존재 하는 다양 한 유형의 분석 실험에 대부분의 중반-를 높은 처리량 검열 캠페인와 호환 됩니다. 가장 많이 사용 되는 분석 실험 포함 수용 체 바인딩 실험, 형광 또는 발광 기반 분석 실험의 소위 2 차 메신저 (예를 들어, 캘리포니아2 +, 순환 아데노신 monophosphate (AMP)), phenotypic 수준에서 변동 감지 심사 분석, 및 β-arrestin 모집4분석 실험. 분석 결과의 특정 유형에 대 한 선택, 여러 요인에 따라 달라질 수 있습니다 하지만 또한 사전 지식에 관한 특정된 GPCR의 신호 속성에 의해 결정 됩니다. 길 항 제는 GPCR에 바인딩 heterotrimeric G 단백질의 α 소 단위에 guanidine 3 인산 염 (GTP)에 대 한 guanidine diphosphate (GDP)의 교환 catalyzing 구조적 변화를 유도 합니다. 그 후 Gα-GTP 소 단위 Gβγ 소 단위에서 dissociates 고 두 소 단위 신호 통로 더 시작 됩니다. 가수분해 GTP 분자와 Gα의 후속 다시 협회의 GDP와 Gβγ 소 단위 복구할 것 이다 G 단백질 그것의 비활성 형태5,6. 따라 시퀀스 유사성 Gα 소 단위의 G 단백질의 종류 정의 (GsG나, Gq, G12/13)7. Gα 를 통해 신호 소 단위 (Gs)를 통해 상승 증가 등 여러 가지 일반적인 답변을 또는 준다 순환 앰프 생산 및 세포내 캘리포니아2 + (Gq)를 통해 동원 (G나)를 통해 감소5 ,7. Gβγ 소 단위 세포내 이펙터 경로 유도 할 수 있습니다. 예를 들어, G나의 활성화 시-결합 된 GPCRs, Gβγ 직접 phospholipase C (PLC-β) 이노 시 톨 3 인산 염 (IP3)를 생산 하는 세포내 상점7 캘리포니아2 + 의 릴리스 자극 수 . 수용 체 활성화, 다음 GPCRs GPCR kinases (GRKs) β-arrestins와의 상호 작용을 촉진 하 여 phosphorylated는. 이 프로세스는 G 단백질 신호 종료 하 고 수용 체 탈 감 작 및 결국 국제화. Β-arrestins 다른 신호 통로8를 신호 하는 G 단백질의 독립 실행할 수 있는 다중 분자 복합물을 형성 수 있습니다.

G나chemokine 수용 체 subfamily 내-결합된 CXCR4는 GPCR 약물 발견에 대 한 유망 대상으로 많은 관심을 제기 하고있다. 인간 면역 결핍 바이러스 1 (hiv-1)에 대 한 주요 공동 수용 체로 서의 설립된 역할 주어진 바이러스 항목 및 감염, 화합물 CXCR4를 대상으로 처음으로 개발 되었다 항 HIV 약물 후보9. 더 최근에, 증거의 성장 시체는 지적 했다 중요 한 역할을 CXCR4 위한 tumorigenesis 및 암 전이 뿐만 아니라 종양에 잘 검증 된 치료 대상 만들기에10. 20 개 이상 유형의 인간 암 및 컨트롤 종양 세포 생존, 확산, 그리고 마이그레이션 뿐만 아니라 종양 관련 신생10CXCR4 매우 표현 된다. 다른 화학 수업의 CXCR4 antagonists 설명된11,12, AMD3100 현재 림프 종의 치료 하는 동안 사용 되는 줄기 세포 동원 요원으로 병원에서 사용 하기 위해 승인 작은 분자에만 하지만 이전 되었습니다. 그리고 골 수 종 환자13,14. 임상 시험 진행 안전 및 여러 다른 CXCR4 길 항 근의 종양학12에 강한 초점 하지만 다른 인간 질병에 효능을 평가 하는. 주어진 CXCR4 길 항 제에 대 한 많은 잠재적인 응용 프로그램, 향상 된 pharmacokinetic 속성, 향상 된 생체 이용률, 또는 잠재적으로 적은 부작용 소설 화합물에 대 한 검색 보증 된다.

여기, 키네틱 형광 기반 셀룰러 분석 결과 주로 하는 데 사용 화합물 CXCR4 억제의 능력에 대 한 화면 설명. 이 방법의 형광 측정의 내 생 적인 주 작동 근, chemokine ligand (이전으로 알려진 stromal 세포 파생 요소 1α (CXCL12에 의해 CXCR4 활성화 시 갖는 세포내 캘리포니아2 + 농도의 일시적 증가에 따라 SDF1-α)), 그리고이 CXCL12 유도 캘리포니아2 + 응답 특정 화합물의 잠재적 저해. 이 분석 결과에서는 U87 인간의 세포종 세포 인간의 CXCR4 수용 체를 표현 안정적으로 사용 됩니다. 동시에 이러한 셀 CXCR7, 관련된 chemokine 수용 체는 또한 CXCL1215,,1617의 내 생 적인 표현 부족. CXCR7는 이전 또한 보였다 CXCR4와 heterodimers 형성 수18이 후자의 수용 체 신호 속성을 변조 함으로써. 세포내 캘리포니아2 + CXCR4 중재의 수준에 있는 동요는 CXCR4 로드 모니터링 fluo-2 acetoxymethyl (오전) 에스테 르, 셀 침투성 높은 선호도 형광 캘리포니아2 ++ 세포-염료를 바인딩. Fluo-2 오전은 490에서 흥분 수 단일 파장 형광 분자 nm의 방출 형광 520에서 측정 하는 동안 nm. 캘리포니아2 + 바인딩을 사이 Ca2 +넓은 동적 범위에 따라 증가 하는이 방출 형광-바운드 및 언바운드 상태. 형광 신호 증가, 몇 분의 시간 간격 내에서 발생 하는 과도 이며 이후에 붕괴 것입니다. 수용 체 활성화의 수준으로 형광 방출 더 상호의 피크 높이입니다. 자체 분석 결과 분석 결과에 pipetting 단계 표준화를 수 있는 통합된 pipetting 시스템을 보유 하 고 있는 강화 CCD (ICCD) 카메라를 갖춘 형광 microplate 리더를 사용 하 여 수행 됩니다 ( 재료의 표참조) . 또한, 형광 신호는 미 판의 모든 우물에서의 동시 측정에 사용 되는 형광 판독기의 또 다른 주요 장점은입니다. 첫 번째는 동안 조사 (예를 들어, 고정된 농도에 또는 희석 시리즈에 작은 분자의 패널) 화합물 fluo-2 오전에 추가 분석 결과의 부분 로드 CXCR4+ U87 셀 뒤에 ~ 10 분 잠복기 화합물의 잠재적인 agonistic 효과 지속적으로 실시간으로 측정 됩니다. 그런 다음에 생 길 항 제 (즉, CXCL12) 연상 CXCR4 중재 일시적인 증가 세포내 캘리포니아2 +의 수준에서 셀에 추가 됩니다. 분석 결과의이 부분 동안에 시험된 화합물의 잠재적인 대립 활동을 평가할 수 있습니다. 분석 결과 일반적인 워크플로의 도식 개요는 그림 1에 표시 됩니다.

이 Ca2 + 동원 분석 결과 경쟁 CXCR4 길 항 제 (즉, 생 주 작동 근 묶는 수용 체를 자극을 방지 하는 화합물)의 억제 효능을 결정을 위해 주로 사용 되는 있지만 그것은 또한 수용 체 주 작동 근을 식별할 수 있습니다 및, 더하여, 화합물을 바인딩 allosteric 사이트 (즉, 세 생 주 작동 근에 의해 점령 orthosteric 바인딩 사이트에서 다른 사이트)에 의해 그들의 기능을 발휘. 화합물의 후반 종류의 예로 allosteric 촉진제 및 PAMs 및 NAMs19,20있습니다. 특정 수용 체 길 항 근으로 NAMs CXCL12 유도 캘리포니아2 + 응답을 억제 것, 반면 PAMs이이 응답을 향상 시킬 것 이다 (또한 토론 을 참조 하십시오 섹션). 이 방법을 적용할 수 있는 최소한의 최적화 노력으로 다른 GPCRs에 적어도 예상 된다 분석 결과 특히 대상 CXCR4 여기서 설명, 비록 그들은 세포내 캘리포니아2 +의 출시를 통해 신호 하는 경우.

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프로토콜

참고: 섹션 1과 2에 설명 된 모든 단계는 층 류 캐비닛에 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.

1입니다. U87의 유지 보수입니다. CD4.hCXCR4 셀

  1. 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터 T75 문화 플라스 크에 세포 성장.
    참고: 체 외에서 세포 라인이이 프로토콜에 사용 되는 U87 세포종 세포 라인 안정적으로 차별화 4의 클러스터 (CD4)와 인간의 표현 CXCR4 앞에서 설명한17되었습니다. C d 4와 CXCR4 세포 표면 표현 cytometry에 의해 지속적으로 모니터링 및 식 수준 유지 시간이 지남에 따라 일정 (~ 100 %CD4+ 와 ~ 100 %CXCR4+ 세포). 수용 체 식 수준을 조사 흐름 cytometry 절차의 사용 된 셀 라인의 세대에 대 한 자세한 설명을이 프로토콜의 범위 내에서 않습니다.
    1. 80-85 %confluency 2 차 배양 세포입니다. 세포 배양 하기 전에 실내 온도 (RT)를 도달 하는 모든 시 약을 허용 합니다.
    2. 셀에서 바른된 문화 매체를 제거 하 고 씻어 5 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 한 번 셀 단층.
    3. 0.25 %trypsin-EDTA의 3 mL를 추가 하 고 셀 단층 위에 균등 하 게 배포. 트립 신-EDTA의 초과 제거 그리고 세포 분리를 시작 때까지 37 ° C에서 최대 5 분을 품 어.
    4. 신선한 완전 한 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) + 0.01 M HEPES + 적절 한 선택 대리인)의 10 mL를 추가 합니다. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 셀을 resuspend. 살 균 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
    5. 선택 방법을 사용 하 여 실행 가능한 세포의 수를 계산 합니다. U87 세포종 세포의 생존은 일반적으로 도달 ~ 100%.
      참고: 셀 숫자를 여러 가지 방법으로 확인할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 trypan 푸른 얼룩 ( 재료의 표참조)에 따라 자동된 세포 분석 시스템을 사용의 표준 처리 절차, 하지만 다른 매너 똑같이 잘 작동 합니다.
    6. T75 문화 플라스 크에서 25 mL 신선한 성장 매체의 최종 볼륨을 2 x 106 또는 3 x 106 (가능한) 셀을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
      참고: 3 x 106 셀 사용 됩니다 셀 2 일 후 80-90 %confluency 도달할 것 이다. 2 x 106 셀 사용 하는 경우 그들은 3 일 후 동일한 confluency를 도달할 것 이다. 세포의 성장 율 먼저 결정 되어야 합니다 실험적으로 다른 세포 선을 사용 하는 경우.

2. Ca2 + 동원 분석 결과 대 한 셀의 시드

  1. 뿌리고 (0 일), 코트 블랙 벽으로 폴리스 티 렌 96 잘 접시 클리어 셀의 날에 세포 부착을 촉진 하기 위하여 0.1% 젤라틴 솔루션 ( 재료의 표참조)을 하단.
    참고: 젤라틴으로 96 잘 접시의 코팅 미리 코팅된 접시, 상용 ( 재료의 표참조)를 사용 하는 경우 생략할 수 있습니다. 조사 프로토콜 계속 하기 전에 각 셀 라인에 대 한 수동 코팅 대신 미리 코팅된 접시의 사용을 평가 하는 것이 좋습니다.
    1. 100 ml PBS 1%의 솔루션을 얻기 위해 젤라틴 1g를 추가 하 여 젤라틴 솔루션을 준비 합니다. 더 사용 하기 전에 PBS로 10 배 희석. 젤라틴의 가용성을 높이기 위해 열 37 ° c 솔루션
    2. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시의 당 0.1% 젤라틴 용액의 100 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 2 h에 대 한 품 어
  2. 한편, 코팅된 96 잘 접시에 뿌리기 위해 셀을 준비 합니다.
    1. 문화 플라스 크에서 세포를 분리, 신선한 성장 매체에서 resuspend 그리고 그들을 계산 trypan 푸른 얼룩 메서드를 사용 하 여.
    2. 실시간에서 x 400g에 5 분 동안 50 mL 튜브에 셀 아래로 회전
    3. 신선한 성장 매체에 셀 resuspend (DMEM + 10 %FBS + 1 %HEPES, 아무 항생제) 106 (가능한) 셀/mL x 0.1의 셀 밀도 얻기 위해.
  3. 접시 위에 튀기 고는 조직에 그것을 건조 하 여 분명 바닥 블랙 벽 격판덮개에서 젤라틴 솔루션을 제거 합니다. 200 µ L/잘 초과 젤라틴을 제거 하 고 다시 접시를 뒤집어 PBS를 추가 합니다.
  4. 세포 현 탁 액 (0.2 x 105 셀에 해당)의 200 µ L 당 젤라틴 코팅 96 잘 접시에 잘 분배 (지금부터이 접시 하나 추가 참조 됩니다 "측정 플레이트"로).
  5. 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 접시를 품 어.

3. 로드는 형광 캘리포니아2 + 셀-중요 한 염료

  1. 1 일에 실제 캘리포니아2 + 동원 분석 결과, 로드는 형광 캘리포니아2 +시드 셀의 시작을 수행-바인딩 염색 fluo-2 오전.
    1. 200 mL 행 크의 균형 소금물 (HBSS, 10 배, 아니 페 놀 레드, 아무 나트륨 중 탄산염) 40 mL HEPES (1 M)를 추가 하 여 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 2 L의 최종 볼륨을 가져오고 추가 4 g 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 초순 물을 추가 합니다. 마그네틱 감동을 통해 BSA를 분해. (NaOH)과 7.4에 pH를 조정 하 고 필터링 솔루션.
      참고: 모든 다음 단계 동안 동일한 버퍼, "분석 결과 버퍼"로 사용 됩니다.
    2. 준비 재고 솔루션 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) (4 mM) 형광 캘리포니아2 +-구분 염색 fluo-2 오전. 과도 한 빛에 노출을 하지 마십시오. 분해 1 mg fluo-2 오전 (분자량: 1,061 g/mol) 235.6 µ L DMSO에.
    3. 오전 fluo-2의 작업 솔루션을 준비 합니다. 한 분석 결과 96 잘 접시 믹스 fluo-2 오전 재고 솔루션 (4mm)의 12.5 µ L 12.5 µ L 비 계면 활성 제 (예, pluronic f-127) 폴리올 솔루션 (20% 무게/볼륨 DMSO, 재료의 표참조). 15 mL 튜브에 11 mL 분석 결과 버퍼에이 혼합물의 22 µ L를 추가 합니다. 오전 fluo-2의 최종 농도 4 µ M.
      참고: 비 계면 활성 제 셀 로드 향상의 결과에서 그리고 fluo-2 오전의 수성 가용성을 개선 하기 위해 분산 대리인으로 사용 됩니다. Solubilize DMSO에 계면 활성 제, 37 ° C 및 혼합 균질 성 해결책을 얻기 위해 정기적으로 샘플을 열.
    4. 접시 위에 튀기 고 종이 수건에 건조 하 여 측정 96 잘 접시의 이전 시드 세포에서 성장 매체를 제거 합니다.
    5. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 잘 당 염료 솔루션을 로드의 100 µ L을 추가 하 고 어둠 속에서 RT에서 45 분 동안 품 어.

4. 준비 96 잘 폴 리 프로필 렌 플레이트 Chemokine Ligand CXCL12 또는 조사 화합물을 포함 하

  1. 둥근 바닥 폴 리 프로필 렌 (PP) 96 잘 접시를 ( 재료의 표참조)를 가져옵니다.
    1. CXCL12의 재고 솔루션을 허용 (1 mg/mL)와 실시간에 equilibrate를 조사 화합물의 재고 솔루션
      참고: CXCL12의 재고 솔루션 초순 0.01 %Tween20 보충 및 단일-사용 aliquots로-20 ° C에서 저장에 준비가 되어 있습니다.
    2. 분석 결과 버퍼에서 CXCL12의 집중된 솔루션 x 5를 준비 (250 ng/mL와 같은 31.25 nM) 및 5 (분석 결과 버퍼)에 각 화합물의 농도 희석 배.
    3. 접시를 미리 정의 된 레이아웃에 따라 적절 한 96 잘 접시에 재고 솔루션을 분배. 분배 75 µ L/잘에서 CXCL12를 포함 하는 접시 ("chemokine 접시"), 분배 50 µ L/잘에 화합물 ("복합 플레이트")를 포함 하는 접시.
      참고: 두 화합물 그리고 CXCL12 마침내 될 측정 판에 분배 시 5 배 희석. 그것은 또한 부정적인 제어 우물만 분석 결과 버퍼 chemokine 플레이트와 복합 플레이트 모두에 포함 된을 포함 하는 것이 중요. 또한 긍정적인 제어 웰 스 포함 되도록 해야 (즉, chemokine 접시에서 CXCL12 하지만 분석 결과 버퍼 복합 플레이트의 해당 우물에서 우물).

5. 프로토콜 설정을 형광 Microplate 리더

참고:이 프로토콜에 사용 되는 형광 microplate 리더가 불린다 재료의 테이블에.

  1. 먼저, 형광 플레이트 리더의 쿨러 단위에 전환 하 고 자체 형광 판독기에 전환 합니다. 몇 분 동안 시작 하 고 시스템의 소프트웨어를 오픈 하자.
  2. 다음 단계를 포함 하는 드래그 앤 드롭 메뉴를 사용 하 여 분석 결과 프로토콜을 만듭니다.
    1. "설정" 상자에서 'Read_Mode' 여기 파장 선택: 470-495 nM; 방출 파장: 515-575 nM.
      참고: 선택 된 파장은 Ca2 +와 함께 사용 하기에 적합-민감한 염료 fluo2.
    2. 자동 장치의 소스 2 위치 시킨 복합 플레이트에 화합물의 혼합에 대 한 "TF와 믹스" (전송 액체) 상자 포함 (단계 6.4 참조). 자동으로 발음 하 고 세 번 혼합 각 잘 솔루션의 15 µ L을 선택 합니다. 20 µ L 액체 표면 아래에 피 펫 팁의 높이 조정 합니다. 포부와 분배 50 µ L/s의 속도 설정 합니다.
      참고: 피 펫 팁의 높이 피 펫 팁 아래 왼쪽은 볼륨을 말합니다. 예를 들어, 복합 플레이트의 우물 포함 50 µ L, 높이 30 µ L의 액체 표면 아래 20 µ L에 해당 합니다. 믹스에 복합 솔루션, 혼합의 속도, 위치는 피 펫의 볼륨 팁, 중 고 믹싱 사이클 수가 모두 조정 될 수 있다 소프트웨어를 사용 하 여.
    3. "전송 액체" 상자에서 각각의 그 20 µ L 정의 복합 플레이트에서 잘 측정 판으로 옮겨질 것 이다. 20 µ L에서 피 펫 팁을 위치 액체 아래 즉, 화합물의 열망 중 높이 30 µ L, 높이 60 µ L 측정 판에 분배 하는 동안에 표면. 50 µ L/s에서 포부의 속도 25 µ L/s에서 분배의 속도 설정 합니다.
      참고: 복합 플레이트 포함 잘 당 솔루션의 50 µ L (단계 4.1.3 참조), 높이 30 µ L의 액체 표면 아래 위치 20 µ L에 해당 하는 따라서. 측정 판 잘 당 분석 결과 버퍼의 80 µ L를 포함 것 이다 (단계 6.3 참조), 60 µ L의 높이 팁의 비슷한 위치에 해당 하는 따라서.
    4. "TF와 읽기" 버튼을 선택 합니다. 첫 번째 기간 동안 60 읽기 (형광 측정) 1 s. 정의 10 읽기 전에 측정 판에 화합물의 분배 기록과 50 읽고 나중의 읽기 간격 시간을 선택 합니다. 정의 읽기 간격 시간이 30 초 간격 및 18 읽습니다.
      참고:이 단계 동안 형광 측정 됩니다 운동 (정의 된 시간 간격)에 대 한 ~ 총에서 10 분.
    5. 세 번 프로토콜에 "세척 팁" 버튼을 포함 합니다. 각 세척 단계 내에서 유체 종류 선택: 액체 (초순) 또는 액체 B (70% 에탄올), 세척 주기 (1), 펌프의 수 속도 (빠른), 그리고 스트로크 (5) 각 중 수 세척 단계.
      참고: 첫 번째 중 마지막 세척 단계 액체 A 사용 된다, B는 두 번째 세척 단계 액체 동안.
    6. "일시 중지 Pipettor" 기능을 포함 합니다. 300에 대 한 일시 중지 pipettor 설정 s.
      참고: 프로토콜에서이 단계를 포함 하 여 형광 판 리더 장치에 통합 되어, pipettor 머리 일시 중지 5 분에 대 한 프로토콜을 계속 하기 전에.
    7. 장치의 소스 3 위치에 위치 하는 chemokine 접시에서 CXCL12 솔루션의 자동 혼합 수 있도록 "믹스와 TF" 상자 포함 (단계 6.4 참조). 자동으로 발음 하 고 세 번 혼합 각 잘 솔루션의 15 µ L을 선택 합니다. 포부와 혼합, 동안 액체 표면 아래 피 펫 팁 20 µ L를 배치 합니다. 포부와 분배의 속도 50 µ L/s 설정 됩니다.
      참고: 비슷한 단계 5.2.2에 관해서는, 이러한 매개 변수를 조정할 수 있습니다.
    8. 이후 "전송 액체" 상자에서 각 25 µ L 그 정의 chemokine의 격판덮개 측정 판에 전송 됩니다. 위치 팁 20 µ L 액체 아래 즉, 높이 55 µ L 75 µ L/잘 포함 된 chemokine 접시에서 열망 하는 동안에 표면 (단계 4.1.3 참조), 그리고 높이 80 µ L 측정 판에 분배 하는 동안에. 50 µ L/s에서 포부의 속도 25 µ L/s에서 분배의 속도 설정 합니다.
    9. "TF와 읽기" 버튼을 포함 합니다. 첫 번째 기간 동안 145 읽기 1 s. 정의 5 읽기 CXCL12 측정 판에 분배 하기 전에 기록 되 고 140 읽고 나중의 읽기 간격 시간을 선택 합니다. 6 s와 선택의 읽기 간격 시간으로 두 번째 간격 정의 20 읽기.
      참고: 합쳐 전체 프로토콜에 걸쳐 243 읽기 (형광 측정) 기록: 78 단계 5.2.4 165 5.2.9 단계에서.
    10. 5.2.5 단계, 프로토콜에 "세척 팁" 버튼 3 회를 포함 비슷합니다.
      참고:이 단계는 프로토콜의 끝에를 포함 하 여 팁 다시 팁을 변경 하지 않고도 다른 분석 결과 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다 수 있습니다.
  3. "단계 온도 설정" 버튼을 클릭 하 고 37 ° c.를 선택 하 여 37 ° C에서 소자의 온도 설정

6. 실행 형광 분석 결과

  1. 측정 후 접시는 인 큐베이 팅 45 분에 대 한 버퍼를 로드 (단계 3.1.5 참조), 접시를 뒤집어 여 버퍼를 제거 하 고 조직에 그것을 건조.
  2. 분석 결과 버퍼의 150 µ L/잘 추가 하 여 시드 셀을 세척 하 고 2 분 동안 품 어.
  3. 접시를 뒤집어 여 버퍼를 다시 제거 합니다. 멀티 채널 피 펫과 분석 결과 버퍼의 80 µ L/잘 추가 합니다.
  4. 그들의 적절 한 위치에 있는 장치에 모든 접시를 넣어: 소스 2 위치에서 복합 플레이트, 소스 3 위치에서 chemokine 플레이트 및 읽기 위치에서 측정 플레이트. 소스 1 팁 위치에 검은 팁의 상자를 넣어. 소자의 문을 종료 하 고 프로토콜을 계속 하기 전에 5 분 동안 품 어.
  5. 접시 위에 배경 상대 빛 단위 (RLUs) 및 형광 분산 결정 하 "프로토콜 신호 테스트" 버튼을 선택 합니다. 새 창이 팝업 됩니다. "신호 테스트"를 선택 합니다.
    참고:이 단계 동안 배경 RLUs ICCD 카메라 형광 판독기 장치의 광학 구획에 통합에 의해 결정 됩니다. 이러한 RLUs의 Ca2 +여기에서 유래-민감한 염료 (fluo-2) 발광 다이오드 (Led)에 의해 (LED 출력 파장 470-495 nm). 8000-10000 RLUs의 값은이 응용 프로그램에 적합. RLUs 수 있습니다, 필요한 경우 수 적응 여기 강도 (가감 강도 선택), 또는 카메라 게이트 (선택 게이트 오픈) 변경 하 여. 접시 위에 분산 적으로 7.5% 미만 해야 합니다.
  6. 8000-10000 RLUs의 배경 값 가져온 경우 "업데이트"를 선택 합니다. 저장 단추를 클릭 하 여 주요 프로토콜을 저장 합니다.
    참고: 이렇게, 프로토콜 신호 테스트에서 설정은 진행 됩니다 주요 프로토콜.
  7. "실행" 버튼을 누르면 분석 결과 실행 합니다.

7. 데이터 분석 및 품질

  1. 분석 결과 완료 된 후 시스템의 소프트웨어에서 "분석" 상자를 엽니다.
    1. "구성 수정"과 "베이스 라인에 응답"을 선택로 이동 합니다. 정의 1과 끝 측정 5;에 측정에서 시작 베이스 라인 1 말은 형광 측정 1와 5 사이 각 잘 계산 됩니다.
      참고: 모든 추가 측정 특정에서 잘이 잘 전용 베이스 라인 1에 의해 분할 된다.
      1. 베이스 라인 2 측정 83까지 측정 78에서 시작 하려면 정의 (CXCL12 측정 83 후 적절 하 게, 다시 평균 형광 계산 각 사이 잘 측정 78 83 고이 수정 계수는 다음 모든 측정에 적용 됩니다 측정 83)입니다.
    2. 체크 상자를 활성화 "백분율로 표시" 및 "배경 빼기".
    3. "구성 운동 감소"로 이동 합니다. CXCL12 유도 캘리포니아2 + 응답에 화합물의 억제 효과 평가 하려면 최대-최소 243 (즉, 최종 측정) 측정 84 (즉, 첫 번째 측정 후 CXCL12은 적절 하 게)에서 시작을 선택 합니다.
      참고: 최대-최소 84 측정과 측정 사이의 기준선에 최소 및 최대 응답의 차이 선택 하 여 243 보고 됩니다. 측정 11 및 측정 78 사이 시작 최대-최소 선택 기준 1 기준으로 기준선에 최소 및 최대 응답의 차이 보고 됩니다. 이 값을 사용할 수 있습니다 화합물의 잠재적인 agonistic 활동 분석, 토론을 참조).
    4. 데이터는 시스템의 소프트웨어 구상 될 것입니다. 필요한 경우 추가 분석 및 시각화 다른 일반적인 분석 소프트웨어 패키지에서에 대 한 원시 데이터를 내보냅니다.

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결과

U87 세포내 캘리포니아2 + 동원에서 CXCL12 자극의 효과. CD4.CXCR4+ 와 U87입니다. CD4 세포 Ca2 + 동원 분석 결과와 평가 했다. 분석 결과 버퍼에 추가 되었습니다 (그림 1) 프로토콜의 첫 번째 pipetting 단계 동안 추가 됩니다 일반적으로 시험 화합물의 20 µ L, 대신 fluo-2 오전 로드 U87. CD4.CXCR4+ 측정 판에 셀. 단계에서 두 번째 분배, CXCL12의 다양 한 농도 (0.2-102.4 nM, 최종 농도) 측정 판에 적절 했다. 형광, 캘리포니아2 +의 방출의 복용량 의존 증가 복용량 의존 증가 보여주었다 (그림 2A). 여기, 부정적인 컨트롤 샘플 두 추가에 있는 분석 결과 버퍼만 측정 플레이트에 추가 되었...

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토론

캘리포니아2 +-동원 분석 결과 여기에 설명 된 이전을 식별 하 고 특성 수용 체 길 항 근 CXCR417를 대상으로 하는 유용한 도구가 될 표시 되었습니다. 그러나 그것은,,이 방법을 적용할 수 있는 일반적으로 그들의 활성화 시 cytosolic 캘리포니아2 + 릴리스를 실행 하는 다른 GPCRs의 큰 그룹에 CCR5 관련된 chemokine 수용 체에 대 한 볼 수 있듯이 예상. 반면 CCR5 경우 정확 하 게 같은 실험 조건 적용 될 수 있었다, 프로토콜 (예:도금에 휴대폰 번호, 형광 염료와 셀의 로드)의 여러 단계 필요가 있을 것 이다 다시 최적화를 분석 결과 전송 하기 전에 다른 GPCRs 유리한 신호 대 잡음 비율을 얻기 위하여. 여기에 중요 한 문제는 적당 한 체 외에서 세포 호스트의 관심 및 Ca2 + 통로 기능 결합 GPCR의 높은 수준의 표현을 허용 선택 이기도 합니다. CXC...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자 에릭 Fonteyn과 Geert Schoofs 우수한 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 이 일 구 루벤에 의해 지원 되었습니다 (no를 부여 합니다. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, no를 부여. G.485.08), 그리고 Fondation Dormeur 파두츠.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Fluo-2 AMAbcamab142775형광 Ca2+ 민감 염료
Pluronic F-127SigmaP2443-250Gpluronic acid
젤라틴SigmaG9391
AMD3100SigmaA5602-5 mg특정 CXCR4 길항제
Maraviroc종류 AnorMed항레트로바이러스 약물, CCR5 길항제
케모카인 리간드 CXCL12PeproTech300-28A
케모카인 리간드 CCL5PeproTech300-06
소 태아 혈청(FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
소 혈청 알부민(BSA)SigmaA1933-25G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Gibco (Life Technologies)41965-039
HBSS (10 x), 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드없음 Gibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1 M)Gibco (Life Technologies)15630-056
트립신-EDTA (0,25 %), 페놀 레드Gibco (Life Technologies)25200-056
Dulbecco의 인산완충 식염수 (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Falcon tubes, 50 mLGreiner Bio-One227 261
조직 배양 플라스크(T75)Corning353024
검은색 플레이트, 96-well, 투명 바닥, 뚜껑 포함Costar/Fisher Scientific10530753분석 플레이트(96-well), 세포 파종용
폴리프로필렌(PP) 플레이트Thermo Scientific(VWR)732-2661플레이트는 복합 플레이트 및 케모카인을 준비하는 데 사용됩니다. 플레이트, 둥근 바닥
FLIPR Tetra 고 처리량 세포 스크리닝 시스템분자 장치통합 피펫터 헤드 및 ICCD 카메라가 있는 형광 플레이트 리더
FLIPR Tetra LED 모듈 470 - 495 nm분자 장치0200-6128형광 Ca2+ 민감 염료 여기용 발광 다이오드
FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nm분자 장치0200-6203형광 염료
FLIPR Tetra 96 HeadMolecular Devices0310-453696웰 피펫터 헤드와 호환되는 방출 필터, 형광 플레이트 리더에 통합
Tetra Vi-CELLBeckman Coulter세포 생존도 분석기
Corning CellBIND 96웰 플랫 투명 바닥 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트, 뚜껑 포함, 멸균Corning3340사전 코팅된 96웰 분석 플레이트는 분석 플레이트의 수동 코팅을 위한 대안이 될 수 있습니다.
FLIPR 의 데이터 분석 및 시각화에 사용되는 ScreenWorks Molecular Devices 소프트웨어 패키지

참고문헌

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