트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

요약

여기 우리는 새로운 장비를 사용 하지 않고 키메라 생산을 증가 하는 프로토콜을 제시. 주입에 대 한 배아의 단순한 방향 변경 생산, 배아의 수를 증가 하 고 잠재적으로 생식 전송 타임을 줄일 수 있습니다.

초록

ES 셀 방법론을 통해 유전자 변형된 생쥐의 창조에 효율성을 증가 하는 노력에서 선물이 현재 blastocyst 주입 프로토콜을 적응. 여기 우리 보고 배아, 그리고 트랜스 안 세포 질량 (TICM)를 통해 주입의 간단한 회전 50%, 추가 장비에 31%에서 공상 쥐의 비율을 증가 또는 추가 훈련을 전문. 26 다른 근 친 클론, 그리고 9 개월의 기간 동안 35 총 클론 주입 했다. 전통적인 주입 기술 및 TICM 사이 임신 속도 또는 배아의 회복 속도에 상당한 차이가 있었습니다. 따라서 주입 프로세스와는 blastocyst의 간단한 위치는 ICM을 통해 주입에 모든 주요 변경 없이 blastocoel 구멍에 ES 세포 방출 잠재적으로 향상 시킬 수 있습니다 공상 생산 이후 수량 생식 전송입니다.

서론

거의 25 년 동안, 유전자 표적으로 쥐의 창조 자주 키메라를 전송 하는 생식의 세대를 위한 blastocysts ES 세포 microinjection 단계에서 병목 현상에 의해 방해, 느린 과정 되었습니다. CRISPR/Cas9^1,2 ES 세포 및 높은 처리량 ES에 타겟팅을 포함 한 최근 전진 호 같은 세대 컨소시엄 세포, 유전자 변형된 ES 세포의 생성/가용성 향상. 그러나, 생식 키메라의 생성이 ES 세포^3,4에서 유전자 변형된 쥐를 만들기에 병목을 남아 있다. 높은 처리량 ES 세포 생성 프로젝트 생식 키메라의 성공적인 창조에 대 한 중요 한 ES 세포 품질 높은 가변성에 의해 괴 롭 혀 왔다. 또한, 일반적으로 이용한 ES 세포 선의 일부 높은 이수성, 및 생식 유능한 키메라⁵의 어려운 생산 알려져 있다.

어느 높은 키메라와 쥐를 만들기 위한 많은 방법은 개발 되었다 또는 완전히 ES 세포 파생 마우스^6,

프로토콜

모든 작업은 마우스 코어의 NIEHS 노크 밖으로 인해 시설 정상 작동의 일환으로 수행 되었다. 모든 마우스는 12시 12분에 유지 했다 h 빛: 다크 사이클, NIH-31와 물 다이어트를 공급 했다 ad libitum. 모든 실험 동물 관리 및 사용 위원회는 국립 연구소의 환경 건강 과학의 수행 했다.

1. 동물 준비

1. 기증자 쥐, b 6 번 식 (Cg)-Tyr < c-2J > b 6 자연스럽 게 나이의 8-10 주에 /J 여성 쥐 (Cg)-Tyr < c-2J > /J 남성 쥐 나이의 8과 26 주 사이. 시각적으로 플러그 다음 아침 (E0.5)을 확인 합니다.
2. 받는 사람 마우스, 스위스 웹스터 여성 쥐 나이의 6 그리고 9 주 사이 자연스럽 게 vasectomized 스위스 웹스터 남성 쥐 사육 번 식. 시각적으로 플러그 다음 아침 (E0.5)을 확인 합니다.

2. ES 세포 준비

1. 129-derieved AB2.2 ES 세포에 대 한 문화 15 보충 DMEM 셀 %FBS, 1% 글루타민, 1% 펜/strep, 및 0.1% β-mercaptoethanol. 그들의 권장된 프로토콜을 사용 하 여 ES 셀 공급 업체의....

결과

임의 효과로 셀-선 치료, 혼합된 효과 선형 모델 소프트웨어 (예: SAS (버전 9.2))에서 데이터를 분석 하 사용 되었다. 각 분석 배아 전송 및 셀 라인의 수에 대 한 제어. 두 번째 분석 또한 살아남은 새끼의 수에 대 한 제어.

이 연구를 위해 각 ES 세포 선 및 복제 주입 했다 전통 둘 다 및 TICM 기법, 각 배아 후 두 가지 방법 사이의 교류. 사출, 후 배아 접시에 차별 하 고 송금 받는 여성 당 12의 그리고 15 태아 사이 일반적으로 그룹화 했다. 명확 하 게 보이는 blastocoel 하지 않은 배아 Zona pellucida, 부족 또는 microinjected ES 세포는 blastocoel를 입력 하는 데 실패 하는 곳에,이 실험에서 탈락 했다.

토론

그것은 오래는 ICM의 어떤 소란 이어질 수 사망, 사실, 현재 blastocyst microinjection 프로토콜 여전히이^12,13의 경고 생각 되었습니다. 그것은 우리가 여기에 표시는 ICM 통해 microinjection는 태아에 게 해로운 고 키메라의 수확량을 증가.

이 효과 대 한 정확한 메커니즘 확인 하지 했다. 그러나, ICM와 함께 hypoblast의 기계적 장애 ES 세포 통합 microinjection 다음 새로 형성된 된 ICM의 발생률을 증가 한다. Ipsc의 분야에서 최근 작품 기계적 자극 인간의 iPSC¹⁴의 프로그래밍에 도움이 나타났습니다. 기계 조작 마우스 배아의 ICM 비슷한 효과 있으면, 그것은 셀 ICM 만능 상태로 차별화 하는 잠재적으로 시작 했던 ' 시작 ' blastocyst 기증자의 잠재적.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ES 세포 주사 바늘	Humagen	MSC-20-0
NSET 장치	Paratechs	60010
DMEM	Gibco (life technologies)	11965-092
FBS	Gibco (life technologies)	10439-024	로트는 ES Cell 호환성을 위해 개별적으로 테스트해야 합니다.
HEPES	Sigma	H0887
β-메르캅토에탄올	Sigma	M7522
마이크로 매니퓰레이터	Leica	마이크로 매니퓰레이터
마이크로 인젝터	Eppendorf AG	Cell Tram Air 5176
현미경	Leica	DM IRB
4 웰 디쉬	Thermo Scientific	176740
60mm 접시	Sarstedt	83.3901
B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J	Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA	000058
스위스 웹스터 마우스	Taconic, 미국	Tac:SW
주입 접시	MatTek Corp.	P50G-0-30-F