소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

요약

여기, 선물이 murine NK 세포 유전자 침묵 시키기 기계 연구 생체 외 및 생체 내에서피더 무료 차별화 시스템을 사용 하 여 대량 생산 하는 프로토콜.

초록

자연적인 살인자 (NK) 세포는 타고 난 면역 계통에 속해 있으며 첫 번째 라인 항 암 면역 방어; 그러나, 그들은 종양 microenvironment에서 억제 되 고 기본 메커니즘은 아직 크게 알려진. NK 세포의 일관 되 고 신뢰할 수 있는 소스의 부족 NK 세포 면역의 연구 진행을 제한합니다. 여기, 우리가 시험관에서 시스템 높은 품질과 급지대 무료 조건 murine NK 세포 골 수 유래의 수량을 제공할 수 있는 보고 합니다. 더 중요 한 것은, 우리는 또한 그 중재 하는 siRNA 유전자 침묵이 시스템을 사용 하 여 E4bp4 종속 NK 세포 성숙 억제 성공적으로 보여 줍니다. 따라서,이 소설 체 외에서 NK 세포 분화 시스템 면역 연구를 위한 소재 솔루션입니다.

서론

암 진행은 종양 microenvironment^1,2, 호스트에서 파생 된 immunocytes, 예를 들면, NK 세포에 크게 의존 합니다. 여러 학문의 intratumoral NK 세포는 종양 진행^3,4부정적인 상관 관계를 설명 했다. 또한, 임상 연구 보여주었다 NK 세포 입양 치료 암^5,6,7,,89에 대 한 가능한 전략 이다. NK 세포 기반 암 immunotherapy 최근 단단한 종양을 위한 치료 선택권으로 제안 되었다 하지만 면역 억제 cytokines의 분 비와 고체 종양 ^{의 microenvironment에 ligands 활성화 downregulation 존재 하는 과제 10,11}. 변형 시키는 성장 인자-β (TGF-β) 발암에 진압 역할을 제안 하고있다 하지만 역설적으로 암 세포는 또한 TGF-β1 종양 개발^12,,1314 를 지원 하기 위해 생산 ^{, 15}. 인터페론 응답 다운 규제 및 CD16-중재 인터페론-감마 (IFN-γ) 생산 체 외에서^{16,17를 통해 NK 세포의 cytolytic 활동을 억제 수 있습니다 TGF-β 신호 18}.

TGF-β 신호 종양 microenvironment에의 중단 될 수 있지만 암 제거 가능한 방법, 완전히 TGF-β 신호를 차단 하면 항 염증 기능을 인해 자가 면역 질환의 개발에 의해 입증 부작용 등 조직의 염증, 심장 결함, 그리고 마우스에 면역¹⁹모델. 따라서, TGF-β-중재 면역 억제의 작동 메커니즘을 이해 이어질 것입니다 암 치료에 대 한 접근 치료 대상의 식별.

NK 세포 개발에 필요한 분자 이벤트 명료 하 윌리엄스 외 ²⁰세포 NK로 murine 골 수 조 혈 줄기 세포 분화에 대 한 생체 외에서 시스템 설립. 이 시스템은 크게 NK 세포²¹의 소설 창시자의 식별을 포함 하 여 NK 세포 개발의 기계 론 적인 연구를 촉진 한다. 그러나, 골 수 창시자로 피더 레이어^20,21, OP9 stromal 세포를 지 원하는 시스템에서 경작 한다 그리고이 다른 유형의 세포 인구는 주로 유전자 방해의 추가 응용 프로그램 제한 도구 (예를 들어, 중재 하는 siRNA 유전자 침묵) 차별화 NK 세포에 구체적으로 적용.

여기, 우리 더 윌리엄스 외²⁰의 생체 외에서 시스템을 수정 하 여 개발 된 피더 무료 시스템을 설명 합니다. 우리의 시스템에 OP9 stromal 피더 세포는 필요 하 고 대신 조건부 매체 최근 NK 세포에 생체 외에서그리고이의 차별화를 영향을 주지 않고 사용 OP9 TGF-β는 암 진행을 통해 홍보할 수 밝히기 위해서 우리를 끌 종양 microenvironment²²에 E4bp4 종속 NK 세포 개발 억제 이 새로운 시스템 성공적으로 elucidating 특정 조건 하에서 NK 세포 개발의 분자 메커니즘에 대 한 배경 없는 메서드를 제공 합니다 (예를 들어, 높은 TGF-β1, 중재 하는 siRNA 유전자 침묵, 등.) 생체 외에서.

프로토콜

프로토콜 및 골 수 유래 NK 분화 세포 (BM-NK)에 대 한 이전 게시 방법^20,,2122에 기반. 쥐와 모든 절차는 여는 동물 윤리 실험 위원회 (AEEC) 홍콩의 중국 대학에 승인 되었습니다.

1입니다. 준비 OP9 조건부 매체의

1. 알파-MEM 20 %FBS, 100 U/mL 페니실린 G 및 공기/CO₂ 의 습도 분위기에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 스 murine 기질 세포 라인 OP9 문화 (95%: 5%).
   1. Hemocytometer, 다음 씨앗 2 x 10⁶ OP9 각 75 cm² 문화 플라스 크에 세포의 중간의 15 mL와 함께 셀을 계산 합니다. 48 h에 대 한 문화입니다.
   2. 문화에는 80% 합류에 도달 하면, PBS의 10 mL로 플라스 크를 씻고 고 플라스 크 당 (FBS와 항생제) 없이 일반 알파 가상 매체의 20 mL를 추가 합니다.
2. 24 h 문화 플라스 크에서 OP9 조건 매체를 수집 하 고 0.25 µ m polyethersulfone (PES) 필터 셀 파편 청소 4 ° C (사용 2 주 이내)에서 보존.

2입니다. 마우스 골 수 세포의 고립

1. Pentobarbitone 과다 (100 mg/kg, 복 주사)와 함께 12 주 된 C57BL/6J 마우스 안락사 호흡의 부족에 의해 죽음을 확인 다음 뼈 사이 접속점에 수술 칼 커팅으로 대 퇴 골 뼈를 수확 하 고 부드러운 긁 적 하 여 블레이드와 나머지 근육을 제거 합니다.
2. 냉장된 멸 균 알파-MEM를 포함 하는 50 mL 원심 분리기 튜브에 뼈를 놓고 biosafety 내각에서 다음 단계를 수행 합니다.
3. 알파-MEM 매체를 삭제 하 고 30 대 70% 에탄올과 뼈를 씻어 s.
4. 두 번을 나머지 에탄올 차가운 살 균 PBS 가진 뼈를 씻어.
5. 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 mL를 포함 하는 박격포에서 뼈를 전송 하 고는 유 봉과 뼈를 부드럽게 fragmentize (할 하지 격파 그들).
6. 교 반 하십시오 뼈 부드럽게 골 수 세포는 PBS에 풀어 유 봉 소용돌이 의해. 새로운 50 mL 원심 분리기 튜브로 PBS 포함 하 골 수 세포를 수집 합니다.
7. 뼈 조각 단단한 흰색 색상에 될 때까지 4 번 2.6에 대 한 단계를 반복 합니다.
8. 465 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 관을 원심 다음 삭제는 상쾌한.
9. 18 mL의 멸 균 증류수와 펠 릿을 resuspend 하 고 그것은 30 서 적혈구를 제거 하는 s.
10. 얼음 처럼 차가운 10의 2 개 mL를 추가 X PBS는 반응 중지 하는 다음 lysed 적혈구를 제거 하려면 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 혼합물을 필터링.
11. 465 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 관을 원심 얼음 처럼 차가운 PBS의 20 mL와 펠 릿 resuspend
12. 2.11 단계를 두 번 반복 하 여 세포를 씻어.
13. 100 m m 멸 균 페 트리 접시에 단계의 1.2 OP9 조건부 매체의 10 mL와 20로 보충 셀 펠 릿을 전송 %FBS 0.5 ng/mL의 혼합물 murine 일리노이-7, 30 ng/mL 마우스 SCF와 100 U/mL murine flt3L.
14. 품 어 2 h. 전송에 대 한 5% CO₂ 와 37 ° C에서 접시 첨부 되지 않은 셀 5 x 10⁵ 가능한 셀/mL (trypan 블루 제외과 hemocytometer 여 수 세포)의 밀도에 새로운 문화 컨테이너로 단계 2.13 에서처럼 동일한 중간 수식 5% CO₂와 37 ° C에서 품 어와.
15. 하루에 4, 변경 OP9 조건부 매체 문화 상태 20 %FBS 및 2000 U/mL murine 일리노이-2의 보충.
16. 새로 문화 매체 매 3 일; NK 세포로 성숙 7 일 여 하 고 섹션 4에서 자격을 갖춘 수 있습니다.

3. NK 세포 분화의 유전자 Silencing siRNA 중재

1. 제품 설명서에 따라 transfection 에이전트와 siRNA 또는 넌센스 제어 (NC) 공기로
2. 0부터 시간 언제 든 지 3.1 단계를 수행 합니다.
3. 추가 50 nM siRNA 또는 단계 2.14에서에서 셀에 NC 혼합물의.
4. 실험 끝 지점까지 모든 중간 다과 (예를 들어, 0, 4, 및 7 일)에 3.1 단계를 반복 합니다.

4. NK 세포 분화 Cytometry 사용의 분석

1. 적절 한 시간에서 세포 분화의 정지를 수집 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS로 세척.
2. 제품 설명서에 따라 셀 고정 버퍼와 셀을 수정 합니다.
3. 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 고정된 셀을 세척 하 고 resuspend Flow Cytometry 얼룩 버퍼 포함 Cy3 활용 된 반대로 마우스 NKp46의 100 µ L에 1 x 10⁶ 셀과 1: 100 희석 비율에 반대로 마우스 CD244 항 체 PE 활용.
4. 샘플 2 h에 대 한 실 온에서 어둠 속에 얼룩.
5. Resuspend, PBS의 300 µ L로 얼룩진된 샘플 다음 FACS 데이터 및 Cytobank 플랫폼²⁰ (http://cytobank.org/)와 분석.

결과

대표 결과 설명된 프로토콜에 따라 얻을 수 있습니다. 총 골 현 탁 액 셀 피더 무료 차별화 시스템에서 11 일; 재배 했다 확산 속도에 상당한 증가 하루 7 일 0 (그림 1A)에 총 셀 개수와 비교 하 여 관찰 되었다. 높은 세포질에 핵 비율 및과 립 풍부한 세포질 형태학 NK 세포로 성숙 시스템 (그림 1B)에서 6 일에 의해 발견 됐다.

TGF-β1/Smad3 신호 NK 세포 분화, 세포 E4bp4 mRNA (siE4bp4, 그림 2와 같이 E4bp4 mRNA 레벨을 효과적으로 억제) 또는 말도 안 되는 siRNA와 페 했다 골 수에서에서...

토론

현재 작업에서 우리는 murine NK 세포 골 수 파생 에 시험관을 생산 하는 새로운 방법을 설명 했습니다. 원래 시스템^21,22 에 셀 피더 성공적으로 크게 차별화 시스템의 안정성을 증가 OP9 셀의 조건부 매체에 의해 대체 됩니다. 또한, 시스템 높은 수량을 생산할 수 있는 고 순도 성숙한 NK의 세포 생체 외에서 뿐 아니라 대 한 vivo에서 분석 실험, 인간 질병에 있는 NK 세포의 변환 연구 뿐만 아니라 기계 연구를 촉진할 수 있다.

설명된 방법 TGF-β1 NK 세포 억제 암 개발²³동안에 신호의 규제 역할을 조사를 위해 사용 되었습니다. 피더 세포에서 아무런 영향을 확인 하 고는, 억제제 중재 억제 뿐 아니라 중재 하는 siRNA 유전자 최저 효율 크게 개선 되었습니다. ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
OP9 세포주	ATCC	ATCC® CRL-2749™
MEM α, 뉴클레오시드 없음	Gibco	22561021
소 태아 혈청	Gibco	10500064
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
재조합 쥐 IL-7	PEPROTECH	217-17
재조합 쥐 SCF	PEPROTECH	250-03
재조합 쥐 Flt3-Ligand	PEPROTECH	250-31L
재조합 뮤린 IL-2	PEPROTECH	212-12
Lipofectamin RNAiMAX 트랜스펙션 시약	Invitrogen	1377815
IC 고정 버퍼	eBioscience	00-8222-49
플로우 사이토메트리 염색 완충액	eBioscience	00-4222-26
PE-conjugated anti-mouse CD244	eBioscience	12-2441-83
Cy3-conjugated anti-mouse NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Nonsense control (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA against mouse E4BP4 mRNA	Ribobio	N/A	5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& 프라임;