후 각 학습 및 쥐에 있는 차별의 객관적이 고 재현성 시험

Summary

여기, 우리는 쥐 냄새 차별 테스트는 연관 학습 작업에 기차. 이 프로토콜은 또한 두뇌에 구조적인 변화를 유도 하는 학습에 대 한 연구에 대 한 수 있습니다.

Abstract

후각이는 마우스에 주된 감각 양식 적임 이며 구하고, 약탈자 탐지, 짝짓기, 그리고 육아를 포함 하 여 많은 중요 한 동작에 영향을 미칩니다. 중요 한 것은, 쥐 후 각 회로 기능에 대 한 통찰력을 제공 하기 위해 특정 행동 응답 소설 냄새 연관 훈련 될 수 있다. 이 프로토콜 훈련 쥐 작업에 대 한 이동/노 가기 작동 학습에 대 한 절차를 자세히 설명합니다. 이 방법에서는, 마우스는 자동화 된 시험의 수백에 매일 2-4 주에 대 한 훈련과 소설 가/노 갈 냄새 쌍 후 각 차별 평가 또는 냄새 학습 구조 또는 후 각의 기능을 변경 하는 방법에 대 한 연구에 대 한 사용을 테스트할 수 있습니다. 회로입니다. 또한, 마우스 후 각 전구 (OB) 성인 선천적인 신경의 지속적인 통합을 갖추고 있습니다. 흥미롭게도, 후 각 학습 증가 생존 및 이러한 성인 선천적인 신경의 시 냅 스 연결 합니다. 따라서,이 프로토콜 다른 생화학, electrophysiological, 그리고 이미징 기술을 신경 생존 및 소성 중재 학습 및 활동-종속 요소를 공부 하 결합 될 수 있다.

Introduction

오늘, 어디 냄새 정보는 먼저 중앙 신경 시스템 (CNS)를 입력, 마우스 경험-종속 구조 변화를 연구 하는 훌륭한 모델을 제공 합니다. 산부인과 回 지속적으로 활동에 종속적으로 성인 선천적인 신경 통합합니다. 성인 선천적인 신경 선구자 창시자 帯 측면 심¹에 인접 한 줄에서 떨어져 분할. 산부인과로 마이그레이션 시 이러한 신경 선구자 생존, 분화, 및 억제과 립 세포로 통합 또는 apoptosis²를 받 다. 세포 운명에 대 한 선택 후 각 학습^3,4,,56을 포함 하 여 후 각 활동에 의해 영향을 받습니다. 통합, 후 학습 유도 시 냅 스 변화는 2 주 중요 한 기간^7,8중과 립 세포에서 발생합니다. 따라서, 후 각 학습에 대 한 분석은 어떻게 경험 종속 소성 영향 구조 및 기능 개편 성숙한 두뇌 회로의 검토 유용 합니다.

이 프로토콜 조작 컨디셔닝 패러다임을 사용 하 여 후 각 훈련 한 접근을 제공 합니다. 이 작업에서는 물 박탈 마우스 연결할 물 보상 ("가" 냄새) 한 냄새와 다른 냄새 ("노" 냄새) 시험 제한 시간 처벌 훈련 된다. 2-4 주에 걸쳐 훈련 단계의 등급된 시리즈를 통해 마우스 진행. 마우스 이동 또는 아니오인 냄새 (이동 실험에서 물 보상을 추구 하 고 노 재판에 물 보상을 추구 하지) 이산, 해당 동작에 응답 훈련 완료 되 면 (그림 1A). 교육 완료 후, 화학적으로 비슷한 냄새 쌍 쥐 더 도전 수 있습니다 차별 테스트 또는 전환 될 연구 조사 어떻게 후 각 학습 구조 또는 산부인과의 기능 변경 비록 냄새 차별 작업 이전 설명 되었습니다, 가장 두 odorants^9,10사이 킁 수 등 주관적인 측정에 의존 합니다. 또한, 인간의 이러한 작업의 점수에 대 한 필요성은 또한 시간 많이 사용. 이 프로토콜에서 설명 하는 이동/노 가기 후 각 학습 작업 냄새 차별과 후 각 학습의 편견, 직접 측정을 제공 합니다.

Protocol

모든 마우스는 NIH 표준 베일 러 대학의 약 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 프로토콜에서 사용 되었다. 이 프로토콜에서 사용 하는 마우스 했다 모든 성인 쥐 (> 나이의 6 주) C57BL6/j에 배경 및 남성 및 여성 쥐를 포함. 훈련/준비 작업 후 쥐 집 그들의 감 금 소에 반환 됩니다.

1. 건설 및 조작 학습 상자 (그림 1B, C)를 사용 하기 위한 일반 규칙

1. 마우스 챔버 챔버 바닥 조립. 낮은 트래픽, 산만 피하기 위해 어렴풋이 조명된 영역에에서 훈련 상자를 두십시오.
2. 각 물 포트 포트 안에 물을 분배 하는 18-게이지 바늘 수 있도록 상단에 작은 구멍을 드릴 합니다.
3. Odorant 미네랄 오일 (매주 교체)에 녹아 유리 유리병 채우기 하 고 안전 하 게 뚜껑을 조입니다.
4. 실리콘 튜브를 18-게이지 바늘을 연결 합니다. 18-게이지 바늘, 유리 약 병 뚜껑을 뚫 고 냄새 포트의 입구에 실리콘 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.
5. 각 실리콘 튜브를 냄새 밸브에 놓습니다.
6. 냄새 포트에 진공 라인을 연결 합니다.
7. 금속 지주 막대를 2 10 mL 주사기를 연결 하 고 주사기에 튜브를 연결. 18 G 바늘에는 튜브의 다른 쪽을 연결 합니다. 코 구멍이 포트 마우스 챔버에의 드릴된 구멍에 바늘을 맞습니다. 물 밸브 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.
8. 쥐 식 수로 두 10 mL 주사기를 채우십시오.
9. 공기 흡입구에 공기 흐름 미터를 연결 하 고 3-5 L/분의 공기 흐름을 유지 합니다.
10. 2 물 밸브, 2 냄새 밸브, 물 포트 2 개, 냄새 포트 및 전원 USB 인터페이스 시스템에 연결 합니다. 모든 밸브 '출력' 포트, '입력'에 모든 냄새와 물 포트 연결 포트. USB 인터페이스 상자에서 출력 전원을 공급 하 고 마지막으로, 전원에 연결할 USB 인터페이스 상자 모든 장비를 연결 합니다.
11. 실험 사이 냄새의 교차 오염을 방지 하는 진공 흡입을 조정 합니다.
12. 냄새 전용 튜브를 사용 하 여 챔버에 odorant 튜브를 연결.

2. 마우스 준비: 1-3 일

1. 쥐 3 그룹으로 나누어: 제어 (후 각 훈련 필요 없음), 의사 훈련된 (마우스 보상 또는 처벌을 무작위로 받을), 그리고 훈련 그룹. 교육 상자와 냄새 배달 의사 훈련된 쥐 하지만 처벌과 보상의 결과 전달 하는 악취와 임의로 연결 때문에 후 각 훈련을 제공 하지 마십시오.
   참고: 의사 훈련된 그룹 "Pseudotraining" 단계에서 교육 패러다임을 통해 갈 것입니다. 훈련 된 쥐 모든 훈련 단계를 완료 합니다. Pseudotraining 실험의 목적은 냄새 차별 또는 학습 행동 차이 대 한 시험을 하는 경우 선택 사항입니다. 여기는 실험 전과 훈련 후 신경의 차이 조사 하고자 하는 경우이 그룹을 추가 제공 하는 프로토콜. Pseudotrained 그룹은 다음 수동 냄새 노출 및 비 후 각 관련된 교육에 대 한 제어 합니다.
2. 물 제한 40 mL/kg의 쥐에서 시작/일. 고민 (그림 2A)를 피하기 위하여 bodyweight 손실을 보다 큰 동물의 기준선 체중의 20%를 하지 마십시오.
3. 그들은 초기 체중의 80% 이상 되도록 매일 쥐를 무게. 마우스가이 임계값 미만으로 떨어지면, 연구에서 마우스를 제거 하 고 물에 자유 접근을 제공.
4. 모든 환경 요인 온도, 소음, 그리고 (를 포함 하 여 개인의 신체와 향수/향수/탈취 제 향기) 길 잃은 냄새를 포함 하 여 프로토콜을 통해 지속적인 유지.
   참고: 모든 동물 행동 테스트와 마찬가지로 작은 환경 변화 수 크게 영향을 미칠 결과.

3입니다. 모든 단계에 대 한 지침

1. 아래 각 단계에 대 한 교육 소프트웨어 코드. 행동 소프트웨어에는 소프트웨어를 실행 합니다.
   참고: 모든 단계에 대 한 코딩 추가 코딩 파일에 포함 되어 있습니다. 20도 대 한 데이터 블록에 걸쳐 표시 되는 단일 블록 및 마우스 성능으로 그룹화 됩니다. 또한, 완료 조건이 충족 될 때까지 일 수에 대 한 마우스에 각 단계를 반복할 수 있습니다.
2. 60 분/일 이상에 대 한 동작 상자에서 생쥐를 유지 하지 마십시오.
3. 각 마우스는 감 금 소에 전송 되기 전에 장에서 깨끗 한 마우스 낭비. 스프레이 하 고 마우스 냄새 산만 최소화 하기 위해 70% 에탄올과 챔버를 닦아냅니다.

4. 훈련 1 단계: 연결 물 보상 센터 코 찌, 1-3 일와 함께

1. 이 단계에서 쥐 물 보상 물 포트의 탐험에 연결 합니다.
2. 훈련 1 단계 프로그래밍 지침
   1. 만 물 전달 포트를 사용 하 여이 단계를 프로그램. 각 코 찌에 대 한 물 보상을 받을 마우스를 하자.
      참고: 프로그램 재판의 지속 시간을 출력 하 고 물 총 수 보상 받은 마우스.
3. Pseudotraining 단계 1 훈련 단계 1과 같은 프로그래밍을 설정 합니다.
4. 박스 구성 및 마우스 설정
   1. 센터에서 물 포트와 액세스할 수 있는 모든 측면 포트 동작 상자를 구성 합니다. 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스 챔버를 닫고 1 단계 프로그램을 시작 합니다.
5. 이 단계를 고려할 때 마우스 달성 60 분 제거 이내 100 재판 완료 후 60 분 또는 100 재판 상공에서 마우스 완료 (그림 2B).
   참고: 개별 차이 일부 마우스는 자연스럽 게 참 상자 탐험에서.
6. 격려가 필요한 경우 수동으로 물 포트에 물을 제공 합니다. 최대 3 일 동안이 단계를 반복 합니다.
   참고: 마우스는 이미 훈련을 반복할 수 있습니다 추가 패리티를 유지 하 고 유체 제한에 그들을 유지. 그것은 또한 그룹 평균 100 재판/60 분에 도달 하면 2 단계로 전체 그룹 홍보 수입니다. 이것은 모든 마우스 같은 날 훈련을 계속 있게 됩니다.

5. 훈련 2 단계: 연결 쪽 물 보상 센터 포트 코 찌, 1-5 일

1. 이 단계에서는 마우스 센터 포트에 그들의 코를 찌를 송수신 다음 즉시 측면 포트에 물 보상 하자.
2. 박스 구성 및 마우스 설정
   1. 양쪽에 2 물 포트와 중간에 냄새 포트가 고 모든 후속 단계를 구성 합니다. 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스 챔버를 닫고 2 단계 프로그램을 시작 합니다.
3. 훈련 2 단계 프로그래밍 지침
   1. 제공 마우스는 즉시 물 보상 양쪽에 코 구멍 후 중심으로 냄새 전달 포트. 재판, 재판 시작 수 및 물 보상 5 이내 수의 기간으로이 단계에 대 한 출력 매개 변수를 설정 코 찌의 s.
4. Pseudotraining 2 단계 훈련 단계 2와 같은 프로그래밍을 설정 합니다.
5. 40 재판의 최소 60 분, 5 이내 물 보상의 25% 이상에서 수행 될 때 완전 한으로이 단계를 고려 센터 포트 코 찌의 s. 이 단계 (그림 2C) 완료 되 면 마우스를 제거 합니다.
   참고: 교육 프로그램이 단계의 완성을 결정 하기 위해 적시에 받은 물 보상의 비율을 계산 합니다. 쥐가 얼마나 빨리에 다르지만 그들은이 단계를 완료, 대부분 마우스 5 일 이내 완료 기준에 도달 한다. 그러나, 마우스 5 일 이내에이 단계를 완료 하지 는지 않습니다 하지 사전 마우스 다음 단계로. 이 마우스는 코 호트에서 제거 됩니다.

6. 훈련 3 단계: 연결 물 보상 특정 냄새와 특정 시간대, 1-3 일 이내

1. 이 단계에서 코 구멍이 시가 (나가면서) 냄새 센터 포트에서 수신 하는 쥐를 보자. 그 후, 측 물 포트 5 이내에 코 구멍이 시 물 보상을 얻을 s.
2. 훈련 3 단계 프로그래밍 지침
   1. 중앙에 나가면서 냄새 냄새 포트를 제공 합니다.
   2. 마우스 pokes 5 내의 측면 포트 경우 물 보상 제공 냄새 배달의 s.
      참고: 프로그램만 물 보상을 센터 포트에 100 ms 코 구멍을 요구 하 여 시작 합니다. 코 구멍의 기간 물 보상 50 ms에 의해 증가 필요한 면 마우스는 정확한 양의 시험의 80%에서 시간에 대 한 센터 포트를 pokes, 최대 400 ms.
   3. 출력 매개 변수 설정 2 단계와 동일 합니다.
3. 설정 pseudotraining 3 단계 프로그래밍 지침 같은 훈련 3 단계. 그러나, 나가면서 냄새 물 보상와 연결 되지 않은 되도록 냄새 배달 컨트롤러에 나가면서 냄새를 연결 하지 마십시오.
4. 박스 구성 및 마우스 설정
   1. 단계 2에서 동일한 구성을 설정 합니다.
   2. 나가면서 냄새 냄새 배달 컨트롤러에 연결 합니다. 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스 챔버를 닫고 3 단계 프로그램을 시작 합니다. 이 단계가 완료 되 면 마우스를 제거 합니다.
5. 60 분 (그림 2D) 이내 60 보상 보다 큰 경우 완료 된 것으로이 단계를 고려 하십시오.

7. 단계 4A: 아니오인 (S-) 냄새 및 제한 시간 형벌, 1-2 일 연결

1. 이 단계에서 노 냄새 (S-)에 쥐를 소개 합니다. 제대로 이동 하지 물 포트 노 냄새 냄새 후 마우스 시간 처벌을 제공 합니다.
2. 훈련 단계 4A 프로그래밍 지침
   1. 처음 3 단계와 동일에이 단계에서 나가면서 odorant만을 제공 합니다. 마우스 완전 한 40 재판 후 나가면서 및 S-냄새를 냄새의 임의의 배달을 시작 합니다. 마우스 노 냄새 제시 되 고 후 물 보상을 추구 하려고 하는 경우 2-s 시간 초과 처벌을 프로그램.
      참고: 이동 대 아니오인 구별에 투입, IR 측면 조명 조작할 수는 그들이 odorants 동안에 오프 노 odorants 동안. 불 쥐 초기 훈련에서 원조 하는 보조 큐 역할을 합니다. 일단 쥐 불 훈련, 그들은 냄새와 작업 배운 것인지 조명 없이 아래가 서 훈련을 해야 합니다.
   2. 재판, 재판 시작 수, 완료 횟수가, 정확한 % 및 보상 받은 총 수의 기간으로 출력 매개 변수를 설정 합니다.
3. 나가면서 제외 하 고 교육 단계 4S로 같은 pseudotraining 단계 4A 프로그래밍 지침을 설정 하 고 S-냄새부터에서 무작위로 표시 됩니다. 게 물 보상 또는 타임 아웃 처벌 무작위로, 작업 성능에.
4. 박스 구성 및 마우스 설정
   1. 상자 구성을 설정 같은 이전 단계 3.
   2. 나가면서와 S-냄새 냄새 배달 컨트롤러에 연결 합니다. 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스 챔버를 닫고 단계 4A 프로그램을 시작 합니다. 마우스 완전 한 40 재판 후 냄새를 무작위로 제공 하는 프로그램을 전환 합니다. 이 단계가 완료 되 면 마우스를 제거 합니다.
5. > 60% 올바른 응답 40 재판 때 완전 한으로이 단계를 고려 하십시오.

8. 단계 4B: 연결 아니오인 (S-) 냄새와 시간을 처벌, 5-11 일

1. 훈련 단계 4B 프로그래밍 지침
   1. 그러나 S 냄새 후 물 보상을 시도 위한 시간 형벌은 4이이 단계를 단계 4A, 동일 하 게 s.
2. 그러나 Pseudotraining 단계 4B 프로그래밍 지침 단계 4A, 동일 물 보상을 설정 하 고 시간을 처벌 무작위로 재판 당 전달 됩니다.
3. 박스 구성 및 마우스 설정
   1. 설정 상자 구성 같은 이전 단계 4A.
   2. 나가면서와 S-냄새 냄새 배달 컨트롤러에 연결 합니다. 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스 챔버를 닫고 단계 4B 프로그램을 시작 합니다. 있을 때이 단계를 완전 한 고려 > 정확도로 60 분 이내 100 재판 > 85% (그림 2E)
4. 이 단계에서 각 마우스의 진행 상황을 추적 하기 위해 각 세션에 대 한 올바른 최대 및 최소 백분율을 모니터링 합니다. 쥐의 대략 85-90%는이 단계에 대 한 완료 기준 도달. 이동/노 가기 테스트 단계에 대 한이 무대의 완료를 달성 하지 않는 마우스를 제외 합니다.
5. (선택 사항) 이 단계의 끝에, 이동/노 가기 odorants 냄새 유리병 플랫폼에서 전환 되는 반전 훈련을 적용 합니다. 쥐 측면 포트와 연결 된 밸브의 사운드와 같은 다른 자극으로 연결 하지는 확인 하십시오.

9. 이동/노-Go 시험 작업: 1 일, 20 분 하루 마우스 당

1. 냄새 연결을 식별 하 고 차별을 냄새 쌍 학습의 정확도 결정 하기 위해 마지막 단계는으로 이것을 고려 하십시오.
   참고: 소설 odorants은 S에 대 한 활용 + S-얼마나 동물을 테스트 하려면 새로운 협회를 배울 걸릴. 구조적으로 유사한 odorant 쌍 작업 어려움을 증가 하는 데 사용 됩니다. 1-1-Pentanol, Isoamyl 아세테이트 대 Isoamyl 낙 산 염, 대 Butanol 등 고 대-Carvone Carvone +.
2. 프로그래밍 지침
   1. 코 구멍의 길이 감지 하는 훈련 소프트웨어를 하자. 프로그램 실행 작업 센터 냄새 포트에서 300 ms 코 구멍이.
   2. 동일 단계 4B, 어떤 빛 유도 사용 하지 않는 제외 하 고 출력 매개 변수를 설정 신호.
3. 박스 구성 및 마우스 설정
   1. 설정 상자 구성 같은 이전 단계 4B.
   2. 나가면서와 S-냄새 냄새 배달 컨트롤러에 연결 합니다. 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스 챔버를 닫고 무대 이동/노 가기 프로그램을 시작 합니다. 노출 후 각 학습 작업 화학적으로 유사한 냄새의 새로운 쌍을 배운 쥐.
      참고: 적절 한 냄새 차별 Wildtype 쥐 도달 > 약 10-20 블록 또는 200-400 재판 (그림 3A) 후 소설 odorants 85% 정확도.

Results

일단 쥐 후 각 학습 작업을 배웠습니다, 그들은 지금 보상 및 처벌 소설 냄새 쌍을 연결할 수 있습니다. 이러한 훈련된 마우스는 일반적으로 약 50%로 시작 가/노 가기 작업에 정확도. 올바른 비율 시험 블록에 의해 소설 냄새 쌍(그림 3)에 대 한 학습 곡선으로 그릴 수 있습니다. 대부분의 마우스 보다는 더 적은 수행을 30 분, 10 블록 시험, 마우스 올바르게 85% 정확도 (레드 라인) 보다 더 큰와 냄새 사이 감 별 할 수 있습니다. 이 우리의 프로토콜 성공적으로 훈련 하고있다 물 보상 및 다른 제한 시간 처벌 한 냄새를 연결할 wildtype 쥐 보여준다. 두 동료 사이 차별 기능을 평가 하기 위해 이러한 데이터 추가 능력에 도달 후 정확한 평균 % 또는 85% 능력 (그림 3B)에 도달 하는 ...

Discussion

쥐 후 각 시스템 공부 감각 종속 소성 독특한 모델을 제공 합니다. 여기 우리는 보상 또는 처벌 odorant 쌍을 연결 하는 쥐를 훈련 하는 후 각 학습 패러다임 제시. 이 학습 작업을 통해 다운스트림 회로 변경 (전기 생리학, 신경 영상 vivo에서 , 등.) 후속 실험에서 공부 될 수 있다. 완료 되 면, 마우스는 다른 냄새 한 냄새, 물 보상 및 타임 아웃 처벌을 연결할 간단한 냄새 문장을된 작업을 수행 배울 것입니다.

이후이 행동 분석 결과, 연령과 성별 실험 중의 동등한 배급을 이용 하는 것이 좋습니다 하 고 동물 그룹을 제어 합니다. 그것은 절대적으로 마우스 사이의 상태를 유지 가능한 일정. 예를 들어 그 마우스 처리기와 조명 조건을 일정 하 게 유지 훈련을 통해 확인 합니다. 예상 대로 많은 마우스 작업을 수행 하지 않습니다, 경우는 다음과 같은 조건이 충족: (1) 유지 가능한 조용한 동작 설정. (2) 물 쥐를 충분히 박탈. 우리...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
유리 바이알	Qorpak	GLC-01016
실리콘 튜빙	Thermo Scientific	86000030
18 게이지 바늘	BD	305196
1-부탄올	시그마 Aldrich	437603
프로피온산	Sigma Aldrich	402907
마우스 챔버	Med Associates	ENV-307W
챔버 바닥	Med Associates	ENV-307W-GFW
물 포트	Med Associates	ENV-313W	두 개의
냄새 자극	Med Associates	ENV-275	냄새 전달을 게이트하기 위해 2개의 밸브가 포함되어 있습니다
Odor Port	Med Associates	ENV-375W-NPP
USB 인터페이스	Med Associates	DIG-703A-USB
데스크톱 컴퓨터, Windows 2000, XP, Vista 또는 7
플로우 미터	VWR	97004-952
행동 소프트웨어	Med Associates	SOF-735	각 교육 단계를 실행하는 이 소프트웨어는 이제 다음으로 대체되었습니다. Med-PC V
데이터 전송 소프트웨어	Med Associates	SOF-731	이 소프트웨어는 데이터를 Excel
교육 소프트웨어	Med Associates	DIG-703A-USB	소프트웨어는 각 교육 단계를 프로그래밍하는 데 사용됩니다
Water Valve	Neptune Research	225P012-11	이 밸브는 물 공급을 게이트하는 데 사용됩니다. 두 개의
냄새 밸브	Neptune Research	360P012-42	이 밸브는 냄새 전달을 게이트하는 데 사용됩니다. 2가 필요해