소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

요약

여기, 선물이 murine NK 세포 유전자 침묵 시키기 기계 연구 생체 외 및 생체 내에서피더 무료 차별화 시스템을 사용 하 여 대량 생산 하는 프로토콜.

초록

자연적인 살인자 (NK) 세포는 타고 난 면역 계통에 속해 있으며 첫 번째 라인 항 암 면역 방어; 그러나, 그들은 종양 microenvironment에서 억제 되 고 기본 메커니즘은 아직 크게 알려진. NK 세포의 일관 되 고 신뢰할 수 있는 소스의 부족 NK 세포 면역의 연구 진행을 제한합니다. 여기, 우리가 시험관에서 시스템 높은 품질과 급지대 무료 조건 murine NK 세포 골 수 유래의 수량을 제공할 수 있는 보고 합니다. 더 중요 한 것은, 우리는 또한 그 중재 하는 siRNA 유전자 침묵이 시스템을 사용 하 여 E4bp4 종속 NK 세포 성숙 억제 성공적으로 보여 줍니다. 따라서,이 소설 체 외에서 NK 세포 분화 시스템 면역 연구를 위한 소재 솔루션입니다.

서론

암 진행은 종양 microenvironment^1,2, 호스트에서 파생 된 immunocytes, 예를 들면, NK 세포에 크게 의존 합니다. 여러 학문의 intratumoral NK 세포는 종양 진행^3,4부정적인 상관 관계를 설명 했다. 또한, 임상 연구 보여주었다 NK 세포 입양 치료 암^5,6,7,,89에 대 한 가능한 전략 이다. NK 세포 기반 암 immunotherapy 최근 단단한 종양을 위한 치료 선택권으로 제안 되었다 하지만 면역 억제 cytokines의 분 비와 고체 종양 ^{의 microenvironment에 ligands 활성화 downregulation 존재 하는 과제 10,}

프로토콜

프로토콜 및 골 수 유래 NK 분화 세포 (BM-NK)에 대 한 이전 게시 방법^20,,2122에 기반. 쥐와 모든 절차는 여는 동물 윤리 실험 위원회 (AEEC) 홍콩의 중국 대학에 승인 되었습니다.

1입니다. 준비 OP9 조건부 매체의

1. 알파-MEM 20 %FBS, 100 U/mL 페니실린 G 및 공기/CO₂ 의 습도 분위기에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 스 murine 기질 세포 라인 OP9 문화 (95%: 5%).
   1. Hemocytometer, 다음 씨앗 2 x 10⁶ OP9 각 75 cm² 문화 플라스 크에 세포의 중간의 15 mL와 함께 셀을 계산 합니다. 48 h에 대 한 문화입니다.
   2. 문화에는 80% 합류에 도달 하면, PBS의 10 mL로 플라스 크를 씻고 고 플라스 크 당 (FBS와 항생제) 없이 일반 알파 가상 매체의 20 mL를 추가 합니다.
2. 24 h 문화 플라스 크에서 OP9 조건 매체를 수집 하 고 0.....

결과

대표 결과 설명된 프로토콜에 따라 얻을 수 있습니다. 총 골 현 탁 액 셀 피더 무료 차별화 시스템에서 11 일; 재배 했다 확산 속도에 상당한 증가 하루 7 일 0 (그림 1A)에 총 셀 개수와 비교 하 여 관찰 되었다. 높은 세포질에 핵 비율 및과 립 풍부한 세포질 형태학 NK 세포로 성숙 시스템 (그림 1B)에서 6 일에 의해 발견 됐다.

TGF-β1/Smad3 신호 NK 세포 분화, 세포 E4bp4 mRNA (siE4bp4, 그림 2와 같이 E4bp4 mRNA 레벨을 효과적으로 억제) 또는 말도 안 되는 siRNA와 페 했다 골 수에서에서.......

토론

현재 작업에서 우리는 murine NK 세포 골 수 파생 에 시험관을 생산 하는 새로운 방법을 설명 했습니다. 원래 시스템^21,22 에 셀 피더 성공적으로 크게 차별화 시스템의 안정성을 증가 OP9 셀의 조건부 매체에 의해 대체 됩니다. 또한, 시스템 높은 수량을 생산할 수 있는 고 순도 성숙한 NK의 세포 생체 외에서 뿐 아니라 대 한 vivo에서 분석 실험, 인간 질병에 있는 NK 세포의 변환 연구 뿐만 아니라 기계 연구를 촉진할 수 있다.

설명된 방법 TGF-β1 NK 세포 억제 암 개발²³동안에 신호의 규제 역할을 조사를 위해 사용 되었습니다. 피더 세포에서 아무런 영향을 확인 하 고는, 억제제 중재 억제 뿐 아니라 중재 하는 siRNA 유전자 최저 효율 크게 개선 되었습니다. .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
OP9 세포주	ATCC	ATCC® CRL-2749™
MEM α, 뉴클레오시드 없음	Gibco	22561021
소 태아 혈청	Gibco	10500064
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
재조합 쥐 IL-7	PEPROTECH	217-17
재조합 쥐 SCF	PEPROTECH	250-03
재조합 쥐 Flt3-Ligand	PEPROTECH	250-31L
재조합 뮤린 IL-2	PEPROTECH	212-12
Lipofectamin RNAiMAX 트랜스펙션 시약	Invitrogen	1377815
IC 고정 버퍼	eBioscience	00-8222-49
플로우 사이토메트리 염색 완충액	eBioscience	00-4222-26
PE-conjugated anti-mouse CD244	eBioscience	12-2441-83
Cy3-conjugated anti-mouse NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Nonsense control (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA against mouse E4BP4 mRNA	Ribobio	N/A	5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& 프라임;