방법 논문

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

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⸱

DOI:

10.3791/57019

⸱

2018년 4월 9일

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

이 논문에서

요약

이 프로토콜에서 잠재 Sf9 세포로 잠재 플라스 미드의 과도 transfection에 의해 생산 이며 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 증폭. 상쾌한 덤플링 친화성 크로마토그래피에 의해 순화 하 고 ultracentrifugation에 의해 더 집중. 이 프로토콜은 생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화에 대 한 유용 합니다.

초록

잠재는 전통적으로 재조합 단백질 및 백신의 생산을 위해 사용 되었습니다. 그러나, 최근에, 잠재 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 유망한 벡터로 떠오르고 있다. 여기, 잠재 Sf9 세포의 부착 문화에 잠재 플라스 미드 DNA (bacmid)의 과도 transfection에 의해 생산 됩니다. 원하는 볼륨을 얻을 때까지 잠재 이후에 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 Sf9 셀에 확장 됩니다. 그것은 다음 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 표면에 뜨는 문화에서 정화. 바이러스 표면에 뜨는 잠재 봉투 당단백질에 대 한 상쾌한 덤플링의 선호도 때문에 잠재 입자를 바인딩하는 덤플링 열에 로드 됩니다. 열 오염 물질을 제거 하는 버퍼와 세척 하 고 높은 소금 버퍼 열에서 잠재는 eluted. eluate isotonic 소금 농도를 희석 하 고 잠재 입자는 더 ultracentrifugation를 사용 하 여 집중. 이 메서드를 사용 하 여 잠재 전염 성 입자의 25% 회복으로 최대 500-fold 집중 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 1 L 문화에서 생산 고는 잠재의 정화를 보여줍니다, 하지만 메서드 수 수 확장-최대 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 임상 등급 벡터를 생산 하기 위해 폐쇄 시스템 정지 문화.

서론

잠재는 lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9에서에서 백신 및 재조합 단백질의 생산을 위해 주로 사용 된다 재조합 Autographa californica multicapsid 핵 polyhedrosis 바이러스 (AcMNPV)를 사용 하 여 곤충 세포 1 , 2 , 3 , 4. 최근에, 그것은 유전자 치료 응용 프로그램5에 대 한 유망한 벡터로 나오고. 광범위 한 호스트 및 조직 차 있는 굴곡 운동 것으로 알려져, 무부하 및 확산 세포 감염, 비 병원 성 이며 호스트 염색체4,,56으로 통합 하지 않습니다. 또한, 잠재 미래 임상 생산1처리 폐쇄 시스템에 대 한 확장 가능 하 혈 청 무료 서 스 펜 션 문화에서 생산 수 있습니다.

잠재 입자의 순수성은 세포 독성7,,89를 최소화 하면서 효과적인 변환 달성 하기 위한 중요 합니다. 잠재는 ultracentrifugation 또는 접선 교류 여과 (TFF)는 infectivity에 제한 된 영향에 의해 집중 될 수 있습니다. 그러나,이 절차는 뿐만 아니라 바이러스 입자를 집중 하지만 또한 세포 파편과 단백질 Sf9에서 문화, 독성 생체 외에서 (개인적인 관찰) 될 수 있는 염증 또는 사용 하는 경우 면역 반응을 일으킬 수 있습니다 vivo에서. 이 문제를 방지, 바이러스 주식 집중 매우 사용 하는 경우에 특히 감염 잠재 정화 하 여 입자 오염에서 분리 해야 합니다.

여러 가지 방법은 정화 및 잠재 벡터10,,1112의 농도 대 한 보고 되었습니다. 사용 가능한 접근의 덤플링을 친화성 크로마토그래피 단백질12오염의 낮은 농도와 정화의 한 단계 높은 수준의 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 잠재13,14에 대 한 수용 체로 heparan 황산 염의 식별을 기반으로 합니다. 열 및 잠재의 바인딩 Sf9 셀 상쾌한 로드, 후 열 생리 (isotonic) 버퍼 언바운드 또는 바운드 느슨하게 오염 입자를 제거 하 세척 될 수 있다. 헤 파 린에 바인딩이 되돌릴 수 있기 때문에, 잠재 입자 삼투성 충격12비활성화를 방지 하기 위해 생리 (isotonic) 소금 농도를 즉시 희석 한 높은 소금 버퍼 eluted 수 있습니다. 또한,에 캡처 뿐만 아니라 잠재, 생산 및 차입 크로마토그래피 열에서 수행할 수 있습니다 현재 좋은 제조 관행 (cGMP)와 호환이 되는 폐쇄 시스템 프로세스를 사용 하 여.

여기, 우리는 제조, 정화, 및 전염 성 잠재 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 원심 분리의 농도 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 짧게, 우리 Sf9 부착 문화에 잠재 플라스 미드 DNA와 세포의 transfection에 의해 잠재를 생산 하 고 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 전염 성 잠재 확장. 우리는 잠재 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 정화 하 고 마지막 단계로 서 ultracentrifugation를 사용 하 여 높은 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 벡터를 집중.

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프로토콜

프로토콜 요약을 그림 1 을 참조 하십시오.

1입니다. 잠재 플라스 미드 DNA의 정화

  1. Baculoviral 플라스 미드 DNA (bacmid)14 파운드 항생제; 국물의 200 ml에서를 포함 하는 세균성 문화를 성장 대 (50 µ g/mL), 항생물질 (10 µ g/mL), 그리고 gentamycin (7 µ g/mL), 300 rpm에서 궤도 통 설정에서 37 ° C에서 16 h.
  2. 표준 알칼리 성 세포의 용 해 프로토콜15를 사용 하 여 세균성 문화에서 bacmid DNA를 정화 하 고 해산 테 버퍼에 bacmid.

2입니다. 잠재 생산

  1. 135 rpm와 폴 리 카보 네이트 혈 청-무료 곤충 배양1,2,3를 포함 하는 삼각 플라스 크에에서 28 ° C에서 궤도 흔드는 인큐베이터에 문화 Sf9 셀.
    참고: Sf9 세포는 냉동된 재고에서 동 하는 경우 최소 2 주 회복 하 고 성장의 지 수 단계를 입력 셀에 대 한 수 있습니다.
  2. Trypan 파랑 얼룩 후 한 hemocytometer 성장 지 수 단계에서 수확 Sf9 셀을 계산 합니다. 씨앗 1 x 106 가능한 Sf9 셀 중간의 2 개 mL 6 잘 조직 문화 취급 접시에 잘 당. 셀 인큐베이터에서 28 ° C에서 1 시간에 대 한 연결을 허용 합니다.
  3. 혈 청 무료 unsupplemented 그레이스의 곤충 문화 매체의 1 mL에 성장 매체를 바꿉니다.
  4. 곤충 세포 transfection 시 약을 사용 하 여 Sf9 세포로 DNA bacmid transfect
    1. 그레이스의 곤충 매체의 100 µ L 혼합 8 µ L 곤충 세포 transfection 시
    2. Bacmid DNA unsupplemented 곤충 매체의 100 µ L로의 2 µ g을 희석 하 고 vortexing에 의해 부드럽게 혼합.
    3. 희석된 곤충 세포 transfection 시 약 희석된 DNA를 결합 하 고 부드럽게 혼합. 실 온에서 15 ~ 30 분 동안 품 어.
    4. 셀에 dropwise DNA 지질 혼합물을 추가 합니다. 약 5 h 인큐베이터에서 28 ° C에서 품 어.
  5. 셀에서 transfection 혼합물을 제거 하 고 세척 2 mL PBS의 셀.
  6. 곤충 문화 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 미디어를 변경 하지 않고 문화 인큐베이터에서 28 ° C에서 진행 합니다.
    참고: 경우는 bacmid 형광 단백질을 포함, 그 식 셀 48 h 후 transfection에 검색할 수 있습니다. 잠재 transfected Sf9 세포에 의해 생산 이며 문화 매체는 이후 untransfected 세포를 감염으로 분 비 합니다. 전체 셀 인구 5 일에 잠재 감염 되 고 cytopathic 효과 라고도 하는 바이러스 성 감염의 흔적을 보여줍니다. 이러한 증가 세포 직경, 그들/과 립 세포질, 세포 성장 정지에 죽거나 lysed 세포는 세포 배양에 있습니다. 그러나, transfection 또는 감염 효율 최적 하지 않으면 문화는 분명 cytopathic 효과 표시 되지 않을 수 있습니다. Cytopathic 효과 200-400 X 배율에서 거꾸로 위상 현미경으로 구상 될 수 있다. 잠재 감염 셀 안티 gp64 항 체11얼룩에 의해 감지할 수 있습니다.
  7. 수확 잠재 표면에 뜨는 5 일 후 transfection 그리고 라벨 P1 바이러스 재고.
  8. PBS에는 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 함께 어둠 속에서 빛에 민감한, 표면에 뜨는, 잠재를 저장 합니다. 또는 장기-80 ° C에서 90 일 단기 (최대) 4 ° C에서 저장 합니다.
  9. 곤충 문화 매체의 10 ml에서-10cm 조직 문화 취급 접시에 종자 6 × 106 Sf9 셀. 셀에 초기 잠재 표면에 뜨는 (P1) 1 mL를 추가 합니다.
  10. 잠재 표면에 뜨는 (P2) 5번째 하루 후 감염에서 수확.
  11. 50 mL 삼각 플라스 크를 폴 리 카보 네이트는 250 mL에 곤충 문화 매체에서 현 탁 액 문화에서 Sf9 셀 (3 x 106 셀/mL)와 장소는 궤도 흔드는 인큐베이터에 플라스 크의 씨. 셀에 P2 재고의 2 개 mL를 추가 하 고 135 rpm에서 28 ° c.의 일정 한 온도 유지 하면서 흔들어
    참고: 감염 후 3 ~ 4 일 전체 Sf9 세포 인구 cytopathic 효과, 높은 titer 잠재 생산의 표시를 보여줄 것 이다.
  12. 순차적으로 증폭 하는 잠재 supernatants 원하는 볼륨 (P3P4,...) 얻을 때까지 각 후속 감염에 세포 배양의 50-fold 볼륨을 10 증가 시켜.
    참고: P3 는 감염 1 l Sf9의 500 ml는 세포 배양 감염 된 수 있습니다 표면에 뜨는; P2 잠재의 10 ~ 20 mL의 라운드 3rd P4 에 5 ~ 10 L Sf9의 세포 배양의 P3 잠재 상쾌한, 100 ~ 200 mL와 함께 감염 될 수 있는 감염의 라운드 4번째 이다. 일반적으로, Sf9 세포 3 × 106 셀/mL 혈 청-무료 곤충 문화 미디어에서에서 시드 있습니다.
  13. 1000 x g 세포 파편을 제거 하 여 소화 genomic DNA와 RNA를 37 ° C에서 2 h 50 단위/mL nuclease (250 단위 / µ L 재고)와 표면에 뜨는 잠재 치료 4 ° C에서 30 분 동안에 표면에 뜨는 잠재 원심 0.45 μ m 여과 장치를 통해 supernatants 필터링.

3입니다. 크로마토그래피 시스템의 준비

  1. 샘플 및 버퍼 라인 각 살 균 물, 1 N 수산화 나트륨, 물, 순차적으로 rinsing 하 여 크로마토그래피 시스템을 준비 하 고 50 mL/min의 선형 유량에 버퍼 (20 m m 나트륨 인산 염 버퍼 포함 150 m m 염화 나트륨, pH 7.0)을 세척.
  2. 버퍼 (5 이력서 살 균 20 m m 나트륨 인산 염 버퍼 포함 2 M 염화 나트륨, pH 7.0)을 청소 하는 열을 순차적으로 실행 하 여 준비 하는 헤 파 린 50 µ m 열 (10 × 10 cm, 7.9 mL 열 볼륨 (CV)의) 그리고 7 mL/min의 선형 흐름 속도로 이력서 워시 버퍼를 5.

4입니다. 잠재 벡터의 정화

  1. 크로마토그래피 시스템을 다음과 같이 설정:
    1. 표면에 뜨는 잠재 로드 입구 포트 로드 하는 예제를 사용 합니다.
    2. 워시 버퍼를 로드 하기 위한 버퍼 입구 포트 a 1을 사용 합니다. 워시 버퍼의 적어도 500 mL 한 병 준비 고 워시 버퍼 라인 병 합니다.
    3. 버퍼 입구 포트 a 2를 사용 하 여 로드 차입 버퍼 (20 m m 인산 나트륨 1.5 M 염화 나트륨, pH 8.0으로). 차입 버퍼의 적어도 500 mL 한 병을 준비 하 고 병으로 차입 버퍼 라인을 배치.
    4. 표면에 뜨는 열 통과 잠재를 수집 하는 분수 수집기, 워시 버퍼 및 eluted 잠재에 몇 50 mL 원뿔 튜브를 삽입 합니다.
  2. 5 7.9 mL 열 량 (CVs) 워시 버퍼 (40 mL) 7.0 mL/min의 선형 유량에서의 헤 파 린 열 equilibrate
  3. 크로마토그래피 시스템의 샘플 펌프 (입구 샘플 포트)를 사용 하 여 선형 흐름 속도 2.0 mL/min의 헤 파 린 열에 표면에 뜨는 잠재의 250 mL 로드.
  4. 자외선 (UV) 흡 광도 곡선까지 2.0 mL/min의 선형 흐름 율에 헤 파 린 열 통해 10 CVs (80 mL) 워시 버퍼의 실행 (280 nm) 기준으로 돌아왔다 고 안정 된다.
  5. 때 잠재 입자 덤플링 열에서 해리 4.0 mL/분 시계는 크로마에 단백질의 날카로운 차입 피크의 선형 유량에서 차입 버퍼의 5 CVs (40 mL) 7.9 mL 헤 파 린 열에서 잠재 입자 elute.
  6. -차입, 즉시 eluted 잠재 상쾌한 다음 원심 분리 동안 삼투성 충격에서 잠재 입자의 비활성화를 방지 하기 위해 물에 20 m m 나트륨 인산 염 버퍼를 사용 하 여 10 배 희석.
  7. 분수의 각각의 100 µ L를 저장, 잠재 상쾌한, 워시 버퍼와는 eluate 로드 하는 동안 수집 열 흐름 통해 포함 한. HT1080 정화 과정 (참조 섹션 6) 평가 하에 이러한 잠재 분수를 감염.
  8. 버퍼와 워시 버퍼를 청소 하는 열과 열을 청소. 마지막으로, 7.0 mL/min의 선형 흐름 속도로 5 이력서 살 균 20% 에탄올에 물과 열을 린스와 4 ° c.에 저장
  9. 물, 1 N 수산화 나트륨, 물로 다시와 50.0 mL/min의 선형 흐름 속도로 물에 20% 에탄올 크로마토그래피 시스템을 청소 하 고 시스템 20% 에탄올에 저장.

5입니다. 잠재의 농도

  1. 전 압력솥을 사용 하 여 원심 분리기 튜브 소독. 조직 문화 후드에서 각 ultracentrifuge 튜브를 표면에 뜨는 잠재의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 균형에 의해 튜브 무게를 측정 하 고 메 마른 PBS 가진 ultracentrifuge 튜브의 내용의 무게를 조정 합니다.
  2. Ultracentrifuge 튜브의 각 양동이 남서 32 Ti로 터의 반대에 놓습니다.
  3. 80000 × g에서 실행 하는 ultracentrifuge 4 ° c.에 90 분
  4. 조직 문화 후드에서 ultracentrifuge 튜브를 열고 aseptically 잠재 펠 릿을 제거 하지 않고 액체를 발음 합니다.
  5. 적극적으로 200 µ L 0.5% (w/vol) BSA 포함 하는 PBS와 아래로 pipetting으로 각 튜브의 펠 릿을 resuspend.
  6. Cryovials (병 당 50 ~ 100 µ L) 집중된 잠재 전송 하 고-80 ° c.에 저장

6입니다. 잠재의 적정

  1. 감염, 전날 HT1080 세포 세포 Trypan 푸른 얼룩 후 한 hemocytometer를 사용 하 여 계산 합니다. 2 ml Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 포함 하는 6-잘 접시에 잘 당 종자 1 x 105 HT1080 세포. 감염의 시간에 세포의 정확한 수를 확인할 수 씨앗 몇 가지 추가적인 우물. 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 세포 문화.
    참고: HT1080 세포 그들은 표현 하는 다른 셀 라인16에 비해 heparan 황산 염의 더 높은 수준으로 적정 사용 됩니다. 때문에 HT1080 세포 부착, 적정은 간단 하 고 전통적인 Sf9 기반으로 적정을 사용 하 여에 비해 적은 시간이 소요.
  2. 감염의 날, 우물에서 셀을 계산 하 여 잘 당 셀의 수를 결정 합니다. 희석된 원래 잠재 되어 따로 설정 했다 열 정화, 이전 및 샘플에서 열 흐름 통해, 세척, 차입 분수를 추가 하 여 세포를 감염. 각 샘플에 대 한 희석과 실험적으로 감염 잠재 입자에 따라 볼륨을 확인 하 고 3 중에 각 잘 감염.
  3. 감염 후 2 일 관심사의 유전자의 표현에 대 한 셀을 분석 합니다. 셀 경우에 그들은 형광 성 단백질 (예: GFP)17익스프레스 교류 cytometer를 사용 하 여 분석할 수 있습니다.
  4. 계산 titers (전염 성 단위 mL 당) 감염, 희석 비율, 및 수식을 사용 하 여 셀에 형광 단백질의 백분율의 때에 존재 하는 셀의 수에 따라: (형광 단백질의 감염 × 비율 동안 셀 수 긍정적인 세포 × 희석 요인) / mL에 잠재의 볼륨.
    참고: 예를 들어 감염 시 잘 당 세포의 총 수는 1.2 × 105, 형광 단백질의 비율 5%, 희석 비율 100, 이며 추가 희석된 잠재의 볼륨은 10 µ L는 titer 인지 6 × 107 전염 성 단위 (IU) /mL입니다.

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결과

흐름 다이어그램 (그림 1)에서 제시 하는 프로토콜이입니다. 단계는 bacmid 생산 부착 문화 접시에, 혈 청 무료 정지 문화, nuclease 치료에 원심 분리와 여과, 정화 후속 증폭에 잠재 하는 DNA와 Sf9 세포의 과도 transfection를 포함 그리고 ultracentrifugation와 농도 정화 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 다음.

후 녹고, Sf9 세포 복구를 2 주 이상 필요 하 고 성장의 지 수 단계에 입력. 적극적으로 성장 하는 Sf9 세포 부착 문화에서 bacmid DNA와 페는. Transfection, 잠재 봉투 glycoproteins, 식 후 2 일 gp64 감지 되며 그 후, 잠재 생산 시작된11. 잠재 능력 복제 이...

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토론

여기에 제시 된 프로토콜 Sf9 셀 서 스 펜 션 문화에 잠재의 생산과 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 잠재의 정화에 설명 합니다. 이 프로토콜에 사용 되는 매개 변수 수익률을 극대화 하 고 잠재 감염의 비활성화를 최소화 합니다. 여기에 제공 된 프로토콜 표시 복구에 비해 잠재 입자의 크게 향상 된 복구는9다른 사람에 의해 달성 됩니다.

때문에 광범위 한 호스트 범위와 조직 차 있는 굴곡 운동, 여러 연구는 중앙 신경 조직, 간, 눈, 난소, 전립선, 그리고 잠재 중재 유전자 배달5,6,7,8 고환에서 실시 되었다 . 자살 유전자, 종양 억제 유전자, 그리고 유전자 인코딩 종양 관련 항 원을 성공적...

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공개 사항

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 시작 자금 신시내티 어린이 연구 재단 (CCRF)에서 M.N. 및 혁신적인 코어 그랜트 (ICG)에서 국립 보건원의 변환 과학 발전을 위한 국가 센터에 의해 지원에 의해 부분적으로 지원 보너스 번호 UL1 TR001425입니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Akta Avant 150GE 헬스케어28976337크로마토그래피 시스템
POROS Heparin 50 µ m 컬럼ThermoFisher Scientific4333414Heparin 컬럼
초원심분리기Beckman-Coulter비카탈로그 항목고속
폴리알로머 초원심분리기Beckman-Coulter326823고속
MaxQ 8000 오비탈 쉐이커 인큐베이터에서 바이러스 집중 ThermoFisher Scientific비카탈로그 항목현탁액 배양용 셰이커
250 mL 삼각 플라스크ThermoFisher Scientific238071현탁 배양용 플라스크
1 L 삼각 플라스크ThermoFisher Scientific238072 현탁 배양용 플라스크
현미경 (Olympus CKX41)Olympus비카탈로그 항목세포 모니터링 및 계수 
탁상용 원심분리기ThermoFisher Scientific75253839/433607바큘로바이러스 상등액
50ml 코니컬 튜브ThermoFisher Scientific14-959-49A바큘로바이러스 상등액 6웰 플레이트 채취용
ThermoFisher Scientific07-200-80조직 배양 처리 플레이트
10cm 플레이트ThermoFisher Scientific08-772E조직 배양 처리 플레이트
Stericup-HV, 0.45  &마이크로; m, PVDFEMD-Millipore SCHVU05RE여과 장치
KanamycinThermoFisher Scientific15160-054
TetracyclineSigma-AldrichT7660
GentamycinThermoFisher Scientific15750-060
Bac-to-Bac Vector KitThermoFisher Scientific10360-014Baculovirus 발현 시스템
DH10B-T1R  유능한 세포ThermoFisher Scientific12331-013바크미드 TE 완충액에 대한 유능한 세포
사내비카탈로그 항목10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Plasmid Maxiprep kitThermoFisher ScientificK2100-06바크미드 정제용
Sf9 세포ThermoFisher Scientific11496-015곤충 세포
Grace' 곤충 세포 배양 배지ThermoFisher Scientific11605-094형질 주입 배지
PBSThermoFisher Scientific20012227세포 세척, 희석 시료
HyClone SFX-곤충 세포 배지GE HealthcareSH30278.02무혈청 곤충 세포 성장 배지
Benzonase NucleaseSigma-AldrichE1014DNA와 RNA
를 분해하는 효소Baculovirus 플라스미드 (bacmid) DNA자체비카탈로그 아이템Bacmid for Baculovirus Production
Cellfectin II ThermoFisher Scientific10362곤충 세포용 트랜스펙션 시약
소 혈청 알부민(BSA)Sigma-AldrichA4737바큘로바이러스
안정화 CryovialThomas Scientific1222C24바큘로바이러스
HT1080 세포주ATCCCCL-121섬유아세포 세포주
DMEMSigma-AldrichD6429성장 저장 세포주용 배지
세척 완충액사내비카탈로그 품목150mmol/l 염화나트륨을 함유한 20mmol/l 인산염 완충
용출 완충액사내비카탈로그 품목1.5 mol/l 염화나트륨을 함유한 20mmol/l 인산염 완충액
컬럼 세척 완충액사내비카탈로그 품목2.0 mol/l 염화
나트륨을 함유한 20 mmol/l 인산염 완충액멸균수내비카탈로그 항목Akta Avant 세척
용 수산화나트륨시그마-알드리치1.09137Akta Avant 세척
에탄올시그마-알드리치E7073Akta Avant 세척용
튜브 정화용 액 사용

참고문헌

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