방법 논문

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

DOI:

10.3791/56972

⸱

2018년 4월 5일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genomic Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2The Jackson Laboratory for Genomic Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

초록

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히스톤 수정은 epigenome의 주요 구성 요소를 구성 하며 중요 한 역할을 규제 관련된 loci의 transcriptional 상태를 결정 합니다. 또한, 특정 수정의 존재 위치와 강화 등 비 코딩 기능 요소 정체성을 결정 하 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, chromatin immunoprecipitation 다음 세대 시퀀싱 (칩 seq) 다음 개별 히스톤 수정의 게놈 넓은 프로필 결정에 강력한 도구가 되고있다. 그러나, 그것은 점점 더 분명 chromatin 수정, Chromatin 상태 라고의 조합 패턴 정체성과 관련 된 genomic 소재 시의 결정 되고있다. 따라서, 다양 한 전산 분석 파이프라인 수 뿐만 아니라 히스톤 수정 표시를 프로 파일링에 대 한 강력한 높은 처리량 (HT) 방법론의 구성 된 워크플로 처리 칩 Seq의 무수의 프로 파일링 데이터 집합에 필요한 샘플의 많은 수에 있는 epigenomic 국가의 포괄적인 결정. 여기는 HT 칩 Seq 워크플로 두 개의 모듈로 구성: 1) 적은 양의 종양 샘플 및 96-잘 형식; 셀 라인에서 여러 히스톤 수정 프로 파일링 실험 프로토콜 그리고 2) 개별 마크 인 및 조합 chromatin 상태 패턴을 계산 하는 기존 도구를 결합 하 여 전산 데이터 분석 파이프라인. 함께,이 두 가지 모듈 쉽게 처리 칩 Seq 샘플의 수백의 신속 하 고 효율적인 방식으로 촉진 한다. 여기에 제시 된 워크플로 chromatin 상태 패턴 흑색 종 종양 세포에서 6 히스톤 마크 프로필에서 파생 하는 데 사용 됩니다. 전반적으로, 우리는 인간의 종양 샘플 및 다양 한 악성 종양에 epigenomic 착오를 결정 하기 위해 암 세포 라인에 적용할 수 있는 포괄적인 칩 seq 워크플로 제시.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포유류 게놈 (98-99%)의 대다수는 noncoding 시퀀스, 구성 그리고 알려진 유전자 발현 및 염색 질 조직1,2에 참여 하는 규제 요소를 포함 하는이 nocoding 지역. 정상 세포에서 게놈 DNA의 특정 어셈블리 압축된 chromatin 구조에이 공간 조직, 규정 및 다양 한 DNA 관련 된 프로세스3,,45의 정확한 타이밍에 대 한 중요 합니다. 그러나 암 세포에, chromatin 수정 후 성적인 탈 선 메커니즘에 의해 chromatin 구조, 규제 요소, 염색체 루핑 시스템 및 유전자 표현 패턴6에 대 한 액세스를 포함 하 여 부적절 한 조직에 발생할 수 있습니다. 7,8,,910.

최근 발전에도 불구 하 고 우리 후 변경 관련 된 종양의 진행 이나 치료 응답의 이해를 제한 했다. epigenome 수정, 히스톤 부호, DNA 메 틸 화, 총칭 impinges 유전자 식 네트워크와 유지에 대 한 중요 한 다른 프로세스는 동적 상태 (chromatin 상태 라고 함)를 형성 등의 구성 세포 id입니다. 최근, 강화 변경 H3K27Ac 프로필11공부 하 여 여러 악성 종양에 표시 되었습니다. 100 개 이상의 후 성적인 수정 확인 된12,13 그들의 생물 학적 역할의 명확한 이해 없이 되었습니다 이러한 연구 격리 후 성적인 부호의 상관 관계에 대 한 통찰력을 제공, 그리고 상호 의존입니다. 또한, 이러한 히스톤과 DNA 수정 가능한 조합 패턴의 더 큰 수가 있다 며 이러한 조합 패턴-개별 수정-epigenetic 국가14를 지정 하는. 따라서, 암 진행 이나 치료. 에 대 한 응답 하는 동안 이러한 chromatin 상태 변경 식별 엄청난 필요는 암에 epigenome 변경의 포괄적인 지식 기술 (예: 작은 양의 임상 자료/단일 셀에서 대규모 데이터의 발생)으로 인해 일부 후행 되었습니다 있다 및 분석 (예: 알고리즘을 정의 조합 국가) 도전. 따라서, 필요도 중요 한 임상 자료와 구현 하기 쉬운 전산 접근에서 히스톤 수정 표시의 많은 수를 프로 파일링에 대해 강력한 높은 처리량 방법 촉진 한다 조합 패턴 예측 epigenetic 상태 tumorigenesis 및 치료 저항의 다른 단계와 관련 된 결정. 최근 epigenome 프로 파일링 연구15,,1617,18,19,20,21에서 사용할 수 있는 추가, 데이터 정상 조직 및 세포에서 22,23 chromatin 프로필에 대 한 추가 epigenome 기여 종양 생물학에 종양의 통합 될 수 있다.

Chromatin 프로 파일링 다양 한 chromatin 수정15,24의 글로벌 바인딩 패턴을 식별 하기 위한 강력한 도구가 되고있다. 최근 몇 년 동안에 칩 seq 세계적인 규모25,,2627에 DNA 단백질 상호 작용 연구 "금 표준" 되고있다. 어떤 칩 seq 실험에 대 한 단계가 중요 한 성공, 조직 처리 및 연관 해제를 포함 하 여, 최적의 쥡니다 조건, 강 수, 도서관 준비에 대 한 최적의 항 체 농도 determing determing에 필요한 -시퀀싱 데이터 처리 및 다운스트림 분석입니다. 각이 단계 주요 품질 관리 검사점을 포함 하 고 함께 찍은 때 제대로 기능 유효성 검사에 대 한 잠재적인 대상을 식별 하는 데 중요 한 있다. 이 단계에서 혁신을 통해 여러 이전 연구에서 적은 양의 조직28,,2930,31,32 칩 또는 칩 Seq를 수행 하는 방법론 개발 . 또한, 일부 연구는 높은 처리량 칩 실험 뒤에 PCR 프로토콜 기반 정량33,34건의 했다. 마지막으로, 일부 공개적으로 사용 가능한 분석 플랫폼 칩 Seq 데이터에 대 한 Easeq35 등 은36사용할 수 지금 있습니다. 그러나, 하나의 마크 chromatin 상태 분석 수행을 계산 파이프라인 함께 높은 처리량 패션에 칩 Seq를 수행 하기 위한 통합된 플랫폼 부족 되었습니다.

이 프로토콜 설명 종양 조직에 셀 라인, chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 칩 seq 워크플로 쉽게 성공적인 실험에 필요한 단계를 모두 포괄 하는 지침에 따라. 이전 Blecher 고 넨 외. 에 의해 설명 하는 높은 처리량 방법을 채택 하 여 37이 프로토콜 병렬로 샘플의 수십에서 수행할 수 있습니다 그리고 암 세포 선 및 흑색 종, 전립선, 콜론과 세포종 님 같은 인간 종양에 성공적으로 적용 되었습니다. 6 코어 히스톤 수정 인간 흑색 종 세포 선 및 종양 샘플에 epigenetic 규제 프리의 주요 구성 요소를 나타내는 방법을 보여 줍니다. 이러한 수정 포함 H3K27ac (강화), H3K4me1 (활성 및 태세 강화), H3K4me3 (발기인), H3K79me2 (복사할 영역), H3K27me3 (polycomb 억압), 및 H3K9me3 (heterochromatic 억압). 이러한 표시 억압 및 활성 도메인을 나타내는 기능적으로 뚜렷한 chromatin 상태를 식별 하기 위해 단독으로 또는 조합에서 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

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모든 임상 표본은 기관 검토 위원회의 지침에 따라 얻은 했다.

1. 버퍼 준비

  1. TE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 10 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 8.0) 200 mL를 확인 합니다.
  2. STE 버퍼 (10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl) 200 mL를 확인 합니다.
  3. 2.0 M 글리신 (37.52 g 물 200 mL에 글리신의)의 200 mL 고 65 ° c 열
  4. 200 mL의 5% 나트륨 deoxycholate (DOC) 솔루션 물 200 mL에 DOC (10 g)을 확인 합니다.
  5. 500 mL 칩 수확 버퍼 (12 mM Tris-Cl, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), 6 mM EDTA, 0.5% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) x 0.1)을 확인 합니다.
  6. 칩 희석 버퍼의 500 mL 확인 (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0.1% 의사, 1% 트라이 톤-X, 1 mM EDTA).
  7. RIPA 워시 버퍼의 500 mL 확인 (인 트, 1% 트라이 톤 x-100, 0.1 %SDS, 0.1 %DOC).
  8. RIPA/500 워시 버퍼 (RIPA 버퍼 + 360 mM NaCl)의 500 mL를 확인 합니다.
  9. 500 mL LiCL 워시 버퍼의 확인 (테, 250mm LiCl, 0.5 %NP-40, 0.5 %DOC).
  10. 직접 차입 버퍼의 500 mL 확인: 10 mM Tris Cl pH 8.0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0.5 %SDS.
  11. 항 체 바인딩/차단 버퍼 (PBS + 0.1% TWEEN 20 + 0.2 %IgG 무료 BSA) 50 mL를 확인 합니다.

2. 조직/셀 라인 처리 및 교차 연결

  1. 조직에 플래시 동결 경우 분리 전에 얼음에 dethaw.
  2. 2 mL의 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS) 살 균 면도날을 사용 하 여 수동으로에서 조직 (히스톤 수정 항 체 당 ~ 8 밀리 그램)의 50 밀리 그램을 연결이 해제 됩니다. 메 마른 조직 문화 접시에 약 5 분 동안 3 ~ 4 m m 조각으로 조직을 말하다.
  3. Dissociator 튜브에 조직과 HBSS 솔루션 전송 및 HBSS의 또 다른 8 mL을 추가. 더 조직 무 균 때까지 dissociator를 사용 하 여 연결이 해제 됩니다.
  4. 흑색 종 종양에 대 한 튜브에는 dissociator 하 고 다음 주기 각각이 순서 대로 한 번 실행: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 및 m_heart_02.01.
  5. 매체의 10 mL에 긁어 21 × 106 셀 (히스톤 수정 및 입력; 당 ~ 3 × 106 희귀 인구에 대 한 마크 당 100000 셀에 낮출 수 있습니다) 표준 조직 문화에서 성장 접시와 15 mL 원뿔 튜브에 수집.
    참고: 미디어 대표 흑색 종 세포 라인 WM115에 사용 되는 DMEM 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 5% 페니실린/스.
  6. Crosslink 조직/세포 조직 (또는 셀에 대 한 매체의 3 mL) 3 mL HBBS 당 16% 포름알데히드의 200 µ L을 추가 하 여 1% 최종 포름알데히드 농도 사용 하 여. 37 ° c.에 정확히 10 분에 대 한 믹서를 사용 하 여 10 rpm에 혼합물을 흔들어
    주의: 포름알데히드 독성 이며 적절 한 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
  7. 샘플의 3 mL 당 2.0 M 글리신의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 또 다른 5 분 동안 10 rpm에서 떨고 계속
    참고: 글리신은 끄는 역할을 합니다. 신선한 글리신 솔루션 솔루션 시간이 지남에 경향이 pH pf로 매달 마다 확인 합니다.
  8. 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 4 ° C에서 5 분 동안 934 x g에서 샘플을 회전 합니다. 제거는 상쾌한, 얼음 차가운 PBS의 5 mL, 934 x g에 다시 샘플 원심 더하고 제거는 상쾌한.
  9. 플래시 펠 릿을 동결 하 고 추가 처리를 위해-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.

3. 조직 세포, 쥡니다, 그리고 항 체 준비

  1. 1 효소 억제제 태블릿 칩 수확 버퍼의 10 mL 당 분해.
  2. 조직의 50 밀리 그램 당 효소 억제제와 칩 수확 버퍼의 300 µ L을 추가 하 고 얼음에 세포의 30 분을 허용.
    참고: 1 X 107 WM115 흑색 종 세포 선의 당 protease 억제제와 칩 수확 버퍼의 300 µ L를 추가 합니다.
  3. 셀 lysing는 하는 동안 설정 된 waterbath 방해 및 냉각 시스템 온도 4 ° c.를 도달 하 고 Waterbath 방해에 sonicator 튜브를 놓고 30에서 60 사이클에 대 한 흑색 종 조직 sonicate s에 30 s ~ 200-600의 기본적인 쌍 (bp)의 염색 질 조각을 얻기 위해 떨어져.
    참고: 쥡니다 조직 유형 간에 다를 수 시간과 그에 따라 조정 되어야 한다. 이 중요 한 단계 이며 immunoprecipitation 진행 하기 전에 파일럿 실험에 최적화 되어야 합니다.
  4. 쥡니다, 동안 세 번 사용 하 여 바인딩/차단 버퍼 (PBS + 0.1% TWEEN 20 + 0.2 %BSA)의 1000 µ L 샘플 당 항 체 당 단백질 G 자석 구슬의 20 µ L을 씻어.
  5. 흑색 종 조직의 ~ 8 mg, 100 µ L의 바인딩 / 튜브 리볼버를 사용 하 여 회전으로 4 ° C에서 2 시간에 대 한 버퍼를 차단에서 각 히스톤 항 체의 3 µ g를 품 어. 단일 항 체에 대 한 12 샘플 구슬의 240 µ L, 항 체의 36 µ g 및 바인딩/차단 버퍼의 1200 µ L를 포함 되어 있습니다.
    참고: 3 × 106 셀에 대 한 각 항 체의 5 µ g 및 항 체 당 단백질 G 자석 구슬의 30 µ L 사용 합니다. 다른 양의 조직 사용 하는 경우 항 체 및 단백질 G 구슬 적정 한다. 그러나이 프로토콜 설명된 6 히스톤 수정 (자료 테이블)에 대 한 immunoprecipitation 조건에서는,, 항 체 농도 다른 수정 및 녹음 방송 요인에 대 한 최적화 되어야 합니다.
  6. 조각 크기를 결정, sonciated chromatin 솔루션의 20 µ L를 제거 추가 차입 버퍼를 직접 차입의 44 µ L을 포함 하는 마스터의 믹스 (실내 온도) 버퍼, 1 µ L의 RNase (20 mg/mL), 및 샘플 당 5 µ L 성분 K (20 mg/mL). 50 ° c.에 적어도 2 시간에 대 한 PCR 열 cycler에서 샘플을 품 어 제조업체 지침에 따라 PCR 정화 키트를 사용 하 여 샘플을 정화.
  7. 염색 질은 3.6 단계를 진행 하기 전에 높은 감도 DNA electropherogram 악기를 사용 하 여 조각 크기를 결정 하 여 전단 충분히 있는지 확인 합니다. Electropherogram 악기를 켭니다.
  8. 8 잘 광학 튜브 스트립의 각 음에 높은 감도 버퍼 시 약의 2 µ L를 로드 합니다. 나머지 우물에서 순화 된 샘플의 첫 번째 잘 하 고 2 µ L에 높은 감도 사다리의 2 µ L를 로드 합니다.
  9. 광 튜브 캡 튜브 stips 소용돌이에 샘플 1 분 오픈 뚜껑에 대 한 2000 rpm에서 놓고 새로운 높은 감도 화면 테이프와 로드 팁의 상자를 삽입 합니다. 스트립 모자를 제거 하 고 electropherogram 악기에는 샘플을 로드.
  10. 분석 소프트웨어, 스크린 테이프에 처음 13 공간 강조 열고 오른쪽 하단에 시작 탭을 누릅니다. 염색 질 조각을 200 ~ 1000 bp 사이 칩에 적합 합니다.
  11. 무 균 튜브 sonicated 솔루션 전송 및 4 ° c.에 15 분 동안 탁상용 원심 분리기를 사용 하 여 21,130 x g에서 튜브를 회전 새로운 튜브는 상쾌한 전송.
  12. 결정은 상쾌한의 총 볼륨 입력 제어를 위한 전체 솔루션의 10%를 제거 하 고 4 ° c.에 그것을 저장합니다

4. 염색 질 Immunoprecipitation

  1. 2 효소 억제제 태블릿 칩 희석 버퍼의 20 mL 당 분해.
  2. 쥡니다 희석 후 나머지 샘플 5 칩 희석 버퍼를 사용 하 여 아래로 0.1 %SDS 레벨을가지고 시간. 1350 µ L의 최종 전체 볼륨을 얻기 위해 칩 희석 버퍼의 1080 µ L와 나머지 상쾌한의 270 µ L를 희석.
  3. 항 체 및 단백질 G 자석 구슬의 부 화 완료, 튜브 자석에 놓고는 상쾌한을 제거 합니다.
  4. 여전히 자석에 앉아 튜브, protease 억제제와 칩 희석 버퍼의 750 µ L을 추가 하 여 구슬을 한 번 씻어.
    참고: 그것은 구슬 방해 또는이 단계 동안 튜브를 회전 시킬 수는 없습니다.
  5. 희석 버퍼 세척 하 고 구슬 같은 칩 희석 버퍼의 240 µ L에 resuspend 칩을 제거 합니다. Aliquot 20 µ L 12 별도 튜브, 구슬의 각각 별도 조직 샘플에 사용 됩니다.
  6. 약 sonicated 자료 공중 제비 4 ° c.에 하룻밤 튜브 리볼버를 사용 하 여 특정 항 체와 단백질 G 구슬을 균등 하 게 수

5. 세탁기와 역 Immunoprecipitated DNA 단백질 복합물의 교차 결합 시키기

  1. 역방향 가교 후 다음날 아침 96 잘 접시에 항 체-단백질 해결책을 전송 하 고 마그네틱 스탠드에 배치. 적어도 30 s 및 제거에 대 한 준수를 구슬 수는 상쾌한.
  2. 워시 5 번과 150 µ L 다채널 피펫으로 사용 하 여 차가운 RIPA 워시 버퍼의 구슬. 세척 단계 동안 하지 피펫으로 구슬, 하지만 30 왼쪽 오른쪽에서 지속적으로 자석 이동 s 세척.
  3. 얼음 처럼 차가운 RIPA 500 워시 버퍼의 150 µ L로 두 번 샘플을 씻으십시오.
  4. 얼음 처럼 차가운 LiCl 워시 버퍼의 150 µ L로 두 번 샘플을 씻으십시오.
  5. 얼음 처럼 차가운 테 워시 버퍼의 150 µ L 한번 샘플을 세척 하 고 테 버퍼를 즉시 제거. 낮은 입력된 응용 프로그램에 대 한이 단계를 생략할 수 있습니다.
  6. 3.7 칩 DNA 샘플을 포함 하는 96 잘 접시의 신선한 우물에 단계에서 입력 컨트롤을 추가 합니다.
  7. 세척 단계 후 추가 차입 버퍼 마스터 믹스 (실내 온도)의 직접 차입 버퍼, RNase (20 mg/mL)의 1 µ L 및 역방향 가교에 대 한 칩 및 입력 샘플 당 5 µ L 성분 K (20 mg/mL) 44 µ L을 포함 하.
  8. 37 ° C, 50 ° C에서 65 ° c.에서 8-16 h h 4에서 4 h에 대 한 PCR 열 cycler를 사용 하 여 샘플을 품 어

6. 정화와 침전 된 DNA의 정량화

  1. 다음날 아침, 장소는 샘플 immunoprecipitated DNA를 포함 하는 새로운 96-잘 PCR 접시에 자석 표면에 뜨는 전송에 다시.
  2. 솔루션 (솔루션의 50 µ L에 대 한 115 µ L) 고 신중 하 게 25 번 사용 하 여 멀티 채널 피펫으로 위아래로 피펫으로 상자성 구슬 x 2.3을 추가 합니다. 솔루션은 동질적인 경우 제대로 혼합 될 것 이다.
  3. 4 분 샘플 자석에 다시 하 고 또 다른 4 분 삭제는 상쾌한에 대 한 실 온에서 품 어 장소에 대 한 자석에서 실내 온도에 솔루션을 품 어.
  4. 자석에는 샘플을 떠나, 하는 동안 70% 에탄올 (vol/vol)의 150 µ L을 추가 하 고 30에 대 한 실 온에서 품 어 구슬 방해 하지 않고 s.
  5. 에탄올을 제거 하 고 세척을 반복 합니다. 5 분에 대 한 자석에 상자성 구슬 공기 건조 수 있습니다.
    참고: 나머지 에탄올에 방해가 됩니다 정화로 두 번째 세척 후 모든 에탄올을 제거 합니다.
  6. 자석에서 샘플을 제거 하 고 10 mM Tris Cl pH 8.0의 30 µ L를 추가 합니다. 25 번 pipetting으로 혼합 하 고 4 분에 대 한 자석에서 실내 온도에 샘플을 품 어.
  7. 자석에 다시 샘플을 놓고 도서관 준비에 대 한 새로운 96 잘 접시에 각 샘플의 또 다른 4 분 전송 20 µ L에 대 한 실 온에서 품 어. 나머지 10 µ L 칩 DNA의 경우 문제는 라이브러리의 세대와 함께 저장 합니다.
  8. 이 단계에서 칩 DNA 도서관 준비 전에 계량. DNA 농도 고감도 DNA 시 약으로 측정 됩니다. 높은 감도 DNA electropherogram 악기 절차 단계로 7.1 사용 하 여 침전 된 DNA의 크기 분포를 결정 합니다.

7. 라이브러리 생성 NEBNext 울트라 II DNA 도서관 준비 키트를 사용 하 여

  1. NGS 시퀀싱 제조 업체에서 권장된 프로토콜에 따라 DNA 도서관 준비를 사용 하 여 라이브러리를 생성 합니다. 모든 반응 96 잘 접시에서 수행 되 고 외피 뚜껑 온도 설정 > 100 ° C와 50 µ L에서 설정 볼륨 PCR 열 cycler에서 수행 됩니다.
  2. 인덱스에 대 한 다중 Oligos NGS 플랫폼에 대 한 사용 됩니다. 다음 설정을 사용 하 여 PCR 증폭에 대 한 총 10 x 사이클 수행: 98 ° c 30에 대 한 초기 변성 s, 98 ° C 10에서 변성 s, 어 닐 링/30 위한 65 ° C에서 확장 s (10 x 주기), 최종 확장 65 ° C 5 분 및 4 ° c.에서 개최
    주: 표 1 PCR 증폭에 사용 되는 뇌관을 포함 되어 있습니다.
  3. PCR 확대 후 샘플을 제거 하 고 총 볼륨 nuclease 무료 물을 사용 하 여 100 µ L을가지고. 구슬의 첫 번째 추가 55 µ L에 의해 이중 면 상자성 크기 선택 (0.55x/0.8x)을 수행 하 고 25 번 pipetting으로 혼합. 4 분 동안 자석에서 실내 온도에 샘플을 품 어.
  4. 자석에 다시 샘플을 놓고 또 다른 4 분 동안 실 온에서 품 어. 이 단계는 시퀀싱에 적합 하지 않은 구슬에 큰 조각을 유지 하는 데 사용 됩니다.
  5. 새로운 96-잘 PCR 접시에는 상쾌한을 전송 합니다. 상쾌한이 부분적으로 순화 된 DNA 포함으로 버리지 마십시오.
  6. 상자성 구슬의 또 다른 25 µ L을 추가 하 고 25 번 pipetting으로 믹스 4 분 동안 자석에서 실 온에서 품 어.
  7. 자석에 다시 샘플을 배치 하 고 또 다른 4 분 동안 실 온에서 품 어는 상쾌한 삭제. 이 단계는 200 ~ 600의 파편을 유지 하는 데 사용 됩니다 사용 됩니다 혈압 라이브러리 확정.
  8. 자석에는 샘플을 떠나, 하는 동안 70%의 에탄올 (v/v)의 150 µ L을 추가 하 고 30 잠복기 수 구슬 (자석에 이동 하지 않습니다)를 방해 하지 않고 s. 에탄올을 제거 하 고 세척 두 번째 반복.
  9. 상자성 구슬 5 분에 대 한 자석에 건조 공기를 제거 모든 에탄올 두 번째 세척 후 남은 에탄올에 방해가 됩니다 정화 수 있습니다.
  10. 자석에서 샘플을 제거 하 고 10 mM Tris Cl pH 8.0의 25 µ L를 추가 합니다. 25 번 pipetting으로 혼합 하 고 4 분 샘플 자석에 다시 하 고 또 다른 4 분 동안 실 온에서 품 어 장소에 대 한 자석에서 실 온에서 품 어.
  11. 시퀀싱에 대 한 적합 한 크기를 보장 하기 위해 멀티플렉싱 하기 전에 높은 감도 DNA electropherogram 악기를 사용 하 여 라이브러리를 계량. 완성 된 라이브러리 200-600 bp 사이 고 모든 뇌관 이합체 없다.
    참고: 필요한 경우 상자성 비드 정화 x 다른 0.7은 제거 하기 위해 수행 ~ 130에 존재 하는 원치 않는 뇌관 이합체 혈압.
  12. 농도 따라 고유 인덱스 뇌관에 따라 정량된 DNA 수영장. 1 ng / µ L 6ng / µ L 사이 농도와 6 샘플을 포함 하는 풀에 대 한 분포 이며 낮은 샘플의 15 µ L 높은 샘플의 2.5 µ L. 이것은 읽기 수 흐름 셀의 각 레인에 균등 하 게 배포 될 것입니다 보장 하기 위해 이루어집니다.

8. 게시물 칩 seq 데이터 처리

  1. Snakemake38,39 에 따라 파이프라인에 사용 되는 프로세스는 다음의 모든 단계는 단일 명령에. 중요 한 것은, 각이 단계는 개별적으로 관련된 명령으로 설명 되어 있습니다.
  2. FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)를 사용 하 여 원시 fastq 연속 읽기의 품질 결정: 유닉스 터미널을 열고 디렉터리를 변경 (cd) 각 6 히스톤 수정에 대 한 원시 fastq 파일이 들어 있는 폴더에. 유닉스 터미널 종류, fastqc *fastq.gz 및 보도 [반환] 이 폴더의 모든 fastq 파일에 품질 관리 통계를 실행 됩니다.
  3. 품질 읽기 참조 게놈에 정렬 하 고 bam 파일을 압축 하기 전에 중복을 제거 합니다. 이 bowtie 버전 1.1.239, SAMBLASTER 버전 0.1.2140, SAMTOOLS 버전 1.3.141를 사용 하 여 수행 됩니다: 유닉스 터미널 종류 bowtie-m 1-n 1--최고의-지층-S-q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster-removeDups | samtools 볼-Sb-> histone1.bam 및 보도 [반환].
    참고: path_to hg19 인간 게놈 어셈블리가 포함 된 폴더를 나타냅니다. 이것은 관심의 유기 체에 따라 변경 됩니다.
  4. SAMTOOLS 다음 명령을 사용 하 여 bam 파일 정렬: 유닉스 터미널 유형을 samtools 정렬 histone1.bam-m 2 세대-@ 5-T histone1.temp-o histone1.sorted 및 보도 [반환].
  5. 색인 SAMTOOLS 다음 명령을 사용 하 여 bam 파일: 유닉스 터미널 유형을 samtools histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai 색인에 [RETURN] 키를 누릅니다.
  6. 다음 명령을 SAMTOOLS flagstat를 사용 하 여 고유 하 게 매핑된 및 정렬 되지 않은 읽기 확인: 유닉스 터미널 종류, samtools flagstat histone1.sorted.bam에 보도 [반환].
  7. 다음 명령 사용 하 여 무작위 샘플링을 수행 하 여 bam 파일 당 읽기 수를 정상화: 유닉스 터미널 종류에서 sambamba-f bam 보기-서브-시드 3-s 0.X histone1.sorted.bam = | samtools 정렬-m 2 세대-@ 5-T histone1.downsample.temp-o histone1.downsample.sorted.bam 및 보도 [반환].
  8. 색인 다시 SAMTOOLS 다음 명령을 사용 하 여 bam 파일: 유닉스 터미널 유형을 samtools histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai 색인에 [RETURN] 키를 누릅니다.
  9. (즉게놈 브라우저에 칩 seq 라이브러리를 시각화 하기 위해. UCSC 또는 IGV), kilobase 당 당 읽기에 bam 파일을 확장 하 여 deepTools 버전 2.4.040 을 사용 하 여 중요 파일 생성 백만 (RPKM). 이 다음 명령을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
    1. 표준 중요 파일에 대 한: 유닉스 터미널 종류, bamCoverage-b histone1. downsample.sorted.bam-normalizeUsingRPKM-binSize 30-smoothLength 300-extendReads 200-o histone1.bw 및 보도 {반환].
    2. 입력에 대해 중요 파일을 뺍니다: 유닉스 터미널 종류, bamCompare-bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam-bamfile2 input1.downsample.sorted.bam-normalizeUsingRPKM-비율 빼기-binSize 30-smoothLength 300-extendReads 200-o histone1.subtracted.bw 고 보도 [반환]입니다.
  10. 칩 seq (MAC) 버전 1.4.225,26 버전 2.1.0의 모델 기반 분석을 사용 하 여 "입력" 배경 위에 칩 seq 신호 농축을 식별 합니다. Macs1를 사용 하 여 "포인트 소스" 요인 macs2 및 H3K27ac, H3K4me1, H3K4me3 H3K79me2, H3K27me3 및 H3K9me3 "광범위 한 소스" 요소에 대 한 대 한. 이 다음 명령을 사용 하 여 수행 됩니다.
    1. 포인트 출처: 대 한 유닉스 터미널 종류, macs14-t histone1.downsample.sorted.bam-c input1.downsample.sorted.bam-g h s-f BAM-p 1e-5-nomodel-유지-dup에에서 모든-n histone1.file 및 보도 [반환].
    2. 광범위 한 출처: 대 한 유닉스 터미널 종류, macs2 callpeak-histone1.downsample.sorted.bam-c input1.downsample.sorted.bam-g hs tf BAM-p 1e-6--광범위 한 광범위 한 컷오프 1e-6-유지-dup 모든-nomodel-n histone1.file 및 보도 [반환].
  11. 사용 ChromHMM24 조합 chromatin 상태 패턴을 식별 하는 다음 명령을 사용 하 여 공부 하는 히스톤 수정에 따라:
    1. 유닉스 터미널에서 입력, cd/path_to/ChromHMM_folder 하 고 [RETURN] 키를 누릅니다.
    2. ChromHMM 디렉터리 형식에서 한 번 자바-mx2G-ChromHMM.jar BinarizeBam-b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output jar 및 [RETURN] 키를 누릅니다.
    3. 유형, 자바-mx2G-ChromHMM.jar LearnModel-b 1000/path_to/hg19 BinarizeBam/path_to/output_directory 15 병 고 [RETURN] 키를 누릅니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에는 냉동된 종양 조직 및 높은 처리량 방법 (그림 1A)를사용 하 여 병렬로 샘플의 수십에 수행할 수 있는 셀 라인에서 immunoprecipitation 수 있습니다. 염색 질 조각을 위한 최적의 immunoprecipitation ~ 200-1000 bps 사이 범위 해야 합니다. 우리는 같은 전단 길이 달성 하는 데 필요한 시간이 다른 조직 및 세포 유형에 대 한 다른 지적 했다. 적은 양의 조직에서 칩의 성공 특히 쥡니다 동안 항상 lysate 감기 유지에 따라 달라 집니다. 순화 칩 DN 사들이 도서관 준비 (그림 2A)를 진행 하기 전에 측정할 수 있습니다. 완성 된 라이브러리 멀티플렉싱 및 NGS 적합 해야 ~ 200-600 bp 사이 고 어떤 뇌관 이합체 없는 (

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜 chromatin 주에서 인간의 종양 조직 및 세포의 게놈 넓은 매핑 위한 완전 하 고 포괄적인 높은 처리량 칩 seq 모듈을 설명합니다. 어떤 칩 seq 프로토콜에서 가장 중요 한 단계 중 하나는 항 체 특이성입니다. 여기,이 메서드는 설명된 6 히스톤 수정, 모두 칩 등급 및 이전에 우리와 다른 실험실42,,4445 에 검증에 대 한 immunoprecipitation 조건 설명 . 동일한 항 체 농도 다른 다양 한 종양 종류에 성공적으로 적용 된, 하는 동안 그것은 관심27의 다른 요소를 공부 하는 경우 항 체 특이성을 결정 하는 중요 한.

성공적인 실험에 대 한 또 다른 주요 측면 쥡니다 조건의 최적화를 포함 한다. 쥡니다 시간과 샘플 및 조직 유형 사...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 없음 충돌 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 마커 스 코일, Curtis Gumbs, 시퀀싱 지원에 대 한 MDACC에서 SMF 핵심을 감사합니다. 이 문서에서 설명 하는 작업 SMF 코어 NIH 그랜트 (CA016672)에서 교부 금에 의해 지원 되었다와 NCI K. R. (1K99CA160578 및 R00CA160578) 수상

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ChIP 등급 H3K4me1 항체Abcamab8895
ChIP 등급 H3K27ac 항체Abcamab4729
ChIP 등급 H3K4me3 항체Abcamab8580
ChIP 등급 H3K79me2 항체Abcamab3594
ChIP 등급 H3K27me3 항체Abcamab6002
ChIP 등급 H3K9me3 항체Abcamab8898
1M Tris HCl, pH 8.0TeknovaT1080
EDTASigma-AldrichE9884
NaClSigma-AldrichS7653
글리신Sigma-AldrichG8898
나트륨 deoxycholateSigma-Aldrich30970
DPBSSigma - 생명 과학D8537-500ML
SDS시그마-알드리치74255
트리톤-X시그마-알드리치X100-100ML
LiCl시그마-알드리치746460
NP-40Calbiochem492016-100ML
1% TWEEN-20Fisher BioreagentsBP337-500
BSA - IgG-freeSigma - 생명 SciencesA2058-5G
HBSSGibo14025092
GentleMACS C 튜브GentleMACS120-008-466분리 튜브
16% 포름알데히드Peierce28906
miniProtease 억제제 Roche Diagnostics11836153001프로테아제 억제제 정제
Dynabeads Protein G Invitrogen10009D
Bioruptor NGS 튜브 0.65 mLDiagenodeC30010011초음파 처리 튜브
DynaMag - 96 Side SkirtedInvitrogen120.2796-well magnetic stand
TE bufferPromegaV6231
RNase AInvitrogen12091021
Proteinase KInvitrogen100005393
AMPure XP 비드Beckman CoulterA63882상자성 비드
에탄올Sigma-AldrichE7023
Qubit ds DNA 고감도 분석 키트InvitrogenQ32854고감도 DNA 시약
NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 준비 키트New England BioLabsE7645LDNA 라이브러리 준비 키트
뉴클레아제가 없는 정제수AmbionAM9932
고감도 D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584고감도 DNA 시약
고감도 D1000 시약Agilent Technologies5067-5585고감도 DNA 시약
멀티플렉스 올리고 (인덱스 프라이머- 세트 1)New England BioLabsE7335L멀티플렉스 올리고 
멀티플렉스 올리고 (인덱스 프라이머- 세트 2)New England BioLabsE7500L멀티플렉스 올리고 
TapeStation 4200Agilent TechnologiesG2991AA고감도 DNA 전기 페로그램 기기
Bioruptor Pico 초음파 처리 장치 DiagenodeB01060001수조 디크루터
, 믹서너트 421105
Bio-Rad C1000 터치 열 순환기,Bio-Rad1851196PCR 열 순환기
수조Fisher Scientific2322
다중 채널 피펫덴빌1003123
관 리볼버Thermo-Scientific
96-Well 스커트 플레이트Eppendorf47744-110
Allegra X-12R 원심분리기 Beckman CoulterA99464탁상용 원심
분리기 Centrifuge 5424Eppendorf22620461탁상용 원심분리기
광학 튜브 스트립(8x 스트립)Agilent Technologies401428
광학 튜브 스트립 캡(8x 스트립)Agilent Technologies401425
로딩 팁, 10 pkAgilent Technologies5067-5599
IKA MS3 와류IKA3617000와류
, 88881001

참고문헌

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