Summary

Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

Published: May 09, 2018
doi:

Summary

망막 조직을 이미징 전통적인 생 화 확 적인 방법에서 수집 될 수 없는 단일 셀 정보를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜 confocal 영상에 대 한 제 브라에서 망막 조각의 준비를 설명합니다. 형광 유전자 센서를 인코딩 또는 표시기 염료 별개 망막 세포 유형에 수많은 생물 학적 과정의 시각화를 허용.

Abstract

망막은 비전의 첫 번째 단계를 통합 하는 복잡 한 조직. 망막 세포의 기능 장애는 많은 눈부신 질병의 품질 증명 그리고 미래 치료 세포는 정상적으로 작동 하는 어떻게 다른 망막에 대 한 기본적인 이해에 경첩. 특정 종류의 기여는 망막 세포 주위에 점감 된다 때문에 생 화 확 적인 방법으로 정보를 얻고 어려운 입증 되었습니다. 라이브 망막 이미징 subcellular 수준, 유전자 인코딩된 형광 바이오 센서의 증가 덕분에 수많은 생물 학적 과정의 보기를 제공할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 지금까지 tadpoles 그리고 zebrafish 애벌레, 고립 된 망막의 바깥쪽 망막 레이어 또는 살아있는 동물에서 망막의 낮은 해상도 이미징 있었습니다. 여기 우리 confocal 현미경 검사 법을 통해 라이브 영상에 대 한 성인 제 브라에서 라이브 비보 전 망막 슬라이스를 생성 하기 위한 방법을 제시. 이 준비는 대부분 세포 유형 confocal 이미징 실험 살포를 사용 하 여 수행 볼 수와 모든 망막 레이어 가로 분할 영역 생성 합니다. 유전자 변형 zebrafish 표현 형광 단백질 또는 특정 망막 세포 유형 또는 세포 바이오 센서는 그대로 망막에서 단일 셀 정보를 추출 하는 데 사용 됩니다. 또한, 망막 조각 방법의 다양성에 추가 하는 형광 표시기 염료로 로드할 수 있습니다. 이 프로토콜 이미징 캘리포니아2 + 제 브라 콘 대뇌, 내 개발 되었습니다 하지만 적절 한 표시와 함께 그것은 수 적응 측정 캘리포니아2 + 또는 뮐러 셀, 바이 폴라 및 수평 세포, microglia, amacrine 세포, 또는 망막에서 대사 산물 신경 절 세포입니다. 이 메서드는 셀 형식을 공부에 적합 하지 않습니다 그래서 망막 안료 상피 조각에서 제거 됩니다. 연습, 여러 실험에 대 한 하나의 동물에서 직렬 슬라이스를 생성 가능 하다. 이 적응 기술에 대 한 망막 세포 생물학, 캘리포니아2 +, 에너지 항상성 많은 질문에 응답 하기 위한 강력한 도구를 제공 합니다.

Introduction

제 브라 (Danio rerio) 의료 및 기본적인 과학 연구1, 작은 크기, 빠른 개발 및 척추 기관 시스템 때문에 널리 사용 되는. Transgenesis에 대 한 설립된 방법과 결합 zebrafish 애벌레의 자연적인 투명도 살아있는 동물에서 세포 프로세스의 상세한 시각화를 사용할 수 있습니다. 다양 한 유전자 인코딩된 형광 바이오 센서는 감지 캘리포니아2 + 2, 과산화 수소3, apoptotic 활성화4 ATP5특정 zebrafish 셀에 표적이 되었습니다.

Vivo에서 화상 진 찰 zebrafish 애벌레의 신경 과학, 두뇌 회로6 의 매핑 등의 분야에서 혁신을 주도하 고 있다 및 중앙 신경 조직에 대 한 약물 개발 무질서7. Zebrafish는 비전 연구에 적합 그들의 망막 기능 구조 및 더 높은 척추 동물의 신경 종류 그리고 강력한 시각적 동작8,9표시 때문에. 여러 종류의 망막 유년 인간의 질병에 유사한 성공적으로 모델링 되 고 제 브라10,11, 망막2, 내 변질 개별 대뇌의 라이브 영상 등에서 공부 12.

애벌레 zebrafish 이미징 비보에 유용한 도구 동안, 그것은 더 많은 도전으로 물고기 성장 하 고 착 색, 개발 몇 가지 약리 치료 전체 동물을 침투 수 없습니다 된다. 또한, 특정 세포 프로세스 개발 및 나이, 성인 동물에 이해 기능과 질병의 진행에 대 한 중요 한 나중 시간 포인트를 만들고 변경 합니다. Immunoblot, quantitiative PCR, O2 소비, 및 metabolomic 분석 같은 방법을 전체적으로 망막의 생물학에 대 한 중요 한 단서를 제공할 수 있습니다 하지만 그것은 개별 종류의 세포에 의해 영향을 받는 기부를 분별 하기 어려운 생화학 질병입니다. 이러한 문제를 무시 비보 전 고립 된 망막 조직을 이미징 하 고 평면 이미징 하는 동안 탑재 된 망막 월급 외부 망막13의 보기, 깊은 내부 망막 기능 가려진. 가로 망막 조각, 그에 제시 모든 레이어 및 셀의 명확한 보기를 활성화 하려면 고정 immunohistochemical 분석 하지만 정상적인 기능 및 질병에 관련 된 동적 프로세스의 단일 스냅숏을 제공.

여기, 우리 이미징 성인 제 브라에서 비보 전 가로 망막 분할 영역을 생성 하기 위한 방법을 제시. 그것은 비슷한 electrophysiological 및 형태학 연구14,15, ex vivo 공초점 레이저를 사용 하 여 이미징 시간 경과 대 한 중요 한 수정에 대 한 수 륙 양용 그리고 zebrafish 망막 슬라이스를 준비 하기 위한 방법 현미경 검사 법입니다. 바이오 센서 또는 분할 영역에 염료의 형광 응답 약리 에이전트 관류를 사용 하 여 제공 하면서 confocal 현미경으로 실시간으로 모니터링 된다. 메서드가 대뇌 이미징 개발 되었습니다, 그것은 적절 한 형광 마커 뮐러 셀, 양극 세포, 수평 세포, amacrine 세포, 또는 망막 신경 절 세포를 시각화에 대 한 사용 가능한 수 있습니다. 또한, 조각 보고서 세포 생존 능력, 기공을 전송, 미토 콘 드 리아 기능, 또는 산화 환 원 상태에 형광 세포 투과성 염료로 로드할 수 있습니다. 이 다재 다능 한 준비는 망막, 캘리포니아2 + 역학, 대사 상태, 신호 변환 등을 통해 다양 한 subcellular 프로세스의 시각화 수 있습니다.

Protocol

모든 동물 실험 워싱턴 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인 되었다. 1. 동물 및 장비 준비 참고: 망막 안료 상피 (RPE) 조직의 그 염색 망막 기능을 어둡게 하 고 때 ex vivoimaging confocal 조직을 손상 수 망막의 외부를 둘러싼 어두운 시트입니다. 어둠 속에서 zebrafish의 RPE 망막;에서 제거 됩니다. 어두운 자국과 이미징 하기 전에 망막에서 RPE의 미래 제거를 촉진 하기 위하여 물고기를 적응. 물고기 산란 탱크 물고기 물으로 채워진 전송 다음 어두운 직물 산란 탱크 포장 또는 어두운 캐비닛에. 다크 zebrafish 망막에서 완전 한 분리는 RPE에의 가까이 있도록 안락사 전에 적어도 1 시간에 대 한 적응. 30 분 어둠 적응은 그것의 대뇌 사이 삽입 된 남아 있을 수 있습니다 하지만 대부분 RPE 제거 충분 합니다. 녹아 ~ 석유의 15 mL 뜨거운 접시에 50 mL 비 커에서 젤리와 다음 3 mL 슬립 팁 주사기로 액체의 3 mL을 그립니다. 주사기를 반전 테스트 튜브 랙에 놓고 석유 젤리 냉각 허용 합니다. 일반 7 cm X 2.5 cm 현미경 슬라이드에 다시 사용할 수 있는 조각화 챔버를 확인 합니다. 투명 매니큐어, 슬라이드의 센터에서 3 cm X 2.5 cm의 사각형을 만드는 페인트 좁은 라인을 사용 하 여 건조, 그것을 허용 하 고 라인에 매니큐어의 또 다른 레이어를 추가 합니다. 이미징 동안 분할 영역을 커버 슬립에 이미징 사다리를 준비 합니다. 슬라이스는 사다리의 “가로 대”를 형성 합니다. 정적 이미징 또는 최소한의 솔루션 흐름 주입 실험, 석유 젤리 사다리 18 m m 사각 유리 커버 슬립에 석유 젤리의 2 개의 넓은 평면 병렬 스트립의 구성 된 확인 합니다. 주사기를 사용 하 여 평평 하 게 두 ~ 냉각된 석유 젤리 커버 슬립에 떨어져 0.5 cm의 1 cm 긴 얼룩. 조직 기계 준비. 에탄올과 더블 가장자리 면도기 블레이드 깨끗 하 고 건조 공기를 허용. 그것은 분기에가 위, 먼저 세로로 잘라 반으로 다음 각 블레이드 건너. 조각화 챔버 조직 슬라이서의 무대에서 무대에서 가로로 가운데 놓고 긴 가장자리 정렬에 대 한 영구 표시와 함께 표시 합니다. 조직 기계 팔에 블레이드 섹션을 로드, 블레이드 거짓말 평평 하 고 가운데는 슬라이드에는 매니큐어를 건드리지 않고 확인 다음 부드럽게 블레이드 기구를 강화 합니다. 낮은 ¼ 노브를 조정 하 여 블레이드 팔 차례, 이미징 챔버의 테스트 센터에 필터 종이의 스크랩 잘라 다음 장소. 종이 되지 극복 된다 완전히, 블레이드를 다시 탑재. 10 cm 배양 접시에서 냉각된 석유 젤리의 하나의 작은 점 배치는 주사기를 사용 하 여 ~ 1.5 c m는 센터의 오른쪽에. 향하도록 하는 석유 젤리와 집게를 사용 하 여 이미징 사다리를 누릅니다. 또 다른 작은 석유 젤리 도트 만들기 ~ 이미징 챔버의 입구 가장자리에서 1 cm. 석유 젤리 주사기 20 g 바늘으로 적합 하 고 그것을 벗기다. 주사기에 바늘 누른 조각화 챔버의 중앙에 세로로 두 1 cm 긴 얇은 병렬 스트립 석유 젤리의를 만들기 위해 그것을 사용 합니다. 지구 공간 ~ 1 c m 간격. 중심을 포장 하 여 재사용 가능한 와이어 눈 루프 도구를 만들기는 ~ 4 cm 세그먼트의 한 쌍의 주위 30 g 텅스텐 와이어 집게 한 번 단단히 폐쇄. 때까지 zebrafish 눈 보다 약간 더 크게 일반적으로 와이어는 집게를 위아래로 슬라이딩 하 여 루프의 직경 조절 ~ 2-3 m m. 트위스트 와이어 끝 그리고 실험실 테이프를 사용 하 여 6 cm 나무 막대기의 끝에 그들을 보호. 벨의 솔루션을 준비 합니다. 보충 재고 솔루션 (표 1) X 50을 해 동 하 고 실험;의 아침 신선한 HEPES-버퍼링, 비 조 벨의 솔루션 (표 2)에 추가 원뿔 원심 분리기 관 또는 무 균 병에 벨의 솔루션의 모든 10 mL에 보충 재고 솔루션의 200 µ L를 희석. 정적 이미징 실험을 위해 적어도 30 mL 실험 당 벨의 솔루션의 준비. 벨의 솔루션 관류 실험에 필요한 양의 흐름 속도 총 실험 시간에 따라 달라 집니다. 확인 보충된 솔루션의 pH 7.4 디지털 pH 프로브 또는 pH 종이 사용 하 여이 고 조정 따라와 희석 NaOH 또는 HCl. 얼음에 보충된 벨의 솔루션 표준 의료 산소 탱크와 호스를 장착 하는 레 귤 레이 터를 사용 하 여 적어도 5 분 동안 100% 산소 가스와 버블링 하 여 산소 또는 선택적 가스 bubbler 매니폴드 관류에 대 한 사용. 얼음 봉인된 원뿔 원심 분리기 관 또는 해 부 현미경; 근처 살 균 유리병에 산소 벨의 솔루션을 저장 이 솔루션을 사용 하 여 이미징, 해 부에 대 한 염료 또는 약리 에이전트 희석. 다른 솔루션은+같은 실험에 사용 되는 경우-무료 벨소리의 솔루션 (표 3), 반복 단계 1.9.1.-1.9.3. 해 부 현미경, 근처 다른 도구, 마이크로-가 위, 집게, 접시를 수집 하 고 물고기 물 얼음 목욕 zebrafish 안락사에 대 한 준비. 2. 망막 조각 ( 그림 1참조)를 준비 터치 응답 손실 됩니다 때까지 빨간 주변광 (만들 수 있는 RPE 스틱 더 긴밀 하 게 망막에) 빛 적응을 최소화 하기 위해 아래 작업 얼음 목욕에 침수에 의해 제 브라를 안락사, 일반적으로 1-2 분 페 트리 접시에 생선을 전송 하는 메스를 사용 하 여 cervically 탈 구 하지만 하지 물고기를 목을 벨. 한쪽 눈 주위 결합 조직 완화 와이어 루프를 사용 하 고 한 손으로 루프와 부드럽게 눈 앞으로 당겨. 다른 한편으로는에서 마이크로-가 위를 사용 하 여 눈, 눈의 뒤쪽을 절단 하지 않도록 주의 복용 아래 흰색 시 신경 절단. 눈 얼음, 차가운 벨의 솔루션의 페 트리 접시에 집게를 사용 하 여 전송 하 고 두 번째 눈에 대 한 반복 합니다. RPE 망막에서 제거 될 때까지 붉은 빛 또는 어둠 속에서 눈 유지. 차가운 벨의 솔루션 페 트리 접시에 일반 유리 슬라이드에 한 방울에 낮은 전력 해 부 현미경 eyecups 해 부. 각 막 미세 집게와 피어스 다음 지우기, 부드럽게 제거 취 성 막과 집게와가 위는 빛 sclera. 제거 하 고 렌즈와는 공 막의 대부분을 삭제 ( 그림 1A참조), 최소한 고립 된 아이피를 처리. 지방, sclera, 그리고 검은 RPE의 작은 비트의 조각에서 아이피에 연결 된 남아 있을 수 있습니다 고 나중 망막에서 제거. 망막 분리 단계 2.4.1에서에서 RPE에서, 만약 하지 섬세 한 고립 된 망막 손상에 여분의 주의 사용 하 여 같은 단계 진행. (최대 RPE) 아래로 아이피 오픈 사이드 슬라이드에 놓고 3 분 또는 분기 한 모션에 신선한 단일에 지 면도날으로 잘라 ( 그림 1B를 참조). 높은 곡선 조직의 조각을 삭제 합니다. 필터 종이에 평면 마운트 망막 벨의 솔루션 필터 종이 습식 및 슬라이드 아이피 조각 옆에 배치. 그것을 puncturing 피하기 위해 플랫 집게 그대로 젖은 필터 종이 처리할 때 사용 합니다. 필터 종이 및 조직 추운 벨의 솔루션을 추가 합니다. RPE와 위로 향하도록, 즉 위로 향하도록 하는 눈의 뒤를 가진 대뇌 각 아이피 조각 아래 필터 종이 또한 신중 하 게 각 손에 집게를 사용 하 여, 있습니다. 필터 종이의 중앙에 따라 한 줄에 아이피 조각 위치 ( 그림 1C참조). 모서리 또는 코너 근처만 잘 집게와 아이피 조각을 부드럽게 처리 합니다. 3 건조 종이 타월에 젖은 필터 종이 필터 종이에 고착 하는 망막을 하려면 배치 하향, 수 분을 심지 하지만 그나마 s 조직 되 고 건조 하 게. 필터 종이에 평평 거짓말 아이피 조각 때까지 반복 합니다. 망막, 평평 하 게 하는 데 도움이 필터 종이의 밑면에 부드러운 흡입을 적용 하지만이 단계는 필수적입니다. RPE의 검은 시트 아이피 조각에 남아 있으면 미세 집게를 사용 하 여 부드럽게 껍질을 멀리 하나에서 시작 하는 조직 방울 벨의 솔루션에에서 앉아있는 동안 ( 그림 1D참조) 코너. 한다 망막 필터 종이, 반복 2.5.3에 wicking 단계 리프트. 망막은 표백된 시각적인 안료 인 핑크 나타날 수 있습니다. 망막 해 부와 평면 추운 벨의 솔루션에 첫 번째 플랫 탑재 망막을 유지 필요한 경우 2.4-2.6 두 번째 눈에 대 한 단계를 설치를 반복 합니다. 조각화 절차 간소화, 하 두 망막의 한 필터 종이에 삽입할 수 있습니다. RPE 제거 되었습니다 일단 프로토콜 수 실시 일반 방 조명 아래 실험 어둠을 필요로 하지 않는 한. 슬라이드에 필터 종이 놓고 떠나 단일에 지 면도날, 사각형으로 잘라 ~ 망막의 라인의 양쪽에 필터 종이 0.5 c m. 필터 종이 준비 조각화 약 실에, 집게를 사용 하 여 얇은 석유 젤리 라인으로 긴 필터 종이 가장자리를 밀어 이동한 3-4 방울 찬 벨소리 솔루션에서에서 망막을 담가 합니다.참고: 일부 염료, 닥터지 염료 등 최고의에 로드 됩니다 평면 마운트 부 러 뜨 리 하기 전에이 단계에서. 이러한 로드, 조직, 멀리 사악 고 조각화 챔버에 씻어. 예를 들어, C12 558/568 BODIPY 달아 망막 하지 얼룩 세포 막 및 포토 리셉터 외부 세그먼트 ( 그림 4A참조)에 로드 될 때 ~ 5 µ g/mL 실내 온도 (일반적으로 23-27 ° C)에서 15 분 뒤에 초과 벨의 해결책에서 세척 . 조직 슬라이서 단계로 조각화 챔버를 전송, 표시 된 선 따라 긴 가장자리에 위치 하 고 보안 챔버 실험실 테이프와 함께 무대에 끝납니다. 망막 및 조각화 팔에, 부드러운 압력을 사용 하 여 필터 종이 잘라 한쪽 끝에서 시작. 첫 번째 조각 잘 렸 지 완벽 하 게, 확인 다음을 사용 하 여는 마이크로미터 잘라 ~ 400 µ m 조각. 이미징 사다리를 조립 한다. 자리 단계는 영상에 인접 한 1.7에서 페 트리 접시에 썰어 망막 섹션 조각화 챔버 사다리 ( 그림 1E참조). 그 내용을 잠수함 추운 벨의 솔루션 접시를 채우십시오. 집게를 사용 하 고 조각 빠져들 유지, 부드럽게 전송 필터 종이 망막의 스트립 사다리 오른쪽 왼쪽에서 페 트리 접시를 밀어. 직접 망막을 건드리지 않도록 주의. 조각 회전 90 ° 고 필터 종이 가장자리 석유 젤리에 매장. 정밀 하 게 위치 망막 조각 사다리에 집게와 망막 레이어 해 부 현미경 아래에서 명확 하 게 볼 수 있습니다 ( 그림 1G참조). 사다리의 각 끝에 조각, 사출 또는 흐름 동안 조직의 움직임을 최소화 하기 위해 다른 조각으로 조직 안으로 직면 확인 합니다. 잘 되지 않은 어떤 망막 분할 영역 삭제 필터 종이 준수 ( 그림 2A참조). 원하는 경우이 단계에서 망막 조각으로 염료를 로드 하 고 영상 전에 초과 벨의 솔루션에 씻어.참고: Propidium 요오드 화물 (PI) 및 Hoechst 33342 튼튼하게 얼룩 죽 및 모든 세포의 핵 각각 ( 그림 2B참조), 실 온에서 20 분 동안 5 µ g/mL에서 망막 조각으로 알을 품을 때. Tetramethylrhodamine (TMRM)에 축적 되어 적극적으로 호흡 미토 콘 드리 아의 1 알을 품을 때 망막에 걸쳐 실 온에서 30 분 동안 nM. 슬라이스는 착 색 하는 동안 이미징 챔버 및 사출 장치를 준비 합니다. 주사기를 사용 하 여 벨의 솔루션 튜브 및 거품 제거, 이미징 챔버 입구 배관의 오픈 엔드 연결할 플러시하고 닫는 자 지. 주사기와 주입, reagent(s) 그것을 채울 다음 튜브를 다시 연결. 집게를 사용 하 여 이미징 챔버의 입구 가장자리 근처 석유 젤리의 도트에는 coverslip 누르면 이미징 챔버에 망막 조각과 coverslip 전송 ( 그림 1 H참조). 분할 영역을 커버 하 벨의 솔루션과 이미징 챔버를 채우십시오. 3. 이미징 망막 조각 똑바로 confocal 현미경 렌즈를 담그고 20 또는 40 X 물 장착의 단계에 연결 된 주입 기구와 이미징 채워진된 챔버를 놓습니다. 보안 단계 클립 이미징 챔버. 찍기 렌즈, 사다리에 낮은 고 희미 한 트랜스 조명 빛 아래 사다리의 한쪽 끝에 조각에 집중 한다. 각 조각 가로 방향, 포토 리셉터 외부 세그먼트 및 필터 종이에 안전한 접착의 존재를 검사 합니다. 시간 경과 영상에 대 한 최고의 선택 하 고 시간 경과 이미지 수집을 위한 현미경 소프트웨어를 구성 합니다. 표 4 는 다양 한 형광 마커 및 염료에 대 한 일반적인 이미지 설정을 설명합니다.참고: 이미지 수집의 속도 현미경, 형광 marker(s), 공부 되 고 생물 학적 과정에 따라 달라 집니다. 예를 들어, GCaMP3와 붉은 염료 대뇌에서 칼슘 역학 이미징에 대 한 800 x 800 픽셀 해상도, 2 µs/픽셀 스캔 속도, 및 10-s 프레임 속도 사용 합니다. 사용 가능한 경우 슬라이스 (포토 리셉터 외부 세그먼트, 셀 시체, 핵) 시간 경과 하는 동안 잠재적인 재교육 지원에 물리적 랜드마크를 추적 하는 소프트웨어를 사용 합니다. 또한 조각에 걸쳐 실시간으로 형광을 모니터링 하는 소프트웨어를 설정 합니다. 이미징 시작 하 고 초기 형광을 모니터링 합니다. 조각에 걸쳐 형광 (일반적으로 2-5 분) 안에 안정화, 실험으로 진행. 주입, 주사기 자 지, 다음 천천히 우울 열고 혼합 지원을 두 번 플런저에 다시 그립니다.참고: 예를 들어, protonophore 이미징 챔버에 1 µ M의 최종 농도 도달 하는 CCCP의 집중된 솔루션을 주입 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 폐지. 이는 강력한 캘리포니아2 + GCaMP에 의해 보고 된 포토 리셉터 cytosol에서 버스트 다음 TMRM에 의해 보고 된 미토 콘 드리 아 막 잠재력에 있는 꾸준한 감소를 유도 합니다. 밀접 하 게, 실험 기간 동안 드리프트에 대 한 슬라이스를 모니터링 하 고 소프트웨어를 사용 하 여 실제 건축물에 따라 마이크로 조정. 일반적으로 주입 하는 동안 Z-방향으로 드리프트 또는 관류는 < 5 µ m. 4. 관류 실험 솔루션 변경 또는 지속적으로 흘러 어디 동안 망막 조각 이미징 참고: 망막 이미징 관류 실험 동안 조각 솔루션은 변경 또는 지속적으로 흘러 정적 이미징 또는 주입 실험, 다음 수정에 대 한 설치와 비슷합니다. 석유 젤리 사다리 단계 1.4에서에서 설명한, 대신 sturdier 왁 스 사다리를 사용 하 여 망막 조각 솔루션 흐름 동안 꾸준히 개최. Unflavored 치과 왁 스의 2 개의 작은 병렬 실린더 장소 ~ 0.5 c m는 coverslip에 떨어져. 평평한 표면에 엄지 손가락을 사용 하 여 누릅니다 각 실린더는 coverslip의 병렬 가장자리 쪽으로. 둘 다 점수 #1 coverslip 가로로 병합 된 실린더 다음 주걱으로 왁 스 스트립 사이 석유 젤리의 얇은 층을 얼룩 ( 그림 1E, 오른쪽 참조). 2.10.2 단계에서 이미징 사다리를 어셈블할 때 좋은 집게 (그림 1G)을 사용 하 여 왁 스 점수에 슬라이스 필터 종이 가장자리를 누릅니다. 단계 2.12에서에서 관류에 대 한 설정, preoxygenated 솔루션, 주사기 저수지를 작성 하거나 선택적 가스 매니폴드를 사용 하 여 산소 각 저수지에 솔루션을 합니다. 플러시 벨의 솔루션, 모든 튜브 확인 모든 라인 흐름을 열었을 때 큰 거품을 제거 합니다. 단계 2.13에서에서 이미징 챔버를 작성 하기 전에 주사기 사용 하 여 흐름 중 옆으로 미끄러지기에서 그것을 방지 하기 위해 coverslip의 각 노출된 모서리에 놓고 석유 젤리의 다른 점. 이미징 챔버 가득 현미경 스테이지에 장착 된 경우는 흡 인기 켜고 흡 인기 튜브를 연결. 벨의 솔루션의 흐름을 테스트 하 고는 micropositioner를 사용 하 여 적은 양의 액체 챔버 오버플로 전에 그려지도록는 유출 챔버를 통해 흡 인기 튜브를 놓다 (일반적으로 ~ 2 mL/min 흐름 속도 대 한 솔루션 표면 위에 1 mm). 3.4 단계에서 분할 영역을 선택 하는 동안 흐르는 벨의 솔루션을 계속. 단계 3.4 관류에서에서 실험을 수행 하는 두 번째 솔루션을 여는 동안 첫 번째 솔루션의 자 지를 폐쇄 하 여 솔루션의 흐름을 전환 합니다. 예를 들어, 두 개의 주사기 저수지 벨의 솔루션 또는 Na+로 가득 사용 extracellular 나+ 이미징 상공에서 고갈-무료 솔루션 (표 3). 기준선 설정 없음+로 전환 후에 벨의 솔루션 흐름-무료 솔루션. 이 결과 큰 cytosolic 캘리포니아2 + 포토 리셉터 외부 세그먼트 증가 셀 시체 ( 그림 4참조). 중력 먹인 관류 시스템 이미징 동안 흐름 속도 상수 이므로 각 저수지에서 솔루션의 수준을 모니터링 합니다. 저수지에서 산소 솔루션 필요에 따라 위쪽 또는 지속적인 산소 가스 매니폴드와 버블링을 유지.

Representative Results

안정적인 위치 및 조각 가로 방향을 주입 또는 약리 에이전트의 관류와 성공적인 이미징에 열쇠입니다. 신중 하 게 검토 하 고 모든 망막 레이어는 표시 (그림 2A, 슬라이스 ii) 확인 하는 데 필요한 confocal 영상 전에 분할 영역 위치. 조각 회전 (그림 2A, 슬라이스 iii)를 약간 앞으로 하 고 외부 세그먼트의 번들 표시 됩니다 작은 조…

Discussion

신선한 zebrafish 망막 조각의 비보 전 영상 포토 리셉터 생물학20,,2122, 공부에 대 한 다양 한 도구를 것을 입증 했다 그리고 고유에서 완전히 성숙, 단일 셀의 분석 수 있습니다. 차별화 된 망막입니다. 연습으로, 망막의 동일한 부분에서 직렬 조각을 사용 하 여 단일 물고기에서 조직으로 여러 실험을 실시 가능 하다. 과제 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리 감사 랄 프 넬슨과 다니엘 Possin 안정적인 유전자 변형 zebrafish 라인의 세대를 위해이 프로토콜, 그리고에 바 Ma, 애슐리 조지 게 일 스탠 튼을 개발 하면서 생각 지도. 일 밀리, 밀리, 화장실을 NIH 네이 5T32EY007031에 NSF GRFP 2013158531 고 재 혁 고 S.B. EY026020에 의해 지원 되었다

Materials

zebrafish Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility stocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jelly Fisher Scientific 19-090-843 for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringe Fisher Scientific 14-823-436 for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needle Fisher Scientific 14-826-5B for petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polish Amazon B00150LT40 for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslips Fisher Scientific 12-542A for imaging ladders
unflavored dental wax Amazon B01K8WNL5A for imaging ladders
double edge razor blades Stoelting 51427 for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometer Stoelting 51415 for tissue slicing
filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size EMD Millipore HAWG01300 filter paper for mounting retinas
10 cm petri dish Fisher Scientific FB0875712 for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stick Fisher Scientific 23-400-112 for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wire Fisher Scientific AA10408G6 for wire eye loop tool
D-glucose Sigma Aldrich G8270 component of supplement stock solution
sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022 component of supplement stock solution
sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256 component of supplement stock solution
L-glutamine Sigma Aldrich G3126 component of supplement stock solution
 L-glutathione, reduced Sigma Aldrich G4251 component of supplement stock solution
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960 component of supplement stock solution
NaCl Sigma Aldrich S7653 component of Ringer's solution
KCl Sigma Aldrich P9333 component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2O Sigma Aldrich C3881 component of Ringer's solution
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282 component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2O Sigma Aldrich M0250 component of Ringer's solution
HEPES Sigma Aldrich H3375 component of Ringer's solution
Tris base Fisher Scientific BP152 component of Na+-free Ringer's solution
6 N HCl Fisher Scientific 02-003-063 component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4 Sigma Aldrich P5655 component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tube Denville Scientific C1062-P container for Ringer's solution
Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades World Precision Instruments 501790 micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips World Precision Instruments 504510 fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor blades Fisher Scientific 12-640 for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forceps Fisher Scientific XX6200006P flat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPY Fisher Scientific D3835 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI) Fisher Scientific P3566 stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) Fisher Scientific T668 stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamber Cell MicroControls BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) Fisher Scientific N13195 fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscope Olympus FV1000 confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) Sigma Aldrich C2759 experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positioner Cell MicroControls FL-1 for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder Warner Instruments various for perfusion

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Giarmarco, M. M., Cleghorn, W. M., Hurley, J. B., Brockerhoff, S. E. Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments. J. Vis. Exp. (135), e56977, doi:10.3791/56977 (2018).

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