Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

제 브라 (Danio rerio) 의료 및 기본적인 과학 연구¹, 작은 크기, 빠른 개발 및 척추 기관 시스템 때문에 널리 사용 되는. Transgenesis에 대 한 설립된 방법과 결합 zebrafish 애벌레의 자연적인 투명도 살아있는 동물에서 세포 프로세스의 상세한 시각화를 사용할 수 있습니다. 다양 한 유전자 인코딩된 형광 바이오 센서는 감지 캘리포니아^{2 + 2}, 과산화 수소³, apoptotic 활성화⁴ ATP⁵특정 zebrafish 셀에 표적이 되었습니다.

Vivo에서 화상 진 찰 zebrafish 애벌레의 신경 과학, 두뇌 회로⁶ 의 매핑 등의 분야에서 혁신을 주도하 고 있다 및 중앙 신경 조직에 대 한 약물 개발 무질서⁷. Zebrafish는 비전 연구에 적합 그들의 망막 기능 구조 및 더 높은 척추 동물의 신경 종류 그리고 강력한 시각적 동작^8,9표시 때문에. 여러 종류의 망막 유년 인간의 질병에 유사한 성공적으로 모델링 되 고 제 브라^10,11, 망막^{2, 내 변질 개별 대뇌의 라이브 영상 등에서 공부 12}.

애벌레 zebrafish 이미징 비보에 유용한 도구 동안, 그것은 더 많은 도전으로 물고기 성장 하 고 착 색, 개발 몇 가지 약리 치료 전체 동물을 침투 수 없습니다 된다. 또한, 특정 세포 프로세스 개발 및 나이, 성인 동물에 이해 기능과 질병의 진행에 대 한 중요 한 나중 시간 포인트를 만들고 변경 합니다. Immunoblot, quantitiative PCR, O₂ 소비, 및 metabolomic 분석 같은 방법을 전체적으로 망막의 생물학에 대 한 중요 한 단서를 제공할 수 있습니다 하지만 그것은 개별 종류의 세포에 의해 영향을 받는 기부를 분별 하기 어려운 생화학 질병입니다. 이러한 문제를 무시 비보 전 고립 된 망막 조직을 이미징 하 고 평면 이미징 하는 동안 탑재 된 망막 월급 외부 망막¹³의 보기, 깊은 내부 망막 기능 가려진. 가로 망막 조각, 그에 제시 모든 레이어 및 셀의 명확한 보기를 활성화 하려면 고정 immunohistochemical 분석 하지만 정상적인 기능 및 질병에 관련 된 동적 프로세스의 단일 스냅숏을 제공.

여기, 우리 이미징 성인 제 브라에서 비보 전 가로 망막 분할 영역을 생성 하기 위한 방법을 제시. 그것은 비슷한 electrophysiological 및 형태학 연구^14,15, ex vivo 공초점 레이저를 사용 하 여 이미징 시간 경과 대 한 중요 한 수정에 대 한 수 륙 양용 그리고 zebrafish 망막 슬라이스를 준비 하기 위한 방법 현미경 검사 법입니다. 바이오 센서 또는 분할 영역에 염료의 형광 응답 약리 에이전트 관류를 사용 하 여 제공 하면서 confocal 현미경으로 실시간으로 모니터링 된다. 메서드가 대뇌 이미징 개발 되었습니다, 그것은 적절 한 형광 마커 뮐러 셀, 양극 세포, 수평 세포, amacrine 세포, 또는 망막 신경 절 세포를 시각화에 대 한 사용 가능한 수 있습니다. 또한, 조각 보고서 세포 생존 능력, 기공을 전송, 미토 콘 드 리아 기능, 또는 산화 환 원 상태에 형광 세포 투과성 염료로 로드할 수 있습니다. 이 다재 다능 한 준비는 망막, 캘리포니아^{2 +} 역학, 대사 상태, 신호 변환 등을 통해 다양 한 subcellular 프로세스의 시각화 수 있습니다.

모든 동물 실험 워싱턴 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인 되었다.

1. 동물 및 장비 준비

참고: 망막 안료 상피 (RPE) 조직의 그 염색 망막 기능을 어둡게 하 고 때 ex vivoimaging confocal 조직을 손상 수 망막의 외부를 둘러싼 어두운 시트입니다. 어둠 속에서 zebrafish의 RPE 망막;에서 제거 됩니다. 어두운 자국과 이미징 하기 전에 망막에서 RPE의 미래 제거를 촉진 하기 위하여 물고기를 적응.

1. 물고기 산란 탱크 물고기 물으로 채워진 전송 다음 어두운 직물 산란 탱크 포장 또는 어두운 캐비닛에.
   1. 다크 zebrafish 망막에서 완전 한 분리는 RPE에의 가까이 있도록 안락사 전에 적어도 1 시간에 대 한 적응. 30 분 어둠 적응은 그것의 대뇌 사이 삽입 된 남아 있을 수 있습니다 하지만 대부분 RPE 제거 충분 합니다.
2. 녹아 ~ 석유의 15 mL 뜨거운 접시에 50 mL 비 커에서 젤리와 다음 3 mL 슬립 팁 주사기로 액체의 3 mL을 그립니다. 주사기를 반전 테스트 튜브 랙에 놓고 석유 젤리 냉각 허용 합니다.
3. 일반 7 cm X 2.5 cm 현미경 슬라이드에 다시 사용할 수 있는 조각화 챔버를 확인 합니다.
   1. 투명 매니큐어, 슬라이드의 센터에서 3 cm X 2.5 cm의 사각형을 만드는 페인트 좁은 라인을 사용 하 여 건조, 그것을 허용 하 고 라인에 매니큐어의 또 다른 레이어를 추가 합니다.
4. 이미징 동안 분할 영역을 커버 슬립에 이미징 사다리를 준비 합니다. 슬라이스는 사다리의 "가로 대"를 형성 합니다.
   1. 정적 이미징 또는 최소한의 솔루션 흐름 주입 실험, 석유 젤리 사다리 18 m m 사각 유리 커버 슬립에 석유 젤리의 2 개의 넓은 평면 병렬 스트립의 구성 된 확인 합니다. 주사기를 사용 하 여 평평 하 게 두 ~ 냉각된 석유 젤리 커버 슬립에 떨어져 0.5 cm의 1 cm 긴 얼룩.
5. 조직 기계 준비.
   1. 에탄올과 더블 가장자리 면도기 블레이드 깨끗 하 고 건조 공기를 허용. 그것은 분기에가 위, 먼저 세로로 잘라 반으로 다음 각 블레이드 건너.
   2. 조각화 챔버 조직 슬라이서의 무대에서 무대에서 가로로 가운데 놓고 긴 가장자리 정렬에 대 한 영구 표시와 함께 표시 합니다.
   3. 조직 기계 팔에 블레이드 섹션을 로드, 블레이드 거짓말 평평 하 고 가운데는 슬라이드에는 매니큐어를 건드리지 않고 확인 다음 부드럽게 블레이드 기구를 강화 합니다. 낮은 ¼ 노브를 조정 하 여 블레이드 팔 차례, 이미징 챔버의 테스트 센터에 필터 종이의 스크랩 잘라 다음 장소. 종이 되지 극복 된다 완전히, 블레이드를 다시 탑재.
6. 10 cm 배양 접시에서 냉각된 석유 젤리의 하나의 작은 점 배치는 주사기를 사용 하 여 ~ 1.5 c m는 센터의 오른쪽에. 향하도록 하는 석유 젤리와 집게를 사용 하 여 이미징 사다리를 누릅니다. 또 다른 작은 석유 젤리 도트 만들기 ~ 이미징 챔버의 입구 가장자리에서 1 cm.
7. 석유 젤리 주사기 20 g 바늘으로 적합 하 고 그것을 벗기다. 주사기에 바늘 누른 조각화 챔버의 중앙에 세로로 두 1 cm 긴 얇은 병렬 스트립 석유 젤리의를 만들기 위해 그것을 사용 합니다. 지구 공간 ~ 1 c m 간격.
8. 중심을 포장 하 여 재사용 가능한 와이어 눈 루프 도구를 만들기는 ~ 4 cm 세그먼트의 한 쌍의 주위 30 g 텅스텐 와이어 집게 한 번 단단히 폐쇄. 때까지 zebrafish 눈 보다 약간 더 크게 일반적으로 와이어는 집게를 위아래로 슬라이딩 하 여 루프의 직경 조절 ~ 2-3 m m. 트위스트 와이어 끝 그리고 실험실 테이프를 사용 하 여 6 cm 나무 막대기의 끝에 그들을 보호.
9. 벨의 솔루션을 준비 합니다.
   1. 보충 재고 솔루션 (표 1) X 50을 해 동 하 고 실험;의 아침 신선한 HEPES-버퍼링, 비 조 벨의 솔루션 (표 2)에 추가 원뿔 원심 분리기 관 또는 무 균 병에 벨의 솔루션의 모든 10 mL에 보충 재고 솔루션의 200 µ L를 희석. 정적 이미징 실험을 위해 적어도 30 mL 실험 당 벨의 솔루션의 준비. 벨의 솔루션 관류 실험에 필요한 양의 흐름 속도 총 실험 시간에 따라 달라 집니다.
   2. 확인 보충된 솔루션의 pH 7.4 디지털 pH 프로브 또는 pH 종이 사용 하 여이 고 조정 따라와 희석 NaOH 또는 HCl.
   3. 얼음에 보충된 벨의 솔루션 표준 의료 산소 탱크와 호스를 장착 하는 레 귤 레이 터를 사용 하 여 적어도 5 분 동안 100% 산소 가스와 버블링 하 여 산소 또는 선택적 가스 bubbler 매니폴드 관류에 대 한 사용. 얼음 봉인된 원뿔 원심 분리기 관 또는 해 부 현미경; 근처 살 균 유리병에 산소 벨의 솔루션을 저장 이 솔루션을 사용 하 여 이미징, 해 부에 대 한 염료 또는 약리 에이전트 희석.
   4. 다른 솔루션은⁺같은 실험에 사용 되는 경우-무료 벨소리의 솔루션 (표 3), 반복 단계 1.9.1.-1.9.3.
10. 해 부 현미경, 근처 다른 도구, 마이크로-가 위, 집게, 접시를 수집 하 고 물고기 물 얼음 목욕 zebrafish 안락사에 대 한 준비.

2. 망막 조각 ( 그림 1참조)를 준비

1. 터치 응답 손실 됩니다 때까지 빨간 주변광 (만들 수 있는 RPE 스틱 더 긴밀 하 게 망막에) 빛 적응을 최소화 하기 위해 아래 작업 얼음 목욕에 침수에 의해 제 브라를 안락사, 일반적으로 1-2 분 페 트리 접시에 생선을 전송 하는 메스를 사용 하 여 cervically 탈 구 하지만 하지 물고기를 목을 벨.
2. 한쪽 눈 주위 결합 조직 완화 와이어 루프를 사용 하 고 한 손으로 루프와 부드럽게 눈 앞으로 당겨. 다른 한편으로는에서 마이크로-가 위를 사용 하 여 눈, 눈의 뒤쪽을 절단 하지 않도록 주의 복용 아래 흰색 시 신경 절단.
3. 눈 얼음, 차가운 벨의 솔루션의 페 트리 접시에 집게를 사용 하 여 전송 하 고 두 번째 눈에 대 한 반복 합니다. RPE 망막에서 제거 될 때까지 붉은 빛 또는 어둠 속에서 눈 유지.
4. 차가운 벨의 솔루션 페 트리 접시에 일반 유리 슬라이드에 한 방울에 낮은 전력 해 부 현미경 eyecups 해 부.
   1. 각 막 미세 집게와 피어스 다음 지우기, 부드럽게 제거 취 성 막과 집게와가 위는 빛 sclera. 제거 하 고 렌즈와는 공 막의 대부분을 삭제 ( 그림 1A참조), 최소한 고립 된 아이피를 처리.
   2. 지방, sclera, 그리고 검은 RPE의 작은 비트의 조각에서 아이피에 연결 된 남아 있을 수 있습니다 고 나중 망막에서 제거. 망막 분리 단계 2.4.1에서에서 RPE에서, 만약 하지 섬세 한 고립 된 망막 손상에 여분의 주의 사용 하 여 같은 단계 진행.
   3. (최대 RPE) 아래로 아이피 오픈 사이드 슬라이드에 놓고 3 분 또는 분기 한 모션에 신선한 단일에 지 면도날으로 잘라 ( 그림 1B를 참조). 높은 곡선 조직의 조각을 삭제 합니다.
5. 필터 종이에 평면 마운트 망막
   1. 벨의 솔루션 필터 종이 습식 및 슬라이드 아이피 조각 옆에 배치. 그것을 puncturing 피하기 위해 플랫 집게 그대로 젖은 필터 종이 처리할 때 사용 합니다. 필터 종이 및 조직 추운 벨의 솔루션을 추가 합니다.
   2. RPE와 위로 향하도록, 즉 위로 향하도록 하는 눈의 뒤를 가진 대뇌 각 아이피 조각 아래 필터 종이 또한 신중 하 게 각 손에 집게를 사용 하 여, 있습니다. 필터 종이의 중앙에 따라 한 줄에 아이피 조각 위치 ( 그림 1C참조). 모서리 또는 코너 근처만 잘 집게와 아이피 조각을 부드럽게 처리 합니다.
   3. 3 건조 종이 타월에 젖은 필터 종이 필터 종이에 고착 하는 망막을 하려면 배치 하향, 수 분을 심지 하지만 그나마 s 조직 되 고 건조 하 게. 필터 종이에 평평 거짓말 아이피 조각 때까지 반복 합니다. 망막, 평평 하 게 하는 데 도움이 필터 종이의 밑면에 부드러운 흡입을 적용 하지만이 단계는 필수적입니다.
6. RPE의 검은 시트 아이피 조각에 남아 있으면 미세 집게를 사용 하 여 부드럽게 껍질을 멀리 하나에서 시작 하는 조직 방울 벨의 솔루션에에서 앉아있는 동안 ( 그림 1D참조) 코너. 한다 망막 필터 종이, 반복 2.5.3에 wicking 단계 리프트. 망막은 표백된 시각적인 안료 인 핑크 나타날 수 있습니다.
7. 망막 해 부와 평면 추운 벨의 솔루션에 첫 번째 플랫 탑재 망막을 유지 필요한 경우 2.4-2.6 두 번째 눈에 대 한 단계를 설치를 반복 합니다. 조각화 절차 간소화, 하 두 망막의 한 필터 종이에 삽입할 수 있습니다. RPE 제거 되었습니다 일단 프로토콜 수 실시 일반 방 조명 아래 실험 어둠을 필요로 하지 않는 한.
8. 슬라이드에 필터 종이 놓고 떠나 단일에 지 면도날, 사각형으로 잘라 ~ 망막의 라인의 양쪽에 필터 종이 0.5 c m. 필터 종이 준비 조각화 약 실에, 집게를 사용 하 여 얇은 석유 젤리 라인으로 긴 필터 종이 가장자리를 밀어 이동한 3-4 방울 찬 벨소리 솔루션에서에서 망막을 담가 합니다.
   참고: 일부 염료, 닥터지 염료 등 최고의에 로드 됩니다 평면 마운트 부 러 뜨 리 하기 전에이 단계에서. 이러한 로드, 조직, 멀리 사악 고 조각화 챔버에 씻어. 예를 들어, C¹² 558/568 BODIPY 달아 망막 하지 얼룩 세포 막 및 포토 리셉터 외부 세그먼트 ( 그림 4A참조)에 로드 될 때 ~ 5 µ g/mL 실내 온도 (일반적으로 23-27 ° C)에서 15 분 뒤에 초과 벨의 해결책에서 세척 .
9. 조직 슬라이서 단계로 조각화 챔버를 전송, 표시 된 선 따라 긴 가장자리에 위치 하 고 보안 챔버 실험실 테이프와 함께 무대에 끝납니다. 망막 및 조각화 팔에, 부드러운 압력을 사용 하 여 필터 종이 잘라 한쪽 끝에서 시작. 첫 번째 조각 잘 렸 지 완벽 하 게, 확인 다음을 사용 하 여는 마이크로미터 잘라 ~ 400 µ m 조각.
10. 이미징 사다리를 조립 한다.
    1. 자리 단계는 영상에 인접 한 1.7에서 페 트리 접시에 썰어 망막 섹션 조각화 챔버 사다리 ( 그림 1E참조). 그 내용을 잠수함 추운 벨의 솔루션 접시를 채우십시오.
    2. 집게를 사용 하 고 조각 빠져들 유지, 부드럽게 전송 필터 종이 망막의 스트립 사다리 오른쪽 왼쪽에서 페 트리 접시를 밀어. 직접 망막을 건드리지 않도록 주의. 조각 회전 90 ° 고 필터 종이 가장자리 석유 젤리에 매장.
    3. 정밀 하 게 위치 망막 조각 사다리에 집게와 망막 레이어 해 부 현미경 아래에서 명확 하 게 볼 수 있습니다 ( 그림 1G참조). 사다리의 각 끝에 조각, 사출 또는 흐름 동안 조직의 움직임을 최소화 하기 위해 다른 조각으로 조직 안으로 직면 확인 합니다. 잘 되지 않은 어떤 망막 분할 영역 삭제 필터 종이 준수 ( 그림 2A참조).
11. 원하는 경우이 단계에서 망막 조각으로 염료를 로드 하 고 영상 전에 초과 벨의 솔루션에 씻어.
    참고: Propidium 요오드 화물 (PI) 및 Hoechst 33342 튼튼하게 얼룩 죽 및 모든 세포의 핵 각각 ( 그림 2B참조), 실 온에서 20 분 동안 5 µ g/mL에서 망막 조각으로 알을 품을 때. Tetramethylrhodamine (TMRM)에 축적 되어 적극적으로 호흡 미토 콘 드리 아의 1 알을 품을 때 망막에 걸쳐 실 온에서 30 분 동안 nM.
12. 슬라이스는 착 색 하는 동안 이미징 챔버 및 사출 장치를 준비 합니다. 주사기를 사용 하 여 벨의 솔루션 튜브 및 거품 제거, 이미징 챔버 입구 배관의 오픈 엔드 연결할 플러시하고 닫는 자 지. 주사기와 주입, reagent(s) 그것을 채울 다음 튜브를 다시 연결.
13. 집게를 사용 하 여 이미징 챔버의 입구 가장자리 근처 석유 젤리의 도트에는 coverslip 누르면 이미징 챔버에 망막 조각과 coverslip 전송 ( 그림 1 H참조). 분할 영역을 커버 하 벨의 솔루션과 이미징 챔버를 채우십시오.

3. 이미징 망막 조각

1. 똑바로 confocal 현미경 렌즈를 담그고 20 또는 40 X 물 장착의 단계에 연결 된 주입 기구와 이미징 채워진된 챔버를 놓습니다. 보안 단계 클립 이미징 챔버.
2. 찍기 렌즈, 사다리에 낮은 고 희미 한 트랜스 조명 빛 아래 사다리의 한쪽 끝에 조각에 집중 한다. 각 조각 가로 방향, 포토 리셉터 외부 세그먼트 및 필터 종이에 안전한 접착의 존재를 검사 합니다.
3. 시간 경과 영상에 대 한 최고의 선택 하 고 시간 경과 이미지 수집을 위한 현미경 소프트웨어를 구성 합니다. 표 4 는 다양 한 형광 마커 및 염료에 대 한 일반적인 이미지 설정을 설명합니다.
   참고: 이미지 수집의 속도 현미경, 형광 marker(s), 공부 되 고 생물 학적 과정에 따라 달라 집니다. 예를 들어, GCaMP3와 붉은 염료 대뇌에서 칼슘 역학 이미징에 대 한 800 x 800 픽셀 해상도, 2 µs/픽셀 스캔 속도, 및 10-s 프레임 속도 사용 합니다.
   1. 사용 가능한 경우 슬라이스 (포토 리셉터 외부 세그먼트, 셀 시체, 핵) 시간 경과 하는 동안 잠재적인 재교육 지원에 물리적 랜드마크를 추적 하는 소프트웨어를 사용 합니다. 또한 조각에 걸쳐 실시간으로 형광을 모니터링 하는 소프트웨어를 설정 합니다.
4. 이미징 시작 하 고 초기 형광을 모니터링 합니다. 조각에 걸쳐 형광 (일반적으로 2-5 분) 안에 안정화, 실험으로 진행. 주입, 주사기 자 지, 다음 천천히 우울 열고 혼합 지원을 두 번 플런저에 다시 그립니다.
   참고: 예를 들어, protonophore 이미징 챔버에 1 µ M의 최종 농도 도달 하는 CCCP의 집중된 솔루션을 주입 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 폐지. 이는 강력한 캘리포니아^{2 +} GCaMP에 의해 보고 된 포토 리셉터 cytosol에서 버스트 다음 TMRM에 의해 보고 된 미토 콘 드리 아 막 잠재력에 있는 꾸준한 감소를 유도 합니다.
5. 밀접 하 게, 실험 기간 동안 드리프트에 대 한 슬라이스를 모니터링 하 고 소프트웨어를 사용 하 여 실제 건축물에 따라 마이크로 조정. 일반적으로 주입 하는 동안 Z-방향으로 드리프트 또는 관류는 < 5 µ m.

4. 관류 실험 솔루션 변경 또는 지속적으로 흘러 어디 동안 망막 조각 이미징

참고: 망막 이미징 관류 실험 동안 조각 솔루션은 변경 또는 지속적으로 흘러 정적 이미징 또는 주입 실험, 다음 수정에 대 한 설치와 비슷합니다.

1. 석유 젤리 사다리 단계 1.4에서에서 설명한, 대신 sturdier 왁 스 사다리를 사용 하 여 망막 조각 솔루션 흐름 동안 꾸준히 개최.
   1. Unflavored 치과 왁 스의 2 개의 작은 병렬 실린더 장소 ~ 0.5 c m는 coverslip에 떨어져. 평평한 표면에 엄지 손가락을 사용 하 여 누릅니다 각 실린더는 coverslip의 병렬 가장자리 쪽으로. 둘 다 점수 #1 coverslip 가로로 병합 된 실린더 다음 주걱으로 왁 스 스트립 사이 석유 젤리의 얇은 층을 얼룩 ( 그림 1E, 오른쪽 참조).
   2. 2.10.2 단계에서 이미징 사다리를 어셈블할 때 좋은 집게 (그림 1G)을 사용 하 여 왁 스 점수에 슬라이스 필터 종이 가장자리를 누릅니다.
2. 단계 2.12에서에서 관류에 대 한 설정, preoxygenated 솔루션, 주사기 저수지를 작성 하거나 선택적 가스 매니폴드를 사용 하 여 산소 각 저수지에 솔루션을 합니다. 플러시 벨의 솔루션, 모든 튜브 확인 모든 라인 흐름을 열었을 때 큰 거품을 제거 합니다.
3. 단계 2.13에서에서 이미징 챔버를 작성 하기 전에 주사기 사용 하 여 흐름 중 옆으로 미끄러지기에서 그것을 방지 하기 위해 coverslip의 각 노출된 모서리에 놓고 석유 젤리의 다른 점.
4. 이미징 챔버 가득 현미경 스테이지에 장착 된 경우는 흡 인기 켜고 흡 인기 튜브를 연결. 벨의 솔루션의 흐름을 테스트 하 고는 micropositioner를 사용 하 여 적은 양의 액체 챔버 오버플로 전에 그려지도록는 유출 챔버를 통해 흡 인기 튜브를 놓다 (일반적으로 ~ 2 mL/min 흐름 속도 대 한 솔루션 표면 위에 1 mm). 3.4 단계에서 분할 영역을 선택 하는 동안 흐르는 벨의 솔루션을 계속.
5. 단계 3.4 관류에서에서 실험을 수행 하는 두 번째 솔루션을 여는 동안 첫 번째 솔루션의 자 지를 폐쇄 하 여 솔루션의 흐름을 전환 합니다.
   1. 예를 들어, 두 개의 주사기 저수지 벨의 솔루션 또는 Na⁺로 가득 사용 extracellular 나⁺ 이미징 상공에서 고갈-무료 솔루션 (표 3). 기준선 설정 없음⁺로 전환 후에 벨의 솔루션 흐름-무료 솔루션. 이 결과 큰 cytosolic 캘리포니아^{2 +} 포토 리셉터 외부 세그먼트 증가 셀 시체 ( 그림 4참조).
6. 중력 먹인 관류 시스템 이미징 동안 흐름 속도 상수 이므로 각 저수지에서 솔루션의 수준을 모니터링 합니다. 저수지에서 산소 솔루션 필요에 따라 위쪽 또는 지속적인 산소 가스 매니폴드와 버블링을 유지.

안정적인 위치 및 조각 가로 방향을 주입 또는 약리 에이전트의 관류와 성공적인 이미징에 열쇠입니다. 신중 하 게 검토 하 고 모든 망막 레이어는 표시 (그림 2A, 슬라이스 ii) 확인 하는 데 필요한 confocal 영상 전에 분할 영역 위치. 조각 회전 (그림 2A, 슬라이스 iii)를 약간 앞으로 하 고 외부 세그먼트의 번들 표시 됩니다 작은 조정 초점으로 원하는 망막 레이어를가지고 포 셉으로 만들어질 수 있다. 분할 영역 필터 종이에 제대로 준수 (그림 2A, 나 슬라이스) RPE 유지 또는 (그림 2A, 4 슬라이스) 시간 경과 영상에 대 한 사용할 수 없습니다.

세포 생존 능력은 중요 하 게 관찰 하는 생리 적 프로세스 비보 전; 세포 생존 능력에 얼룩 같은 propidium 요오드 화물 (PI) 연습 망막 부 러 뜨 리는 동안 세포 건강을 시험 하는 것이 좋습니다. 모든 조각 잘라 가장자리 근처에 죽은 세포는 조각으로 그들의 핵 (그림 2B, 왼쪽된 패널), 5-10 µ m 깊이 동안에 PI를 축적 됩니다, 그리고 정상적인 형태와 PI 얼룩이 지 건강 한 세포가 몇 군데 있습니다. 예를 들어 대뇌에 컷된 가장자리 아래 PI 부정적인 셀 (그림 2B, 오른쪽 패널) 틀에 박힌 편광, 길쭉한 형태 일반적으로 표시 됩니다. 대뇌 산소 벨의 솔루션에 저장 될 때 적어도 4 h에 대 한 망막 조각에 남아 있습니다.

많은 망막 세포 구조 유전자 변형 마커 및 염료;의 조합을 사용 하 여 구상 될 수 있다 더블, 트리플 형광 라벨와 함께 신선한 망막 조각의 예 confocal 이미지는 그림 3에 표시 됩니다. 핵을 기준으로 콘 포토 리셉터 바인딩과 그물 (ER)의 역학 관계를 시각화 하려면 콘 응급실17 를 타겟으로 하는 GFP를 표현 하는 유전자 변형 물고기에서 망막 조각 핵 염료 (그림 3A)와 counterstained 수 있습니다. GFP 융합 말라18 (그림 3B)를 표현 하는 유전자 변형 zebrafish에서 망막 분할 영역을 사용 하 여 말라 골격을 볼 비슷한 전략을 사용할 수 있습니다. 다른 셀 특정 발기인, 뮐러 셀 수 수 빨간 형광 단백질 tdTomato19 표시와 망막 조각 (그림 3C, 맨 위 패널)에 시각. 망막에 포도 당 통풍 관 분석 vivo에 는 형광 포도 당 아날로그 (NBDG), 세포는 망막 슬라이스21 (그림 3C, 하단 패널)에서 볼 수로 통합 된다와 구두로 gavaging 성인 zebrafish에 의해 될 수 있습니다. 이중 유전자 변형 zebrafish 여러 셀 프로세스 또는 연동, 콘의 하위 Ca2 + 역학 등 셀 형식 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 3D tdTomato mitochondrially 대상 Ca2 + 센서 (미토-GCaMP) 모든 콘22 표현 함께 긴 파장 콘2 에 표현 된 실험의이 유형에 대 한 트리플 라벨링 제도 보여줍니다. 그리고 핵 얼룩입니다.

망막 세포의 시간 경과 영상이 슬라이스 준비의 중요 한 이점은 이다. 예를 들어, 캘리포니아2 + 변동 콘 포토 리셉터 cytosol에 관찰 하 고 나중 약리 조작, 그림 4에 묘사 된 실험 동안 정량 될 수 있습니다. 그림 4A 망막 조각 표현 Ca2 + 센서 GCaMP2 (위) 또는 제어 eGFP16 (아래) 붉은 질 성 염료와 counterstained 콘 대뇌에서 보여줍니다. 이 실험은+ 은 isotonically 고갈 관류를 사용 하 여 이미징 상공에서 GCaMP (그림 4A, 맨 위 패널)에 의해 반영 cytosolic 캘리포니아2 + 외부 세그먼트와 세포 체에 대 한 큰 증가 evoking. 망막의 형광 조각 표현 캘리포니아2 +-구분 eGFP (그림 4A, 하단 패널)이이 치료에 의해 영향을 받지 않습니다. 시간 경과 영화는 격리 하 고 단일 원뿔 외부 세그먼트, 세포 기관, 및 시 냅 스 (그림 4B)에서 형광 응답 계량 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석할 수 있습니다.

표 1입니다. 50 X의 구성 요소 보충 마지막 작업 농도 및 재고 솔루션.

표 2입니다. 표준 벨의 솔루션의 구성 요소입니다.

테이블 3입니다. 나의 구성 요소+-무료 벨소리의 솔루션.

표 4입니다. 형광 표식 및 그림 2-4에서 제시 하는 염료에 대 한 이미징 조건.

그림 1입니다. 신선한 zebrafish 망막 슬라이스를 준비 하기 위한 회로도. (A)는 아이피를 멀리 해 부 그리고 렌즈 및 sclera (2.4.1 단계.) 삭제. (B) 3 조각;으로 아이피를 잘라 작은 가장자리 조각 (2.4.2 단계.)를 삭제 합니다. (C) 필터 종이 (단계 2.5.1.-2.5.2.) 쪽으로 직면 하는 내부 망막으로 아이피 조각 아래 필터 종이 끕니다. (D) 필터 종이 (단계 2.5.3.)를 통해 아래쪽으로 벨의 해결책을 심지에 종이 타월을 사용 하 여 결합 망막 다음 부드럽게 껍질 멀리 RPE 집게 (단계 2.6)와 나머지. 필터 종이를 조각화 챔버 조직 슬라이서 무대에 이동한 400 µ m 조각 잘라 (2.8 단계., 2.9.). (E) 이동 조각와 챔버와 벨의 솔루션 (2.10.1 단계.)의 페 트리 접시에 왁 스 또는 바 셀 린 사다리를 슬라이스. (F) 미세 집게를 사용 하 여 조각 빠져들을 유지 하면서 사다리를 조각화 상공에서 단일 조각을 슬라이드. (G) 회전 필터 종이 (검정) 90 °를 제거 하 고 왁 스 또는 바 셀 린 (단계 2.10.2.-2.10.3.)에 필터 종이의 가장자리를 묻어. (H) 최종 이미징 챔버의 회로도 사다리와 조각 로드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 신선한 zebrafish 망막의 예 조각 필터 종이 세포 생존 능력에 표시 적절 한 접착. (A) 석유 젤리 사다리에 신선한 망막 조각의 이미지를 명시. 분할 영역 ii 및 iii 좋은 접착 및 가로 망막 레이어를 표시합니다. 분할 영역 나 iv 상당한 RPE, 유지 또는 높은 곡선 및 필터 종이를 잘 준수 하지 및 몇 군데 수 없습니다 눈금 막대 = 200 µ m. (B) 탑-다운 Z의 몽타주 eGFP 콘 대뇌 (Tg(gnat2:eGFP)16)에서 표현 하는 유전자 변형 zebrafish에서 신선한 망막 슬라이스. Hoechst 염료 레이블 모든 핵; propidium 요오드 화물 (PI) counterstaining (왼쪽) 조각 컷된 가장자리 근처에 표시 되는 죽은 세포의 핵을 라벨. Z-스택 단계 크기 = 1 개의 µ m; 눈금 막대 = 20 µ m. 형광 이미징 조건 표 4에 설명 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3입니다. 조각의 더블 및 트리플 표시 된 비보 전 망막 유전자 변형 성인 제 브라에서 confocal 이미지 샘플. (A) 2 컬러 이미징 체계 유전자 변형 GFP 채용 Hoechst 핵 counterstain (파란색, 아래)와 콘 (Tg(gnat2:calr-GFP)17, 위쪽)에 떠다니고 그물을 태그. (B) GFP Hoechst 핵 counterstain (파란색, 아래)와 콘 (Tg(gnat2:LifeAct-GFP)18, 위쪽)에 걸을 태그. (C)는 제 브라에서 뮐러 셀 (Tg(GFAP:tdTomato)19, 최고)를 표시 하는 RFP 먹이 콘20,21 (그린, 하단)으로 포도 당 통풍 관을 보여주는 형광 포도 당 (NBDG). (이 이미지는 Kanow, 그 외 의 그림 2B 에서 21) (D) 이중 유전자 변형 제 브라를 사용 하 여 3 색 이미징의 예. 왼쪽, RFP 긴 파장 콘 대뇌 (Tg(trβ2:tdTomato)2)를 대상으로. 센터, 칼슘 바이오 센서 콘 포토 리셉터 미토 콘 드리 아 (Tg(gnat2:mito-GCaMP3)22)를 대상으로 하는 GCaMP. 바로, tdTomato (마젠타), 미토-GCaMP (녹색), 그리고 Hoechst 핵 counterstain (블루)의 이미지를 중첩. 이미지는 최대 강도 Z-계획 9 프레임 7 µ m 조직 깊이; 스케일 바 대표 10 µ m. 형광 이미징 조건 표 4에 설명 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4입니다. 캘리포니아2 + 영상 GCaMP 및 제어 eGFP와. (A)는 형광 캘리포니아2 + 바이오 센서 GCaMP (gnat2:GCaMP32, 최고) 표현 신선한 망막 슬라이스 또는 콘 대뇌에서 eGFP (아래)의 대표 이미지. 왼쪽, 기준선;에서 조각 후 나+ isotonically 트랩 대뇌에 캘리포니아2 + 트리 기반 벨의 솔루션의 관류를 사용 하 여 이미징 상공에서 고갈 되었다, 2 분 조각. 스케일 바 = 10 µ m. 형광 이미징 조건 표 4에 설명 되어 있습니다. (B) 나+ 고갈의 시간 경과 영상 중 하나의 포토 리셉터 구획 (외부 세그먼트, 세포 기관, 및 시 냅 스)의 형광 변화를 의미 한다. 조각 몇 군데 했다 모든 10의 ImageJ를 사용 하 여 스택 처리 및 GCaMP 또는 eGFP의 형광 막 염료에서 신호를 표준화 했다. 실선, GCaMP (외부 세그먼트에 대 한 n = 15, 셀 시체 = 24, 시 냅 스 = 26); 파선, eGFP (외부 세그먼트에 대 한 n = 26, 셀 시체 = 20, 시 냅 스 = 31). 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.