머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

요약

우리는 치료 평가 우리 셀 라인에 머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 실험적인 치료 regimens의 현재 표준 테스트를 가능 하 게 한 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 생체 외에서 모델의 진화 설명 민감성 및 미래에 인간의 표본에서 1 차 셀에 저항.

초록

고급 및 재발 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)에 대 한 현재의 치료 옵션은 방사선 및 항 암 치료 방사선 접근 또는 수술 없이 묶습니다. 백 금 기반의 화학요법 식이요법 현재 효능 측면에서 금 표준을 동안에 대부분의 경우, 새로운 화학요법 식이요법, 즉 immunotherapy 등장 하고있다. 그러나, 응답 속도 및 치료 저항 메커니즘 중 항 암 치료 처방에 대 한 예측 하 고 제대로 이해 남아 있습니다. 항 암 치료 및 방사선 저항 메커니즘의 광범위 한 변화는 날짜를 알려져 있습니다. 이 연구는 표준화, 높은 처리량에 생체 외에서 분석 결과의 개인된 종양에 대 한 미래의 도구로 개별 환자에서 HNSCC 셀 라인의 응답 다양 한 치료 식이요법, 그리고 잘하면 1 차 셀을 평가 하기 위해 개발을 설명 합니다. 치료입니다. 분석 결과 우리의 제 3 배려 센터; HNSCC 환자에 대 한 품질 제어 표준 알고리즘에 통합 되 고 하도록 설계 되었습니다. 그러나,이 미래 연구의 대상이 될 것입니다. 기술적 타당성 실제 환자에서 종양 생 검에서 1 차 셀에 대 한 약속 같은 데. 표본은 다음 실험실으로 전송 됩니다. Biopsies는 기계적으로 따라 효소 소화에 의해 구분 됩니다. 다음 셀에 3 차원, 회전 타원 체 모양의 셀 대기업의 재현, 표준 및 자발적 형성을 촉진 하는 매우 낮은 접착 셀 문화 튜브 교양. Spheroids 다음 프로토콜과 immunotherapy 프로토콜 필요에 따라 항 암 치료 방사선에 노출 될 준비가 됩니다. 마지막 셀 생존 및 회전 타원 체 크기 치료 민감성의 지표 이며 환자 들 치료 가능성이 응답을 평가 하기 위해 미래에 고려 사항으로 얻을 수 수 있습니다. 이 모델 쪽으로 머리와 목 암 맞춤된 치료 가치, 비용 효율적인 도구 수 있습니다.

서론

머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)는 여섯 번째 가장 일반적인 암 전세계 점 막 인간 유 두 종 바이러스 (HPV) 감염 관련 pathogenesis, 대부분의 경우 과도 한 니코틴과 알콜으로 인 한 옆의 상승 부각 소비 ^1,2. 고급 단계와 재발 HNSCC에 대 한 치료 남아 공격적인 종양 침공으로 인해 도전 작은 종양 전 침략 적인 단계는 일반적으로 외과 절단, 일반적으로 자 궁 경부 림프절 절 개와 결합으로 잘 치료할 수 전이성 확산 및 저항 방사선 및 화학 요법 프로토콜^3,,45,6,7,8. 최근 연구 제안 세포 표현 형의 높은 가변성 및 순환의 하위 특성화 고 전파 종양 세포 막^9,10를 시작 했다. 고체, 균일 한 ....

프로토콜

이 원고, 즉 인간의 종양 견본의 사용에 표시 된 모든 연구는 사전 결정에서 대학 의학의 마인츠/대학 뮌헨 의료 센터 윤리 위원회의 동의 보호 됩니다. 환자는 그들의 치료 과정에서 얻은 초과 생물학 자료의 과학적인 사용에 동의 하는 국가 법률 지침에 따라 동의 주었다. 연구는 인간의 복지에 대 한 모든 기관, 국가 및 국제 지침에 따라 수행 되었습니다.

1. 머리와 도대체 편평 세포 암 종에서 종양 생 검 복용

1. 수행 일반 (propofol 및 sevoflurane, 근육 편안한 에이전트) 또는 로컬 침투 (2 %ultracaine, 아드레날린) / (xylocaine) 마 취 수술 실 또는 이비인후과 검사의 자에 표면. 표준 계기 운영 위 소화 및 호흡 관의 구두 구멍/인 두/후 두/다른 부분에서 종양 질량 시각화 하 고, 필요한 경우, 현미경.
2. 신선한 종양 생 검 암 병 변 주변에서 무딘 또는 절단 악기 가져가 라. 때문에이 지역에 풍부한 괴 사 병 변의 중심을 하지 마십시오. 얻은 조직 isotonic 나트륨 염화 물 솔루션 무 균 용기에 넣어.
3. 생 검 후 수행 hemostasis, 예를 들어필요에 따라., 바이 폴라 또는 monopolar 응고 장치 vasoconstr....

결과

우리 reproducibly 나중 Hagemann 외 에 설명 된 대로 신선한 종양 생 검에서 파생 하는 기본 인간 암 세포에서에서 독점 피 카 셀 라인을 포함 하 여 다른 셀 라인에서 먼저 단일 셀 정지에서 spheroids 생성 수 있었다 . ²⁶. 우리는 회전 타원 체 세대;에 대 한 두 가지 설립된 방법 평가 소위 교수형 되 고 두 드롭 (HD) 메서드와 매우 낮은 접착 (울 라) 메서드, 후자 더 효과적이 고 안전한 하나 되. 플레이트 처리, 무거운 진동, 그리고 균일성 ( 에서 더 많은 재현 회전 타원 체 성장 spheroids의 필연적인 손실 적은 문제 빠른 회전 타원 체 성장를 포함 하 여 HD에 비해 울 라 방법의 이점 강조 수 있었습니다. 그림 2). 유리병 당 여러 spheroids의 HD 방법에서 더 일반적 이었다. 우리는 회전 타원 체 .......

토론

우리는 세포 정지, 예비 실험, 기본 인간 종양 세포에서에서 그리고 두 셀 라인에서 재현 spheroids를 생성 하는 프로토콜을 설정할 수 있었다. 우리는 먼저 앞에서 설명한 두 가지 방법으로 평가 하 고 울 라-방법, 어디 낮은 접착 표면 배양 배지는 사용 되는 방법, 일정 한 3 차원 spheroids의 생성에 대 한 안전 하 고 더 안정적인 것을 확인. 분석 결과 읽기 (크기/위치 및 세포 생존)에 대 한 두 개의 별도 메서드를 결합해 서,이 복합 분석 결과 그룹 간의 작은 차이 식별 하기 위해 충분히 과민 하다. 이것은 나중의 통합 분석 결과 3 차 케어 센터에서 임상 경로 대 한 기술적 타당성의 증거를 향한 첫 번째 단계. 미래에, 그것은 (i) 일반적인 첫 번째 또는 두 번째-/ 제 3 라인 치료 프로토콜 (항 암 치료 시 약, 방사선)를 개별 종양 민감도 평가 하기 위해 사용 될 수 및 실험적인 치료 프로토콜, (ii) 더 신선한 표본에서 종양 세포의 특성 그리고 분자 표면 또는 세포질 패턴 치료 응답의 상관 관계.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)	Biochrom, Berlin, Germany	F 0425
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies, Paisley, UK	10500-064
penicillin/streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2212
sodium pyruvate	Biochrom, Berlin, Germany	L0473
non-essential amino acids	Biochrom, 베를린, 독일	K0293
L-Glutamine	Biochrom, 베를린, 독일	K0293
Liberase	Roche Life Sciences, Basel, Switzerland	5401127001
GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS 06-001
GravityTRAP plate	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS-01-001
ULA(Ultra-low attachment) 배양판	Corning, Corning, NY, USA	4520
기도 상피 세포 성장 배지	Promocell, Heidelberg, Germany	C-21060
암포테리신 B	Biochrom, Berlin, Germany	A 2612
기도 상피 세포 성장 배지 보충제 믹스	Promocell, Heidelberg, Germany	C39165
WST-8 테스트	Promocell, 하이델베르크, 독일	PC PK-CA705-CK04
각질 세포 SFMedium + L-Glutamine 500mL	Invitrogen	#17005-034
소 뇌하수체 추출물(BPE), 25mg	Invitrogen	#37000015
재조합 인간 상피 성장 인자 2.5 µ g	Invitrogen	#37000015
DMEM High Glucose	Invitrogen	#21068-028
페니실린 스트렙토마이신 10000U/mL 페니실린/ 10000&마이크로; g/mL 스트렙토마이신	인비트로젠	#15140-122
F12 영양 혼합물	인비트로겐	#21765-029
글루타맥스(NaCl 내 200mM L-알라닐-L-글루타민-디펩타이드)	인비트로젠	#35050087
HBSS (Ca, Mg)	Life Technologies	#14025-092	(페놀 레드 없음)
1x TrypLE Expres Enzyme	Invitrogen	#12604-013	(페놀 레드 없음)
Accutase (효소 세포 분리 솔루션)	혁신적인 세포 기술	Cat# AT104
70 µ m 팔콘 세포 여과기	BD Biosciences, USA#	352350