여기, 우리는 프로토콜 3 색 smFRET 데이터 및 3D 앙상블 숨겨진 마르코프 모델의 분석을 제시. 이 방법을 과학자 들은 복잡 한 단백질 시스템, cooperativity 또는 서로 상호 작용을 포함 하 여에서 운동 정보를 추출할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
단일 분자 포스터 공명 에너지 전달 (smFRET)의 생체 역학을 공부 하는 널리 사용 되 생물 기술 되고있다. 대 한 세포 단백질에 많은 분자 기계는 그들의 작업을 수행 하기 위해 기능 주기에서 상호 작용 협동자와 함께 행동 해야 합니다. 확장 다 색을 두 색 smFRET 가능 하 게 동시에 하나 이상의 상호 작용 또는 구조적 변화를 조사. 이 뿐만 아니라 smFRET 실험에 새로운 차원을 추가 하지만 그것은 또한 직접 이벤트의 시퀀스를 공부 하 고 고정된 샘플 및 총 내부 반사 형광을 사용 하 여 서로 상호 작용을 검출 하는 독특한 가능성을 제공 현미경 (TIRFM)입니다. 따라서, 멀티 컬러 smFRET 이전 unachievable 자세히 바이오 단지 양적 방법으로 공부에 대 한 다양 한 도구입니다.
여기, 단백질에 멀티 컬러 smFRET 실험의 특별 한 도전을 극복 하는 방법을 보여 줍니다. 자세한 프로토콜 데이터를 얻기 위해 및 운동 정보를 추출 하기 위한 선물이. 이 추적 선택 기준, 상태 분리 및 3D 앙상블 숨겨진 마르코프 모델 (HMM)를 사용 하 여 시끄러운 데이터에서 상태 궤적의 복구 포함 됩니다. 다른 방법에 비해 운동 정보는 복구 되지 면만 시간 히스토그램에서 하지만 직접는 흠. 최대 가능성 프레임 워크 운동 모델을 비판적으로 평가 요금에 대 한 의미 있는 불확실성을 제공 하 고 있습니다.
열 충격 단백질 90 (Hsp90) 우리의 메서드를 적용 하 여 우리는 뉴클레오티드 바인딩 및 단백질의 글로벌 구조적 변화를 풀 수 있습니다. Hsp90 이합체의 2 개의 뉴클레오티드 바인딩 포켓 사이 cooperativity를 직접 관찰할 수 있습니다.
서론
많은 단백질 구조적 변화 및 광범위 한 계획1,2,3과도 연결 하 여 중재 하는 다른 분자와 동적 단지에서 그들의 기능을 충족 해야 합니다. 외부 에너지 원 (예를 들어, ATP) 이러한 동적 상호 작용 기능에서 방향으로 이어질 수 있고 궁극적으로 셀, 인생에 대 한 전제 조건에에서 비 평형 안정 상태를 유지 하는 결합.
완전히 이해 분자 기계, 구조 연구에 의해 유도 정적 설명 충분 하지 않습니다. 또한, 기본 운동 모델의 지식을 하 고 운동 속도 상수를 결정 하기 위해 필수적입니다. 여러 가지 기존 방법을 허용 관심, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명, 이완 메서드 (예: 점프 또는 중지 흐름 분 광 판독의 2 개의 분자 사이 상호 작용을 바이너리의 역학을 공부 하는 연구원 기술), 및 핵 자기 공명. 그러나, 그들의 적용은 대부분의 경우 간단한 2-상태 시스템 (예를 들어, 하나의 바운드와 언바운드 상태) 평균 하는 대량 실험에 제한. 경우 더 많은 상태 또는 중간체 관련, 그들은 속도 상수만 복잡 한 혼합물을....
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프로토콜
1. 설치 및 필수 구성 요소
- 프리즘 형 TIRFM에 멀티 컬러 smFRET 측정을 수행 합니다. 2 색상 설정의 설명 정돈 간행물 주어진 대로12참조.
- 멀티 컬러 TIRFM 생성 합니다. 일반 레이아웃은 9에 상세 하다.
- 사용 전환, 다이오드 여기 경로 있는 기계적인 셔터의 사용을 불필요 한 렌더링 솔리드 스테이트 연속파 레이저를 펌핑.
- 목표 입력을 후면에서 여기 광선의 후면 반사를 방지 하는 비대칭, 길쭉한 프리즘을 사용 합니다.
- 2 인치 색 비구 융합 된 실리 카 렌즈를 사용 하 여 최대한 많은 빛을 수집 하 고 자동 형광 및 착오, 예를 들어, 중앙 지역에는 이미지의 왜곡을 방지 하는 검색 경로 있는.
- 별도 렌즈를 가진 EMCCD의 칩에 초점을 각 검색 경로. 각 탐지 채널의 최적의 초점을 맞추고 있습니다.
주의: 클래스 3B 레이저는 TIRFM에 사용 됩니다. 즉, 그들은 위험한 경우는 눈에 직접 노출 확산 반사 유해 하지 않습니다. 시스템을 운영 하기 전에 지방 정부 규정에 따라 안전 조치 준수 레이저를 확인 합니다.
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결과
멀티 컬러 smFRET 측정 두 개 이상의 고유한 상호 작용 사이트 간의 상관 관계의 직접적인 탐지를 허용 한다. 이 기술은 다중 구성 요소 시스템, 단백질 복합물을 조사에 고유한 렌더링 합니다. 우리는 여기에, 설명 예 역할 3 색 smFRET 실험의 프레 젠 테이 션에 초점.
방법의 일반적인 워크플로 그림 1에 표시 됩니다. 첫 번째 부분에는 프리즘 형 TIRF 현미경에 다 색 smFRET 데이터의 기록 구성 되어 있습니다. 표면 부착 전략 및 설치의 회로도 그림 2A에서 묘사 된다. 설치의 자세한 설명에 대 한9참조를 참조 하십시오. 제시 방법의 두 번째 부분은 데이터 분석에 집중 한다. 모범적인 형광 강도 트.......
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토론
우리는 복잡 한 단백질 시스템 및이 측정 분석에 대 한 단계별 설명에 대 한 3 색 smFRET 데이터를 얻기 위해 실험 절차를 제시. 이 방법은 직접 여러 상호 작용이 사이트 또는 구조적 변화 간의 상관 관계를 평가 하기 위해 고유한 가능성을 제공 합니다.
단백질에 적합 한 멀티 컬러 단일 분자 데이터를 얻기 위해 그것은 저 잡음 수준에서 재현 가능한 측정을 수행 하는 것이 중요. 이 흐름 챔버9에 대 한 효율적이 고 신뢰할 수 있는 표면 패 시 베이 션 프로토콜을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 표면에 움직일 수 분자의 충분 한 조밀도 기록된 영화 당 분자의 수확량을 증가 시키기 위해 사용 되어야 한다. 즉, 형광 빛 단일 분자에서 기록 된 이미지에서 픽셀의 약 5-10%에가 해야 합니다. 동시에 오버 로드 방지 되어야 한다, 분자를 이웃의 한 중복 될 것이 있기 때문에. 레이블이 지정 된 종은 솔루션에서 무료 (앰프 PNP * 제시.......
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공개 사항
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 독일 연구 재단 (INST 39/969-1)와 ERC 부여 계약 n. 681891 통해 유럽 연구 위원회에 의해 자금을.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Setup | |||
| vibration-damped 광학 테이블 | 미국 캘리포니아주 어바인 뉴포트 | RS2000 | |
| OBIS 473nm LX 75mW LASER | Coherent Inc, 미국 캘리포니아주 산타클라라 | 1185052 | |
| OBIS 532nm LS 50mW LASER | Coherent Inc, 미국 캘리포니아주 산타클라라 | 1261779 | |
| OBIS 594nm LS 60mW LASER | Coherent Inc, 미국 캘리포니아주 산타클라라 | 1233470 | |
| OBIS 637nm LX 140mW LASER | Coherent Inc, 미국 캘리포니아주 산타클라라 | 1196625 | |
| 레이저 제어 장치 | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 1234465 | Scientific 원격 |
| 비구면 망원경 렌즈 | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | d = 25.4mm, f = 50mm 및 f = 100mm | |
| CF ex1 | AHF analysentechnik AG, T ü bingen, 독일 | ZET 473/10 | 정리 필터 여기 |
| CF ex2 | AHF analysentechnik AG, Tü bingen, 독일 | ZET 532/10 | 정리 필터 여기 |
| CF ex3 | AHF analysentechnik AG, Tü Bingen, Germany | ZET 594/10 | 클린업 필터 여기 |
| CF ex4 | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | FL635-10 | 클린업 필터 여기 |
| DM ex1 | AHF analysentechnik AG, Tü bingen, 독일 | ZQ594RDC | 이색성 거울 여기 |
| DM ex2 | AHF analysentechnik AG, Tü bingen, 독일 | 570DCXR | 이색성 거울 여기 |
| DM ex3 | AHF analysentechnik AG, Tü bingen, 독일 | ZQ491RDC | 이색성 거울 여기 |
| AOTFnC-Vis | AA Opto-Electronic, Orsay, France | ||
| λ/4 plate | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | AQWP05M-600 | |
| CFI Apo TIRF 100x | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | high-NA | |
| objective piezo focus positioner MIPOS 250 CAP | piezosystem jena GmbH, Jena, 독일 | 피에조 컨트롤러 NV 40/1 CLE | |
| 피에조 스테퍼 | 뉴포트, 어바인, 캘리포니아, 미국 | PZA12 | PZC200-KT NanoPZ 액추에이터 키트 |
| 무색 비구면 렌즈 | Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Gö ttingen, 독일 | G322-304-000 | d=50mm, f=200mm |
| 조정 가능한 광학 슬릿 | Owis GmbH, Staufen i. Br., 독일 | 27.160.1212 | 최대 조리개 12 x 12 mm |
| DM det1 | AHF analysentechnik AG, Tü bingen, 독일 | T 600 LPXR | 이색성 미러 감지 |
| DM det2 | AHF analysentechnik AG, Tü bingen, 독일 | H 560 LPXR 초평면 | 이색성 거울 감지 |
| DM det3 | AHF analysentechnik AG, Tü bingen, 독일 | HC BS R635 | 이색성 거울 감지 |
| BP det1 | AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Germany | 525/40 BrightLine HC | 대역통과 필터 감지 |
| BP det2 | AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Germany | 586/20 BrightLine HC | 대역통과 필터 감지 |
| BP det3 | AHF analysentechnik AG, Tü Bingen, Germany | 631/36 BrightLine HC | 대역통과 필터 감지 |
| BP det4 | AHF analysentechnik AG, Tü Bingen, Germany | 700/75 ET Bandpass | bandpass filter detection |
| optical shutters detection | Vincent Associates, Rochester, NY, USA | Uniblitz VS25S2T0 | |
| EMCCD iXon Ultra 897 | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | ||
| digital I/O card, PCIe-6535 | National Instruments, Austin, Texas, USA | ||
| 주사기 펌프 | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | PHD22/2000 | |
| Name< | strong>Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Flow chamber | |||
| quartz slides | G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA | Spectrosil2000, h=3mm | |
| TEGADERM film | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | 1626W | 10 x 12cm |
| 스프레이 접착제 | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | Photo Mount 050777 | |
| 글리세롤 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, 독일 | Immersol G | |
| 이멀젼 오일 | OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, 함부르크, 독일 | IMMOIL-F30CC | |
| 프리즘 | Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, 독일 | Suprasil1 | |
| 알루미늄 프리즘 홀더 | 맞춤형 | ||
| 중공 고정 나사 | Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA | 맞춤형 드릴링 | |
| Tygon S3 E-3603 튜빙 | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | 2-4450 | ACF00001 |
| PTFE 튜빙 | Bohlender GmbH, Grü nsfeld, 독일 | S1810-08 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Sample | |||
| yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin | UniProt ID P02829 | ||
| Atto488의 Maleimide 유도체, Atto550 | ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany | ||
| AMP-PNP* | Jena Bioscience, Jena, Germany | γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N | |
| Fluospheres | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | F8764 | 아민 변성, 0.2 μ m, 황록색 형광 |
| 등Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| >Software | |||
| Andor Solis | Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland | version 4.30 | |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, Texas, USA | 버전 2012, 32비트; 기타 하드웨어 제어 | |
| MDS 제어 소프트웨어 | AA Opto-Electronic, Orsay, France | 버전 2.03a | |
| Coherent Connection | Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA | 버전 3 | |
| Igor Pro | WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA | 버전 6.37 |
참고문헌
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Henzler-Wildman, K.,....
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재인쇄 및 허가
